毛細(xì)管電泳法

關(guān)于毛細(xì)管電泳法第一節(jié)毛細(xì)管電泳概述第二節(jié)毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)理論第三節(jié)毛細(xì)管電泳儀第四節(jié)毛細(xì)管電泳類型第五節(jié)毛細(xì)管電泳的應(yīng)用和進(jìn)展第2頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第一節(jié)毛細(xì)管電泳概述毛細(xì)管電泳（CE），又稱高效毛細(xì)管電泳，是近年來發(fā)展最快的高效分離分析技術(shù)之一。該技術(shù)是現(xiàn)代微柱分離技術(shù)和經(jīng)典電泳技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，是氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)等常用分離技術(shù)的重要補(bǔ)充，在諸多研究領(lǐng)域得到了人們廣泛的接受和認(rèn)可。第3頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、毛細(xì)管電泳發(fā)展歷程1808年，俄國物理學(xué)家Pence發(fā)現(xiàn)電泳現(xiàn)象。1937年，瑞典Tiselius將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定,第一次從人血清提取的蛋白質(zhì)混合液中分離出白蛋白和α、β、γ球蛋白，但分離效率低；1981年，Jorgenson在75μm毛細(xì)管內(nèi)施加300V/cm的高強(qiáng)度電場，獲得了理論塔板數(shù)超過400,000plates/m的高分離效率，轟動(dòng)了整個(gè)分離界，成為CE劃時(shí)代里程碑1989年，毛細(xì)管電泳儀問世。

1989年，第一屆CE國際會(huì)議的召開，標(biāo)志著一門新的分析技術(shù)的產(chǎn)生。第4頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)(1)高效：每米理論塔扳數(shù)低則十幾萬，高則幾百萬甚至上千萬；(2)快速：可在十幾分鐘甚至幾十秒內(nèi)完成分離；(3)低樣品消耗：只需納升甚至皮升級(jí)樣品量；(4)低成本分析：只需低廉的分離毛細(xì)管和少量的運(yùn)行緩沖液；

CE是現(xiàn)代微柱分離和經(jīng)典電泳技術(shù)有機(jī)結(jié)合的產(chǎn)物，具有較HPLC和平板凝膠電泳更多的優(yōu)點(diǎn)：第5頁,共54頁，2024年2月25日，星期天(5)高度自動(dòng)化：CE是目前自動(dòng)化程度最高的分離分析方法之一；(6)潔凈：通常用水溶性緩沖液，對(duì)人體和環(huán)境無害；(7)多分離模式：可根據(jù)需要在同一儀器上選用不同的樣品分離模式；(8)應(yīng)用范圍廣：具有“萬能”分析的功能和潛力，既可以分析無機(jī)離子、氨基酸、藥物等小分子，又可以分析蛋白質(zhì)等生物大分子,甚至整個(gè)細(xì)胞和各種微粒。第6頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第二節(jié)毛細(xì)管電泳基礎(chǔ)理論+—第7頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、電泳流電泳：在電解質(zhì)溶液中，位于電場中的帶電離子在電場力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象。電泳時(shí)，不同離子在電場中具有不同的定向遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？淌度(μ）：單位電場下的電泳速度。絕對(duì)淌度：在無限稀釋溶液中測得的淌度。有效電泳淌度：在實(shí)際溶液中測得的淌度。+—第8頁,共54頁，2024年2月25日，星期天電場強(qiáng)度：與所施加的電壓成正比，與兩電極間的距離（L）成反比

E=V/L電場力：在溶液中，電場對(duì)帶電離子作用力（F）的大小等于帶電離子所帶的凈電荷（q）與電場強(qiáng)度的乘積：F=q·E在電泳遷移過程中，介質(zhì)粘滯力（F’）必然會(huì)阻礙離子的遷移。粘滯力的大小與離子大小、形狀、緩沖液粘度、甚至電泳介質(zhì)孔徑均有關(guān)系，與帶電離子的移動(dòng)速度更是直接相關(guān)。對(duì)于球形分子F’的大小服從Stokes定律：F’=6πηrνefη：緩沖液粘度；r：球形分子的半徑；νef：離子在電場中的遷移速度。第9頁,共54頁，2024年2月25日，星期天當(dāng)帶電離子以速度ν

在電場中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場驅(qū)動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用，此時(shí)F=F’故：q·E=6πηrνef則離子在電場中的遷移速度：即帶電離子的電泳遷移速率（或稱電泳淌度）:由此可知，球形帶電離子的遷移率，主要取決于自身狀態(tài)，即與其所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。電泳過程中正是利用帶電離子電泳遷移速度或遷移速率的差異來實(shí)現(xiàn)分離的。

第10頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、電滲流在高電場的作用下，帶正電荷的溶液表面及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，形成電滲流。石英毛細(xì)管柱，內(nèi)壁大約有8.31

mol/m2的硅醇基（Si-OH），其等電點(diǎn)約為1.5，內(nèi)充液pH>3時(shí)，表面電離成SiO-，管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。第11頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.CE中電滲流的大小與方向

電滲流的大小可用電滲速度和電滲淌度表示。（1）電滲流的大小電滲流的大小與電場強(qiáng)度、Zata電勢及緩沖液介電常數(shù)有關(guān)，某一電泳體系內(nèi)電滲流的具體數(shù)值可以用Helmholtz-Smoluchowski公式計(jì)算：式中，為電滲速度；為電滲淌度（EOFmobility）；為雙電層的Zeta電位；為緩沖液介電常數(shù)；η為電解液粘度；V為所施加的電壓；為毛細(xì)管總長度。第12頁,共54頁，2024年2月25日，星期天在具體實(shí)驗(yàn)中，可根據(jù)需要選用不同的中性組分作為標(biāo)記物（N,N-二甲基甲酰胺、二甲亞砜、甲酰胺、苯酚、丙酮等），測定不同緩沖條件下中性標(biāo)記物的遷移時(shí)間，按下述公式計(jì)算出電滲率：其中，t：中性標(biāo)記物的遷移時(shí)間，ldet為毛細(xì)管電泳有效長度，ltot為毛細(xì)管電泳有效長度。

第13頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（2）CE中電滲流的方向石英毛細(xì)管帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：毛細(xì)管改性：表面鍵合陽離子基團(tuán)；加電滲流反轉(zhuǎn)劑:

內(nèi)充液中加入大量的陽離子表面活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷。電滲流流向陽極。第14頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.CE中電滲流的流形液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流速最慢，管中心處的速度為平均速度的2倍（引起譜帶展寬較大）。在毛細(xì)管電泳中，電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)（譜帶展寬很?。?，故柱效較高。第15頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.CE中電滲流的作用電滲流的速度一般約等于離子電泳速度的5～7倍；各種電性粒子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：陽離子遷移速度=電滲流+電泳流，陽離子運(yùn)動(dòng)速度快于電滲流；陰離子遷移速度=電滲流–電泳流，陰離子運(yùn)動(dòng)速度慢于電滲流；中性粒子遷移速度=電滲流，中性粒子運(yùn)動(dòng)速度與電滲流一致。CE中電滲流的作用：可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的分離；改變電滲流的大小和方向可改變分離效率和選擇性電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在CE中，控制電滲流非常重要。+—第16頁,共54頁，2024年2月25日，星期天4.CE中影響電滲流的因素（1）電場強(qiáng)度的影響

電滲流速度和電場強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。（2）毛細(xì)管材料的影響

不同材料毛細(xì)管的表面電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同。第17頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（3）電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響①溶液pH的影響

對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，表面電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢增大，電滲流增大。pH在4-7之間，電滲流增大顯著；pH>8時(shí)電滲流增大速度漸緩。

當(dāng)pH<3，毛細(xì)管內(nèi)壁離解的硅醇基被氫離子中和，表面接近電中性，電滲流接近零。分析時(shí)，可采用緩沖溶液來穩(wěn)定并調(diào)控pH。第18頁,共54頁，2024年2月25日，星期天②陰離子的影響

在其它條件相同，緩沖液濃度相同而陰離子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差別，產(chǎn)生的電滲流不同。第19頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（4）溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱”；焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時(shí)，產(chǎn)生的熱量；CE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場強(qiáng)度成正比。溫度每變化1度，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；第20頁,共54頁，2024年2月25日，星期天（5）添加劑的影響加入濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小。加入表面活性劑，可改變電滲流的大小和方向；加入不同陽離子表面活性劑來控制電滲流。加入陰離子表面活性劑，如十二烷基硫酸鈉（SDS），可以使壁表面負(fù)電荷增加，zeta電勢增大，電滲流增大；加入有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。第21頁,共54頁，2024年2月25日，星期天三、CE中的參數(shù)與關(guān)系式1.遷移時(shí)間（保留時(shí)間）

CE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。Vap是表觀遷移速度；μap是表觀淌度；ldet是毛細(xì)管有效長度；ltot是毛細(xì)管總長度

2.分離效率（塔板數(shù)）

在CE中，僅存在縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt

擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的分離效率高，這是分離生物大分子的依據(jù)。第22頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.分離度第23頁,共54頁，2024年2月25日，星期天四、影響分離效率的因素—區(qū)帶展寬1.縱向擴(kuò)散的影響

在CE中，縱向擴(kuò)散引起的峰展寬：σ2=2Dt

由擴(kuò)散系數(shù)和遷移時(shí)間決定。大分子的擴(kuò)散系數(shù)小，可獲得更高的分離效率。2.進(jìn)樣的影響

當(dāng)進(jìn)樣塞長度太大時(shí)，引起的峰展寬大于縱向擴(kuò)散。分離效率明顯下降；理想情況下，進(jìn)樣塞長度：

Winj=(24Dt)1/2

實(shí)際操作時(shí)進(jìn)樣塞長度小于或等于毛細(xì)管總長度的1%～2%。第24頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.焦耳熱與溫度梯度的影響

電泳過程產(chǎn)生的焦耳熱可由下式計(jì)算：

m：電解質(zhì)溶液的摩爾電導(dǎo)；I：工作電流：cm：電解質(zhì)濃度；

散熱過程中，在毛細(xì)管內(nèi)形成溫度梯度（中心溫度高），破壞了塞流，導(dǎo)致區(qū)帶展寬。改善方法：

（1）減小毛細(xì)管內(nèi)徑；（2）控制散熱；第25頁,共54頁，2024年2月25日，星期天4.溶質(zhì)與管壁間的相互作用

蛋白質(zhì)、多肽帶電荷數(shù)多，吸附問題特別嚴(yán)重，是目前分離分析該類物質(zhì)的一大難題。

細(xì)內(nèi)徑毛細(xì)管柱，一方面有利于散熱，另一方面比表面積大，又增加了溶質(zhì)吸附的機(jī)會(huì)。減小吸附的方法和途徑：加入兩性離子代替強(qiáng)電解質(zhì)，兩性離子一端帶正電，另一端帶負(fù)電，帶正電一端與管壁負(fù)電中心作用，濃度約為溶質(zhì)的100-1000倍時(shí)，抑制對(duì)蛋白質(zhì)吸附，又不增加溶液電導(dǎo)，對(duì)電滲流影響不大。第26頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第三節(jié)毛細(xì)管電泳儀第27頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、儀器主要部件第28頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.高壓電源（1）0～30

kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；（2）具有恒壓、恒流、恒功率輸出；（3）電場強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；（4）電壓穩(wěn)定性：0.1%；（5）電源極性易轉(zhuǎn)換；第29頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.毛細(xì)管

毛細(xì)管是CE分離的心臟。理想的毛細(xì)管必須是電絕緣、紫外/可見光透明且富有彈性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛細(xì)管內(nèi)徑一般為20～100μm。第30頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4.檢測器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測；檢測器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測限/mol特點(diǎn)紫外-可見10-13～10-15

加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導(dǎo)10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；第32頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式進(jìn)樣量：毛細(xì)管長度的1%-2%；納升級(jí)、非常?。?.流體力學(xué)進(jìn)樣方式

（1）進(jìn)樣端加壓（2）出口端抽真空（3）虹吸進(jìn)樣第33頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動(dòng)進(jìn)樣方式

進(jìn)樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度大的進(jìn)樣量大；

離子丟失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進(jìn)不去；特別適合黏度大的試樣。

3.擴(kuò)散進(jìn)樣

試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入分離柱端口處。第34頁,共54頁，2024年2月25日，星期天第四節(jié)毛細(xì)管電泳類型常用的六種電泳分離模式；根據(jù)試樣性質(zhì)不同，采用不同的分離類型；每種機(jī)理的選擇性不同；第35頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

（Capillaryzoneelectrophoresis,CZE）

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；

陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反；ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類分離,同種類離子由于差速遷移被相互分離。CZE是最基本、應(yīng)用廣的分離模式；第36頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、毛細(xì)管凝膠電泳

Capillarygelelectrophoresis，CGE

將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小分離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型尖銳，分離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難分離，采用CGE能獲得良好分離，DNA排序的重要手段。特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，分離度極高。無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱便宜、易制備。第37頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.緩沖溶液中加入離子型表面活性劑，其濃度達(dá)到臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。三、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC，MEKC）

Micellarelectrokineticcapillarychromatography,MEKC

在電場力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。第38頁,共54頁，2024年2月25日，星期天2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流

>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)；5.色譜與電泳分離模式的結(jié)合。3.中性分子在膠束相和溶液（水相）間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長；4.可用來分離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍；第39頁,共54頁，2024年2月25日，星期天根據(jù)等電點(diǎn)差別分離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)（合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物），當(dāng)施加直流電壓（6～8.0kV）時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；四、毛細(xì)管等電聚焦

Capillaryisoelectricfocusing,CIEF第40頁,共54頁，2024年2月25日，星期天4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互分離；5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細(xì)管內(nèi)分離后的溶液推出經(jīng)過檢測器檢測；7.電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。第41頁,共54頁，2024年2月25日，星期天1.將兩種淌度差別很大的緩沖液分別作為前導(dǎo)離子(充滿毛細(xì)管)和尾隨離子，試樣離子的淌度全部位于兩者之間，并以同一速度移動(dòng)。2.負(fù)離子分析時(shí)，前導(dǎo)電解質(zhì)的淌度大于試樣中所有負(fù)離子的。所有試樣都按前導(dǎo)離子的速度等速向陽極前進(jìn)，逐漸形成各自獨(dú)立的區(qū)帶而分離。陰極進(jìn)樣，陽極檢測。五、毛細(xì)管等速電泳

Capillaryisotachophoresis，CITP第42頁,共54頁，2024年2月25日，星期天3.不同離子的淌度不同，所形成區(qū)帶的電場強(qiáng)度不同(ν=μE)，淌度大的離子區(qū)帶電場強(qiáng)度小。沿出口到進(jìn)口，將不同區(qū)帶依次排序1、2、3、4

電場強(qiáng)度依次增大。假設(shè)“2”號(hào)中離子擴(kuò)散到“3”號(hào)，該區(qū)電場強(qiáng)度大，離子被加速，返回到“2”區(qū)；當(dāng)“2”號(hào)中離子跑到“1”號(hào)區(qū)，離子被減速使之歸隊(duì)；4.特點(diǎn)：界面明顯，富集、濃縮作用。第43頁,共54頁，2024年2月25日，星期天

在毛細(xì)管壁上鍵合或涂漬高效液相色譜的固定液，以含有機(jī)物的緩沖液為流動(dòng)相，以電滲流為驅(qū)動(dòng)力，試樣組分在兩相間的分配為分離機(jī)理的電動(dòng)色譜過程；六、毛細(xì)管電色譜

Capillaryelectroosmosticchromatography，CEC第44頁,共54頁，2024年2月25日，星期天一、離子分析陽離子分析遷移方向和電滲流方向一致；

4.5min內(nèi)分離了24種金屬離子；陽極進(jìn)樣，陰極檢測；具有很高的靈敏度。第五節(jié)毛細(xì)管電泳的應(yīng)用與進(jìn)展第45頁,共54頁，2024年2月25日，星期天陰離子分析

陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時(shí)間長、效率低；質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO42-、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測；加入電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)分離36種陰離子；陰極進(jìn)樣，陽極檢測；離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析；第46頁,共54頁，2024年2月25日，星期天二、藥物分析

檢測體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；