第一章蛋白質(zhì)的分離與純化課件

第一章蛋白質(zhì)的分離與純化課件第一頁，共73頁2021/10/10星期日1

蛋白質(zhì)分離純化的一般原則（掌握）

分配層析的基本理論（重點掌握）

蛋白質(zhì)的層析分離技術(shù)離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等

主要掌握操作要點及操作過程的注意事項

蛋白質(zhì)的電泳分離技術(shù)

不連續(xù)系統(tǒng)原理（重點掌握）

SDS技術(shù)（重點掌握）、IEF（一般了解）

蛋白質(zhì)的濃縮（了解）第二頁，共73頁2021/10/10星期日2第一節(jié)

蛋白質(zhì)分離純化的一般原則第三頁，共73頁2021/10/10星期日3第四頁，共73頁2021/10/10星期日4第五頁，共73頁2021/10/10星期日5第六頁，共73頁2021/10/10星期日6蛋白質(zhì)純化的一般設(shè)計原則1.材料的選擇與破碎2.建立蛋白質(zhì)的活性測定方法3.分離純化應(yīng)遵循分級分離、先粗后細的原則4.分離純化條件第七頁，共73頁2021/10/10星期日7

根據(jù)實驗?zāi)康倪x擇合適的材料，應(yīng)遵循：

目的蛋白含量及生物活性盡可能高

材料來源方便、成本低、易操作

可溶性及穩(wěn)定性要盡可能好

材料的選擇第八頁，共73頁2021/10/10星期日8

注意：不同的生物體、不同生理狀態(tài)、不同組織細胞的蛋白質(zhì)含量和分布有很大差異

預(yù)處理：將不必要的結(jié)締組織、脂肪組織等在盡可能接近生命狀態(tài)下剔除，處理后應(yīng)立即使用或在冷庫中保存第九頁，共73頁2021/10/10星期日9

細胞的破碎

先要將細胞和組織破碎，使蛋白質(zhì)充分釋放出來

機械法勻漿：破碎機體軟組織最常用方法之一組織搗碎：注意維持低溫環(huán)境研磨：破碎單一細胞的有效方法，主要用于細菌、酵母等的破碎第十頁，共73頁2021/10/10星期日10

物理法

超聲法：輸入高能超聲波可以破碎細胞，破碎效率取決于聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度及細胞類型等

在處理少量樣品時操作簡便、效率高，液量損失少，適于實驗室使用

注意:超聲波產(chǎn)生自由基團和造成的溶液溫度升高，可造成敏感的活性物質(zhì)變性失活，另外噪聲也比較大第十一頁，共73頁2021/10/10星期日11

反復(fù)凍融法：由于在此過程中易使活性蛋白失活，故適用于提取非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)

冷熱交替法：絕大多數(shù)細胞被破壞，一般適用于從細菌或病毒中提取蛋白質(zhì)

低滲裂解：是指無胞壁細胞在低滲溶液中通過滲透張力作用裂解的方法，常用于紅細胞的裂解第十二頁，共73頁2021/10/10星期日12

化學(xué)法

有機溶劑法：有些有機溶劑(如苯、甲苯等)可以改變細胞壁或膜的通透性，使內(nèi)含物有選擇性的滲透出來

表面活性劑(去垢劑)：常用的有十二烷基磺酸鈉、TritonX-100、去氧膽酸鈉等

酶解法：必須根據(jù)細胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿傅谑摚?3頁2021/10/10星期日13

特異、快速、精確、可重復(fù)、經(jīng)濟

總蛋白含量

蛋白質(zhì)比活性（specificactivity）

得率第十四頁，共73頁2021/10/10星期日14

利用溶解度的差異分離

鹽析法：最經(jīng)典的方法，常用來進行粗分離

常用中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉等，其中應(yīng)用最廣的是硫酸銨

影響鹽析的因素很多，如pH、溫度、蛋白質(zhì)濃度等都會影響各種蛋白質(zhì)的鹽析點第十五頁，共73頁2021/10/10星期日15鹽析第十六頁，共73頁2021/10/10星期日16硫酸銨沉淀第十七頁，共73頁2021/10/10星期日17

有機溶劑沉淀法：有機溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，從而減少氨基酸側(cè)鏈基團的解離，降低蛋白質(zhì)分子表面電荷，使蛋白質(zhì)分子聚集導(dǎo)致溶解度的降低；另外有機溶劑與水的作用，能破壞蛋白質(zhì)的水化膜，使蛋白質(zhì)在一定濃度的有機溶劑中沉淀析出第十八頁，共73頁2021/10/10星期日18

溫度：在一定溫度范圍內(nèi)(0～40℃之間)，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加

等電點法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點pH時，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，由于相鄰蛋白質(zhì)分子之間沒有靜電斥力而趨于凝集(aggregation)和沉淀(precipitation)，它的溶解度達到最低第十九頁，共73頁2021/10/10星期日19等電點沉淀第二十頁，共73頁2021/10/10星期日20

根據(jù)分子量的不同分離

透析(dialysis)和超濾(ultrafiltration)：是利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透膜的性質(zhì)，使蛋白質(zhì)和其它小分子物質(zhì)如無機鹽、單糖、水等分開

平衡離心法：根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小、形狀不同進行分離的技術(shù)

凝膠過濾(gelfiltration)：又稱分子篩層析(molecularsievechromatography)，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物的最有效方法之一透析過程第二十一頁，共73頁2021/10/10星期日21

根據(jù)電荷的不同分離電泳區(qū)帶電泳：如醋酸纖維薄膜電泳，PAGE等

等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)

：具有更高分辨率的電泳技術(shù)

毛細管電泳(capillaryelectrophoresis,CE)

：在細孔管或毛細管中進行電泳分離。柱效高、分析時間短，所用樣品量及試劑消耗少，操作模式多，可以進行在線檢測和自動化

Agilent3DCE毛細管電泳系統(tǒng)離子交換層析

第二十二頁，共73頁2021/10/10星期日22

親和層析

親和層析法可在溫和條件下操作，純化過程簡單、快速、分辨率高，對分離含量少且性質(zhì)不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)極為有效注意：應(yīng)該盡量減少純化步驟，縮短操作時間第二十三頁，共73頁2021/10/10星期日23

目的：避免目的蛋白的變性，保證其生物活性

緩沖液(buffer)

鹽、金屬離子和螯合劑

還原劑

去垢劑

(detergent)

蛋白酶抑制劑

蛋白質(zhì)的環(huán)境因素第二十四頁，共73頁2021/10/10星期日24第二節(jié)層析的基本理論1906年M.Tswett

AdsorptionChromatography1941年MartinandSynge

PartitionChromatography

PlatetheoryRatetheory第二十五頁，共73頁2021/10/10星期日25第二十六頁，共73頁2021/10/10星期日26第二十七頁，共73頁2021/10/10星期日27

假設(shè)有兩種互不混溶的溶劑S和M，將A物質(zhì)溶于一定量的S溶劑中，再加入一定量的M溶劑

A物質(zhì)在兩相中相互擴散

A物質(zhì)在兩相中達到了平衡(在同一時間內(nèi)，進出兩相的A物質(zhì)的分子數(shù)完全相等)時，其分配系數(shù)為常數(shù)

一、分配定律CAS

分配定律表明：

一定的條件下，一定的物質(zhì)其K值不變

條件改變其K值隨之改變

K值大于1，物質(zhì)在S相中的濃度大于其在M相中濃度CAM=K第二十八頁，共73頁2021/10/10星期日28二、分配層析的機理

假設(shè)有兩種物質(zhì)，在一定的條件下，它們的分配系數(shù)K不同，則通過一根分配層析柱可以將它們分離。為了便于討論，我們做如下幾個假設(shè)：（1）層析柱可分成許多層，M是流動相，S是固定相，M和S是互不混溶（2）分配層析柱中，每一層左右相通，層與層之間互不相通，也就是說在層析柱中只有橫向擴散而無縱向擴散

分配層析柱理論塔板示意圖第二十九頁，共73頁2021/10/10星期日29（3）在分配層析柱中，溶質(zhì)在兩相中達到分配平衡的速度很快，并且A物質(zhì)的存在不影響B(tài)物質(zhì)的分配性質(zhì)，反之亦然（4）在該溶劑系統(tǒng)中，A和B兩物質(zhì)的分配系數(shù)分別設(shè)為：KA=CASCAM=1KB=CBSCBM=1/3第三十頁，共73頁2021/10/10星期日30

如果在層析開始時，在第一層的S相中同時加入A和B兩種物質(zhì)，加入的量均為1。根據(jù)分配定律，M加入后，在兩相中立刻進行分配，并且很快達到分配平衡。第一次分配前后A和B物質(zhì)在S和M相中的量為：第三十一頁，共73頁2021/10/10星期日31第三十二頁，共73頁2021/10/10星期日32第三十三頁，共73頁2021/10/10星期日33A和B物質(zhì)在層析柱中1.分配10次；2.分配20次；3.分配30次第三十四頁，共73頁2021/10/10星期日34二者之間總是存在著一定的偏差，這是因為：層析柱中總是或多或少地存在著縱向擴散層析過程不可能在絕對分配平衡的情況下進行

理論曲線和實際洗脫曲線是否相符？因此，通常實際的洗脫曲線都比理論曲線低而寬第三十五頁，共73頁2021/10/10星期日35

Martin和Synge計算了硅膠柱的理論塔板數(shù)，求得一個理論塔板的高度為0.002厘米

Verzele計算為0.02厘米

1厘米的層析柱最少有50個理論塔板，那么，在一根20厘米的層析柱上最少可以進行1000

次分配。

一根分配層析柱上到底能進行多少次分配？第三十六頁，共73頁2021/10/10星期日36塔板理論的要點：

分配層析柱象分餾柱一樣可以分成很多層，每層為一理論塔板，其高度為理論塔板高度。在一定的條件下，一根分配層析柱的理論塔板數(shù)是一定的在分配層析柱中，物質(zhì)只有橫向擴散，沒有縱向擴散，而且在兩相間達到分配平衡的速度很快體系中其他物質(zhì)的存在不影響待分離物質(zhì)的分配。待分離物質(zhì)的存在也不影響其他物質(zhì)的分配在分配層析柱上，物質(zhì)在各個理論塔板中的含量可通過計算求得三、塔板理論第三十七頁，共73頁2021/10/10星期日37第三節(jié)蛋白質(zhì)的層析分離

層析柱泵系統(tǒng)（緩沖液）檢測器（記錄儀）部分收集器液相層析的基本裝置第三十八頁，共73頁2021/10/10星期日38一、離子交換層析

(ionexchangechromatography)

原理：利用生物大分子與具有相反電荷的離子交換劑之間相互作用不同而進行的分離

類型：陰離子交換劑(anion-exchangechromatography)

陽離子交換劑(cation-exchangechromatography)

第三十九頁，共73頁2021/10/10星期日39第四十頁，共73頁2021/10/10星期日40第四十一頁，共73頁2021/10/10星期日41

樣品的準(zhǔn)備劑型的選擇離子交換劑的預(yù)處理裝柱(樣品體積的2-5倍）

柱效應(yīng)的標(biāo)定上樣洗脫

操作要點：

分步洗脫法(stepwiseelution)

梯度洗脫法(gradientelution)

目的蛋白的鑒定與回收

離子交換劑的再生與儲存離子交換層析第四十二頁，共73頁2021/10/10星期日42

原理：

利用分子篩效應(yīng)分離提純具有生物活性的生物大分子物質(zhì)二、凝膠過濾層析(gelfiltrationchromatography)

凝膠的種類：

瓊脂糖凝膠(Sepharose)

交聯(lián)葡聚糖凝膠(Sephadex)

聚丙烯酰胺基葡聚糖凝膠(Sephacryl)第四十三頁，共73頁2021/10/10星期日43第四十四頁，共73頁2021/10/10星期日44

樣品的準(zhǔn)備凝膠的選擇與處理裝柱（L:W=50-100:1）

柱填充的檢測

上樣（1%-5%)

洗脫

目的蛋白的鑒定與回收層析柱再生與儲存

操作要點：

凝膠過濾層析的應(yīng)用：

脫鹽蛋白質(zhì)分離相對分子質(zhì)量測定凝膠過濾第四十五頁，共73頁2021/10/10星期日45用途蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)純化后脫鹽蛋白質(zhì)分子量測定研究蛋白質(zhì)寡聚體第四十六頁，共73頁2021/10/10星期日46

原理：利用生物大分子與其特異性配基的專一性識別和可逆性結(jié)合而建立起來的分離方法

三、親和層析

(affinitychromatography)

改變大分子物質(zhì)與配體之間的親和力改變pH梯度

洗脫：第四十七頁，共73頁2021/10/10星期日47親和層析第四十八頁，共73頁2021/10/10星期日48四、其它層析技術(shù)高效液相層析

(HPLC)疏水作用層析

(hydrophobicinteractionchromatography)反相層析

(reversedphasechromatography)第四十九頁，共73頁2021/10/10星期日49第四節(jié)蛋白質(zhì)的電泳分析第五十頁，共73頁2021/10/10星期日50一、定義(electrophoresis)

帶電質(zhì)點或顆粒在電場作用下向著與其電性相反的方向運動需要說明以下幾點：

帶電質(zhì)點可以是帶電的膠體顆粒、離子、甚至一些非極性的物質(zhì)，只要其顆粒在膠體大小范圍，在電場中也能向其相反方向運動第五十一頁，共73頁2021/10/10星期日51

帶電質(zhì)點的凈電荷與遷移率有關(guān)，帶電性質(zhì)決定其運動方向

生物體內(nèi)的小分子，氨基酸、多肽、嘌呤、嘧啶及超過小分子的病毒、細胞器在電場中都能向與其電性相反的方向運動第五十二頁，共73頁2021/10/10星期日52三、電泳的分類

在溶液中進行的沒有支持介質(zhì)的電泳，也稱移動界面電泳(movingboundaryelectrophoresis)

自由電泳

(freeelectrophoresis)

區(qū)帶電泳(zoneelectrophoresis)

將應(yīng)用支持介質(zhì)的電泳稱為區(qū)帶電泳

另一涵義：它表示在一個電場的作用下，在某一種支持介質(zhì)上，能將一種混合物分離成若干條區(qū)帶(若干組分)的電泳過程第五十三頁，共73頁2021/10/10星期日53

是帶電的物質(zhì)，都可采用某種電泳技術(shù)，分離成不同位置的區(qū)帶，對區(qū)帶可進行定性或定量分析樣品用量少設(shè)備簡單可在室溫進行操作簡便，消耗時間不多不同類型的電泳，有不同的用途改進或找到更好的支持介質(zhì)，就有可能大大提高分辨率

區(qū)帶電泳只所以發(fā)展如此迅速，是由其本身的優(yōu)點決定的：第五十四頁，共73頁2021/10/10星期日54

任意物質(zhì)質(zhì)點，由于其本身的解離作用或由于表面上吸附有其它帶電質(zhì)點，在電場中便會向一定的電極移動四、電泳的原理蛋白質(zhì)分子：帶電的性質(zhì)和多少

pI第五十五頁，共73頁2021/10/10星期日55

指帶電質(zhì)點或顆粒在單位電場強度下的泳動速度

五、電泳的遷移率M(mobility)2.

公式：3.

影響遷移率的主要因素：

帶電顆粒的性質(zhì)：即凈電荷數(shù)量、顆粒大小及形狀1.

定義：

電場強度：指每厘米的電位降，也稱電位梯度，或電勢梯度

溶液的pH值：決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定所帶凈電荷的多少第五十六頁，共73頁2021/10/10星期日56

溶液的離子強度：影響電動電位，緩沖液離子強度越高，電動電位越小，泳動速度越慢

電滲：在電場中，由于多孔支持物吸附水中的正或負離子使溶液相對帶電，在電場作用下，溶液就向一定的方向移動第五十七頁，共73頁2021/10/10星期日57

是一種利用人工合成的凝膠作為支持介質(zhì)的區(qū)帶電方法。RaymondS和WeinfraubL在1959年最早建立此方法。后來得到OrnsteinL和DavisRJ的推薦和發(fā)展，在1964年，他們又從理論上、實驗技術(shù)上作了進一步的闡明和改進后，才被推廣使用六、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)第五十八頁，共73頁2021/10/10星期日58

機械強度好，有彈性透明，相對地化學(xué)穩(wěn)定，對

pH和溫度變化較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的沒有吸附和電滲作用.通過改變濃度和交聯(lián)度，

可以控制孔徑變化在極廣泛的范圍，并且制備凝膠的重復(fù)性好由于純度高及不溶性，還適合于少量樣品的制備，不致污染樣品1.聚丙烯酰胺凝膠的性能及制備性能：第五十九頁，共73頁2021/10/10星期日59

原料：丙烯酰胺(Acr)和亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)制備：

催化劑：引發(fā)劑（過硫酸銨,(NH4)2S2O8）加速劑（四甲基乙二胺,TEMED）

化學(xué)聚合和光聚合兩種：

凝膠濃度和交聯(lián)度：

不連續(xù)系統(tǒng)制備過程：第六十頁，共73頁2021/10/10星期日60TheseparatinggelpipettedintotheplasticcassettePreparationfortheSeparatingGel制備分離膠第六十一頁，共73頁2021/10/10星期日61Pipettingofwaterontotheseparatinggel第六十二頁，共73頁2021/10/10星期日62CreatingtheStackingGelandWellsThestackinggelispipettedontopofthepolymerizedseparatinggel制備濃縮膠第六十三頁，共73頁2021/10/10星期日63Beforethestackinggelpolymerizes,fullyinsertthecombintothetopoftheplasticcassette.

第六十四頁，共73頁2021/10/10星期日64Castingthegel第六十五頁，共73頁2021/10/10星期日65Removetheplasticcombfromthegelcassettetoexposethewells加樣第六十六頁，共73頁2021/10/10星期日66Loadingsamplesintothewells第六十七頁，共73頁2021/10/10星期日67

在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，含有三種離子，兩種不同孔徑的凝膠，兩種或兩種以上不同pH的緩沖溶液所謂不連續(xù)就是指凝膠濃度不一樣，緩沖液離子成分，pH及電位梯度不一樣