乙醇酸氧化酶（glycollicoxidase,GO）試劑盒說明書

第第頁乙醇酸氧化酶（glycollicoxidase,GO）試劑盒說明書乙醇酸氧化酶（glycollicoxidase,GO）試劑盒說明書微量法100T/96S注意：正式測定之前選擇23個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。測定意義：乙醇酸氧化酶（EC1.1.3.1）是植物光呼吸代謝中的關(guān)鍵酶，也是光下合成草酸的關(guān)鍵酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，對研究光呼吸代謝過程及其調(diào)控具有重要意義。測定原理：乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，乙醛酸和鹽酸苯肼反應(yīng)生成乙醛酸苯腙，在324nm有特征吸收峰。自備實驗用品及儀器：天平、低溫離心機、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板（UV板）。試劑組成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。試劑一：液體15mL×1瓶，4℃保存。試劑二：粉劑×1瓶，4℃避光保存，臨用前加5mL雙蒸水溶解；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復(fù)凍融。試劑三：液體2mL×1支，4℃保存。酶液提取：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。測定操作表：測定管樣本（μL）10試劑一（μL）130試劑二（μL）40試劑三（μL）20充分混勻，立即于微量石英比色皿/96孔板中測定324nm處10s和190s吸光值A(chǔ)1和A2，△A=A2A1酶活性計算公式：a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下1．按照蛋白濃度計算酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。GO活性（nmol/min/mgprot）=×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=392×△A÷Cpr2．按照樣本質(zhì)量計算酶活性定義：每克組織每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。GO活性（nmol/min/g鮮重）=×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=392×△A÷Wε：乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)：17L/mmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W，樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，3minb.用96孔板測定的計算公式如下1．按照蛋白濃度計算酶活性定義：每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。GO活性（nmol/min/mgprot）=×V反總÷（V樣×Cpr）÷T=784×△A÷Cpr2．按照樣本質(zhì)量計算酶活性定義：每克組織每分鐘氧化1nmol乙醇酸所需的酶量為一個酶活力單位。GO活性（nmol/min/g鮮重）=×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=784×△A÷Wε：乙醛酸苯腙毫摩爾消光系數(shù)：17L/mmol/cm；d：比色皿光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中