兩面針5種成分含量測(cè)定 高效液相色譜一測(cè)多評(píng)法（征求意見稿） 編制說(shuō)明

1《兩面針5種成分含量測(cè)定高效一、項(xiàng)目來(lái)源本標(biāo)準(zhǔn)由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園提出，深圳市中藥制造業(yè)創(chuàng)新中心有限公司、華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司和廣西廣林正山藥業(yè)有限公司共同參與編制，經(jīng)廣西中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)批準(zhǔn)立項(xiàng)，列入廣西中藥材產(chǎn)業(yè)協(xié)會(huì)2023年第3批團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制定項(xiàng)目計(jì)劃。二、項(xiàng)目背景和目的意義L.）木質(zhì)藤本植物兩面針（Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.）的干燥根，具有活血化瘀、行氣止痛、祛風(fēng)通絡(luò)、解毒消腫的功效，可用于跌撲損傷、胃痛、牙痛、風(fēng)濕痹痛、毒蛇咬傷及燒燙傷等。兩面針作為一味傳統(tǒng)中藥，藥用歷史悠久，效果顯著，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是三九胃泰、正骨水、金雞膠囊、兩面針牙膏等醫(yī)藥、化工產(chǎn)品的重要原料。因此，兩面針?biāo)幉诺馁|(zhì)量、臨床療效和安全性備受關(guān)注。目前《中華人民共和國(guó)藥典》（2020年版）規(guī)定兩面針?biāo)幉闹新然瘍擅驷槈A含量不得少于0.13%。但兩面針成分復(fù)雜，含有生物堿類、黃酮類、香豆素類、倍半萜類、木脂素類等多種化學(xué)成分，因此，制定一套科學(xué)、全面、高效的兩面針多種成分質(zhì)量檢測(cè)2標(biāo)準(zhǔn)顯得尤為必要。目的：一測(cè)多評(píng)技術(shù)可以在一次測(cè)定中實(shí)現(xiàn)多個(gè)成分定量分析，即降低成本又提高效率。標(biāo)準(zhǔn)編制工作組利用高效液相色譜檢測(cè)法與一測(cè)多評(píng)分析方法建立同步測(cè)定兩面針中5種成分的標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)兩面針質(zhì)量全面評(píng)價(jià)，以解決傳統(tǒng)測(cè)定方法中存在的評(píng)價(jià)指標(biāo)單一、成本高等問(wèn)題，為臨床用藥提供更加安全、有效的保障，能更好地滿足大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的需求。意義：全面評(píng)價(jià)兩面針整體藥材質(zhì)量，保障臨床用藥安全、推動(dòng)中醫(yī)藥行業(yè)健康發(fā)展，也為更多從事中醫(yī)藥研究和使用兩面針的人士提供參考依據(jù)和指導(dǎo)作用。三、項(xiàng)目編制過(guò)程（一）成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《兩面針5種成分含量測(cè)定高效液相一測(cè)多評(píng)法》項(xiàng)目任務(wù)下達(dá)后，由廣西藥用植物園牽頭，深圳市中藥制造業(yè)創(chuàng)新中心有限公司、華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司和廣西廣林正山藥業(yè)有限公司共同參與成立標(biāo)準(zhǔn)編制工作組，表1標(biāo)準(zhǔn)編制工作組人員與分工性別霞女婭女3云女德男華男江男莉女娥女勝男男洪男快男文男郎女通男（二）收集整理文獻(xiàn)資料標(biāo)準(zhǔn)編制工作組經(jīng)查閱，收集了國(guó)內(nèi)有關(guān)兩面針成分含量測(cè)定方法的相關(guān)文獻(xiàn)資料。主要有：《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版；《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》第一卷（2008年版4《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》第二冊(cè)（1996年版（三）研討確定標(biāo)準(zhǔn)主題內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)編制工作組對(duì)收集到的資料進(jìn)行整理研究后，組織召開了標(biāo)準(zhǔn)編制工作會(huì)議，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的整體框架結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析，并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵性內(nèi)容進(jìn)行了初步探討。經(jīng)工作組研究確定，標(biāo)準(zhǔn)主體內(nèi)容主要包括：術(shù)語(yǔ)和定義、原理、試劑、儀器、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算、精密度。（四）編寫標(biāo)準(zhǔn)草案及征求意見稿整合現(xiàn)有資料中有關(guān)兩面針的5種成分的檢驗(yàn)方法，按照簡(jiǎn)化、統(tǒng)一等原則編制完成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)草案及其編制說(shuō)明。標(biāo)準(zhǔn)草案編制后，標(biāo)準(zhǔn)編制工作組多次組織召開座談會(huì)后根據(jù)座談?dòng)懻撉闆r對(duì)標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行反復(fù)修改完善，最終形成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿及其編制說(shuō)明。四、標(biāo)準(zhǔn)制定原則5（一）實(shí)用性標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容符合當(dāng)前兩面針?biāo)幉馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)方法技術(shù)發(fā)展方向，滿足兩面針市場(chǎng)需求，標(biāo)準(zhǔn)條款切實(shí)可行，具有較強(qiáng)的實(shí)用性和可操作性。（二）協(xié)調(diào)性本標(biāo)準(zhǔn)編寫過(guò)程中尊重知識(shí)產(chǎn)權(quán)，同時(shí)注重做好與相關(guān)法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)的銜接，在內(nèi)容上與現(xiàn)行法律法規(guī)、強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)協(xié)調(diào)一致。（三）規(guī)范性本標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草，標(biāo)準(zhǔn)涉及的專業(yè)術(shù)語(yǔ)、方法原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、測(cè)定步驟、結(jié)果計(jì)算等內(nèi)容表達(dá)準(zhǔn)確，引用數(shù)據(jù)、檢驗(yàn)方法來(lái)源真實(shí)可靠，指標(biāo)科學(xué)、論證充分，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量有保證。（四）前瞻性本標(biāo)準(zhǔn)在充分考慮當(dāng)前中藥材市場(chǎng)需求、試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品研制及成本問(wèn)題的基礎(chǔ)上，體現(xiàn)了特色性和先進(jìn)性條款，為兩面針?biāo)幉募捌渲苿┵|(zhì)量控制研究提供技術(shù)支撐和指導(dǎo)。五、標(biāo)準(zhǔn)主要內(nèi)容及依據(jù)來(lái)源（一）術(shù)語(yǔ)和定義1、一測(cè)多評(píng)法Quantitativeanalysisofmulti-componentsbysingle-marker通過(guò)中藥有效成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系和比例關(guān)系,6通過(guò)測(cè)定中藥中某個(gè)代表性成分的含量，依據(jù)相對(duì)校正因子可計(jì)算出該中藥中其他多種待測(cè)成分的含量，使其計(jì)算值與實(shí)測(cè)值符合定量方法學(xué)要求的一種多指標(biāo)同步質(zhì)量控制方2、相對(duì)校正因子Relativecorrectionfactor是一種修正因子，它的主要作用是修正測(cè)量值，以獲得更準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，提高研究質(zhì)量，它的計(jì)算公式為某組分的絕對(duì)校正因子與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比。（二）方法原理在同時(shí)測(cè)定兩面針多個(gè)指標(biāo)質(zhì)量成分的含量時(shí)，以兩面針中典型成分氯化兩面針堿做內(nèi)參物，分別求出內(nèi)參物與木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿等其它4個(gè)待測(cè)成分間的相對(duì)校正因子，并把相對(duì)校正因子作為一個(gè)常數(shù)用于相應(yīng)成分的含量測(cè)定。（三）儀器設(shè)備Agilent1260Infinity型高效液相色譜儀（四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱，美國(guó)安捷倫公司Cary50型紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Varian公司KQ5200E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公CP225D型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius7（四）試劑鹽酸血根堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)510001-201101，純度99.3%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)111718-201402，純度80.5%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)160406，純度98.0%）購(gòu)自北京博藝匯科生物技術(shù)有限公司；木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)P11A10L85442，純度98.0%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公（五）實(shí)驗(yàn)方法AgilentEclipseC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm流動(dòng)相20%乙腈-0.1%甲酸（三乙胺調(diào)節(jié)pH至4.5體積流量1.0mL/min；柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)273、284nm；進(jìn)樣量2、制備標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密稱取氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿和白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品分別約1.25mg、5mg、5mg、1.25mg8和5mg，加70%甲醇溶解并定容至25mL，制成混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。鹽酸血根堿和白屈菜紅堿的濃度分別為0.0456mg/mL、然后從混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液中分別精確量取5、2、1、0.4mL，用70%甲醇定容至10mL，即得不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品3、供試品溶液制備收集12批次的兩面針?biāo)幉淖鳛楸狙芯康墓┰嚻罚ń?jīng)廣西藥用植物園黃寶優(yōu)高級(jí)工程師鑒定為兩面針Zanthoxylumnitidum(Roxb.)DC.的根樣品信息見表1。表1兩面針供試樣品信息精密稱定供試樣品粉末（粒徑≤0.5mm）1.0g，置于具（料液比1:6合并提取液，用70%甲醇定容至50mL容量9瓶中，最后用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試品溶液。4、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線分別吸取10μL不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次注入高效液相色譜儀，按“1”項(xiàng)的色譜條件，測(cè)定氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿和白屈菜紅堿峰面積，以峰面積（As）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（Cs）為橫坐標(biāo)，繪制氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿和白屈菜紅堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。5種標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜峰圖見表2各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線1.木蘭花堿；2.橙皮苷；3.鹽酸血根堿；4.氯化兩面針堿；5.白屈菜紅堿。圖1對(duì)照品高效液相色譜圖5、精密度試驗(yàn)精密吸取5種標(biāo)準(zhǔn)品貯備溶液，在“1”項(xiàng)的色譜條件下分別進(jìn)樣5次，測(cè)得的木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積見表3，計(jì)算得出5種成分的RSD分別為0.45%、0.21%、0.63%、0.33%、0.29%，表明儀器精密度良好。表3精密度試驗(yàn)峰面積結(jié)果分析6、穩(wěn)定性試驗(yàn)h在“1”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得的木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積見表4，計(jì)表明溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。表4穩(wěn)定性試驗(yàn)峰面積結(jié)果分析7、重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批兩面針供試品（Z2）粉末6份，分別制備供試品溶液，在“1”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、氯化兩面針堿、白屈菜紅堿含量2.36%，表明該方法重復(fù)性良好。表5重復(fù)性試驗(yàn)含量檢測(cè)結(jié)果分析(mg/g)8、加樣回收率試驗(yàn)以供試品（Z2）粉末為材料，制備供試品溶液45份，加入一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，然后在“1”項(xiàng)的色譜條件表明該方法系統(tǒng)誤差小。表6加樣回收率分析結(jié)果成分稱樣量/g/mg/mg/mg/%平均回收率/%D木蘭花堿 鹽酸血根堿氯化兩面針堿白屈菜紅堿10、外標(biāo)法測(cè)定12批次供試樣品中5種成分含量分別精密稱取12批供試品溶液吸取10μL，在“1”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定峰面積，根據(jù)“表2”的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度，然后計(jì)算含量，結(jié)果見表7。表7外標(biāo)法測(cè)定得5種成分的含量結(jié)果（mg/g）11、一測(cè)多評(píng)法檢測(cè)供試樣品中5種成分含量第一步：氯化兩面針堿較易獲得，價(jià)格低廉，而且在樣品中的含量較高，故選擇氯化兩面針堿為內(nèi)參，采用外標(biāo)法檢測(cè)12批次供試樣品中內(nèi)參的含量，結(jié)果見表7中第一列第二步：配制5種標(biāo)準(zhǔn)品的混合液，然后將母液依次稀釋成2倍液、5倍液、10倍液和25倍液。第三步：吸取5個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10μL，依次注入高效液相色譜儀，按“1”項(xiàng)的色譜條件，分別測(cè)定得出氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積As、A1、A2、A3和A4。第四步：根據(jù)氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸應(yīng)的峰面積，計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的相對(duì)校正因子f1、f2、f3、f4。計(jì)算公式如下：f1=(Cs×A1)/（C1×As）;f2=(Cs×A2)/（C2×As）;f3=(Cs×A3)/（C3×As）;四種成分的相對(duì)校正因子計(jì)算結(jié)果見表8。表8各成分的相對(duì)校正因子f1f2f3f412345第五步：在不同色譜柱下計(jì)算相對(duì)校正因子，檢驗(yàn)重復(fù)性。吸取5個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10μL，依次注入高效液相色譜儀，在“1”項(xiàng)的色譜條件下改變色譜柱，分別選擇5種不同的色譜柱（ShimadzuWondaCractODS-2、TianheKromasilC18、PhenomenexLunaC18、DalianElitehypersilBDSC18、AgilentZorbaxSB-aqC18分別測(cè)定得出氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積As、A1、A2、A3和A4，計(jì)算相對(duì)校正因子，結(jié)果見表可知該方法能滿足定量分析要求。表9不同色譜柱測(cè)定得出的相對(duì)校正因子f1f2f3f4DalianElitehypersilBD093“1”項(xiàng)的色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定氯化兩面針堿、木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的峰面積，以氯化兩面針堿為內(nèi)參，根據(jù)相對(duì)校正因子計(jì)算木蘭花堿、橙皮苷、鹽酸血根堿、白屈菜紅堿的濃度C1、C2、C3、C4。其中C1=f1×Cs計(jì)算結(jié)果見表10。表10一測(cè)多評(píng)法測(cè)定得5種成分的含量結(jié)果（mg/g）12、一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法的結(jié)果比較分別采用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法檢測(cè)得出12批