分生大實驗須知(1)課件

分子生物學綜合大實驗生物化學與分子生物學實驗教學中心課程安排時間安排實驗題目實驗室條件實驗室要求報告上交時間綠色熒光蛋白（EGFP）的基因克隆

EGFP

Enhanced

Green

Fluorescent

Protein

課程安排1．學生分組（4~5人/小組），選定組長，分配好實驗室。GFP實驗安排在第1、2、5、6、7、8實驗室進行。2．開題，學生仔細查詢研讀資料，自主設計方案，無需提交報告。3．老師講解注意事項等之后，學生按分組自主進行實驗。4.實驗分四部分：質(zhì)粒提取——PCR——連接、轉(zhuǎn)化——挑菌、提質(zhì)粒、酶切鑒定5．全部實驗結(jié)束后，完成報告。6．用學術論文的格式來完成實驗報告提交（參考學術雜志）。7．實驗報告提交地址：50/rar/實驗題目：綠色熒光蛋白（EGFP）的基因克隆技術路線：

1.獲取EGFP的基因2.克隆EGFP基因（注意：使用T克隆法，不要求表達)重組DNA技術操作過程可形象歸納為分分離目的基因切限制酶切割目的基因與載體接連接重組體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入受體細胞篩篩選重組體、轉(zhuǎn)化子重組DNA技術操作的主要步驟載體質(zhì)粒噬菌體病毒目的基因（外源基因）基因組DNAcDNA人工合成PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體DNA目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選酶切電泳鑒定菌落原位雜交

以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程切連轉(zhuǎn)篩PCRT連轉(zhuǎn)篩轉(zhuǎn)表達切連轉(zhuǎn)篩轉(zhuǎn)表達PCR鑒定實驗設計流程:實驗設計思路分---PCR分離目的基因切接---目的基因與載體相連轉(zhuǎn)---轉(zhuǎn)入宿主細胞篩---篩選陽性重組體實驗室提供條件-材料質(zhì)粒：pEGFP-N1T載體：pUCm-T菌種：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA

R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56實驗室提供條件-試劑藍白T載體（天恩澤）快速DNA連接試劑盒（碧云天）限制性內(nèi)切酶：EcoRI（Fermentas）質(zhì)粒提取試劑盒（百泰克或BioEASY）抗生素：氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等實驗室提供條件-儀器超凈工作臺，恒溫搖床，高壓滅菌鍋，恒溫培養(yǎng)箱臺式高速離心機，大容量冷凍離心機PCR儀，紫外分光光度計水平電泳槽，垂直電泳槽，電泳儀凝膠成像系統(tǒng)，制冰機、超低溫冰箱等實驗室要求進入實驗室前要經(jīng)過培訓。進出實驗室需簽名及出入時間，當日實驗結(jié)束須將物品歸位并清潔。遵守實驗室開放時間，防止無故拖延時間，影響進度。節(jié)省實驗室一切資源。試劑盒須分裝使用（如T載體、內(nèi)切酶），避免多次凍融失效。共用試劑材料須統(tǒng)一配制準備（如感受態(tài)細胞，平板培養(yǎng)基板、電泳緩沖液儲液等）節(jié)省試劑耗材（如將內(nèi)切酶做成混合液，避免多次吸取造成浪費）。實驗儀器盡量集中使用或者共用，以減少儀器設備損耗（如高壓滅菌鍋、制冰機、恒溫搖床等）。報告上交時間實驗報告提交時間：2014-7-5交電子版（每位同學一份）。電子版文件名：學號后3位-學生姓名-實驗名稱-年級專業(yè)-實驗室電子版文件上傳地址：

插入740bpDNA片段重組質(zhì)粒大小為:3038bp+74