亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座

血漿病毒滅活的必要性亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的制備亞甲藍(lán)病毒滅活的技術(shù)原理病毒滅活血漿的質(zhì)量控制亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第1頁(yè)血漿病毒滅活必要性伴隨血液檢測(cè)技術(shù)進(jìn)步和血液管理辦法完善，當(dāng)前HBsAg、抗-HCV、抗-HIV檢測(cè)在很大程度上降低了輸血造成病毒傳輸幾率，但因?yàn)?病毒變異造成免疫反應(yīng)性改變；2免疫靜默感染；3檢測(cè)技術(shù)存在窗口期漏檢不足；4檢測(cè)病原體種類局限；

輸血引發(fā)艾滋病病毒（HIV、HCV、HBV）風(fēng)險(xiǎn)尚不能完全杜絕；不常見(jiàn)病毒如人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒（HTLV）、西尼羅病毒（WNV）、EB病毒等在大多數(shù)國(guó)家均未被列入血液常規(guī)檢測(cè)?，F(xiàn)有檢測(cè)伎倆不能完全排除血漿中可能存在未知病毒。

亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第2頁(yè)

血漿制品病毒去除方法：乙醇沉淀深層過(guò)濾離子交換色譜和親和層析色譜納米膜過(guò)濾

納米膜過(guò)濾技術(shù)單一病毒滅活/去除方法即使能很好起處處理病毒效果，不過(guò)無(wú)法滅活和去除全部病毒，如細(xì)小病毒B19、VIR918、PARV4、SV40和PrPSc。主要在血漿蛋白分離工藝中應(yīng)用亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第3頁(yè)血漿病毒滅活方法有機(jī)溶劑/去污劑（S/D）法熱處理蒸汽處理法以上方法多用于從原料血漿生產(chǎn)血漿蛋白制品，均需要將大量的不同人份的血漿混合處理，不但容易增加某些不能被滅活病原體（如朊病毒prion等）的擴(kuò)散風(fēng)險(xiǎn)，且處理難度大，費(fèi)用高。亞甲藍(lán)光化學(xué)法能對(duì)單人份血漿進(jìn)行病毒滅活，適用于采供血機(jī)構(gòu)對(duì)臨床用血漿的病毒滅活處理，更適合于我國(guó)的國(guó)情和臨床實(shí)際應(yīng)用。

終端干熱法

低pH孵放法辛酸處理法亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第4頁(yè)亞甲藍(lán)病毒滅活技術(shù)原理

亞甲藍(lán)又名美藍(lán)，分子量319185，是一個(gè)光敏劑，吩噻嗪類染料，其最大吸收峰為670nm，臨床上常作為解毒劑，用于治療亞硝酸鹽中毒引發(fā)高鐵血紅蛋白血癥和氰化物中毒。亞甲藍(lán)表面攜帶正電荷，與病毒核酸結(jié)合后能夠嵌入DNA/RNA中，與病毒核酸帶負(fù)電荷G-C堿基對(duì)相結(jié)合。在有光照條件下，亞甲藍(lán)分子吸收光能后可激發(fā)產(chǎn)生單態(tài)分子氧，這種單態(tài)分子氧經(jīng)過(guò)修飾鳥(niǎo)嘌呤堿基而影響核酸，使其產(chǎn)生缺口，引發(fā)核酸鏈斷裂或造成堿基位點(diǎn)丟失，從而阻止其復(fù)制,到達(dá)滅活病毒目標(biāo)。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第5頁(yè)

與脂膜和蛋白質(zhì)結(jié)合對(duì)核酸有較高親和性亞甲藍(lán)為多靶點(diǎn)光敏劑，光照射產(chǎn)生單線態(tài)氧和羥自由基引發(fā)廣泛損傷亞甲藍(lán)可與病毒核酸與脂質(zhì)包膜相結(jié)合，在可見(jiàn)光作用下，可使病毒核酸斷裂，包膜破損，因而能殺滅包含艾滋病病毒（HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等脂質(zhì)包膜病毒和部分非脂質(zhì)包膜病毒。

對(duì)亞甲蘭光化學(xué)法病毒滅活有效性研究顯示，血漿中指示病毒滴度顯著下降，血漿中病毒含量下降了6個(gè)數(shù)量級(jí)，可能殘留病毒量低于百萬(wàn)分之一，到達(dá)了國(guó)際公認(rèn)血漿病毒滅活有效性指標(biāo)，也符合衛(wèi)生部關(guān)于血漿制品病毒滅活相關(guān)要求。

亞甲藍(lán)病毒滅活技術(shù)原理

亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第6頁(yè)美國(guó)AABB技術(shù)手冊(cè)描述了病原體滅活血漿制品，介紹了歐盟開(kāi)展三種病毒滅活方法，其中包含亞甲藍(lán)、核黃素和補(bǔ)骨脂素。但美國(guó)未開(kāi)展。歐盟指南中描述了病原體滅活FFP制品質(zhì)量要求，同時(shí)也介紹了三種方法。英國(guó)指南中明確描述了亞甲藍(lán)處理和去除FFP制品質(zhì)量要求，質(zhì)量要求中對(duì)亞甲藍(lán)殘留量要求為≤0.3umol/L

，與我們國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)一致。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第7頁(yè)1992年，德國(guó)最早將依靠該項(xiàng)技術(shù)處理的新鮮冰凍血漿應(yīng)用于臨床。90年代中期，上海血液中心開(kāi)發(fā)以熒光照射光源和配置亞甲藍(lán)去除濾器為特點(diǎn)的亞甲藍(lán)光化學(xué)血漿病毒滅活技術(shù)，隨后該項(xiàng)技術(shù)在我國(guó)被逐步推廣。2004年，世界衛(wèi)生組織將亞甲藍(lán)光化學(xué)血漿病毒滅活技術(shù)列入

“人血漿制品病毒滅活或去除指南”，

歐盟和英國(guó)也納入“輸血指南”。2007年烏魯木齊市血液中心引進(jìn)該技術(shù),截至2014年底使用亞甲藍(lán)光化學(xué)病毒滅活血漿13萬(wàn)單位以上。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第8頁(yè)一次性使用血漿病毒滅活輸血過(guò)濾器Depasse最早提出了“過(guò)濾器應(yīng)用”，極大地簡(jiǎn)化和改進(jìn)了MB-P法操作，為MB-P法由試驗(yàn)室走向臨床邁出了主要一步。當(dāng)前使用一次性使用血漿病毒滅活輸血過(guò)濾器主要由亞甲藍(lán)添加元件、光照袋、過(guò)濾器、血漿儲(chǔ)存袋和連接管路組成，是一個(gè)簡(jiǎn)便、實(shí)用血漿滅活器材。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第9頁(yè)亞甲藍(lán)作為一個(gè)外來(lái)物質(zhì)進(jìn)入人體后，對(duì)人體潛在影響尚不可知。若病毒滅活血漿中殘留過(guò)多亞甲藍(lán)，還會(huì)造成血漿外觀和色澤顯著改變，使病人輸注時(shí)可能產(chǎn)生心理負(fù)擔(dān)。在確保滅活所需有效濃度下，要盡可能降低其殘留量，因而對(duì)病毒滅活血漿中亞甲藍(lán)殘留量/率進(jìn)行控制很有必要。選擇適當(dāng)亞甲藍(lán)含量測(cè)定方法很主要。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第10頁(yè)醫(yī)用病毒滅活箱應(yīng)用當(dāng)前醫(yī)用病毒滅活箱是用于光照滅活時(shí)專用設(shè)備，它集光源、溫控、機(jī)械擺動(dòng)等裝置于一身，能夠依據(jù)需要設(shè)定照射強(qiáng)度、照射溫度、照射時(shí)間和擺動(dòng)頻率等很多條件，使用方便。光源選擇：熒光燈（1）單位時(shí)間內(nèi)照射所釋放熱量較低；（2）到達(dá)相同滅活效果照射時(shí)間最短；（3）波長(zhǎng)接600~700nm。照射方式：有效光照強(qiáng)度范圍在30000~40000lx。（1）放置血袋托盤為鋼絲結(jié)構(gòu)，有較大空隙，使血袋兩面都能夠接收照射；（2）照射過(guò)程中托盤以60±2次/分鐘頻率擺動(dòng)；（3）箱內(nèi)面為鏡面，能夠?qū)艄苤鄙涔庠春顽R面反射光源從360度全方位地照射血漿。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第11頁(yè)亞甲藍(lán)病毒滅活血漿在我國(guó)開(kāi)展近十年，各種關(guān)于病毒滅活對(duì)血漿主要成份影響情況報(bào)道可歸納為：血漿經(jīng)過(guò)MB-P法滅活后，血漿總蛋白回收率90%以上；但部分不穩(wěn)定凝血因子(Ⅴ，Ⅷ)和纖維蛋白原（Fg）改變顯著，Ⅷ因子回收率普通在80%左右。血漿免疫原性、各種電解質(zhì)、酶穩(wěn)定性等改變不顯著，PH值也未受影響。亞甲藍(lán)濃度與血漿病毒滅活效果有直接關(guān)系，只有到達(dá)一定釋放量才能起作用，但亞甲藍(lán)若殘留過(guò)多會(huì)影響血漿外觀色澤，且亞甲藍(lán)存在致突變可能性，因而必須對(duì)滅活前后亞甲藍(lán)含量進(jìn)行測(cè)。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第12頁(yè)血漿中亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)固相萃取小柱將亞甲藍(lán)從血漿中提取出。分光光度計(jì)檢測(cè)。不能直接用分光光度計(jì)測(cè)定血漿中亞甲藍(lán)含量,因?yàn)檠獫{本身為復(fù)雜混合物,含有各種蛋白,在亞甲藍(lán)最大吸光波優(yōu)點(diǎn)血漿蛋白亦有吸光,而且血漿蛋白個(gè)體差異很大,所以無(wú)法取得準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)果,要想準(zhǔn)確檢測(cè)血漿中亞甲藍(lán)含量,必須排除干擾,既將亞甲藍(lán)提取出來(lái),再進(jìn)行測(cè)定。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第13頁(yè)亞甲藍(lán)檢測(cè)依據(jù)《血站技術(shù)操作規(guī)程》年版：14附錄F血液質(zhì)量控制檢驗(yàn)方法—F.19

亞甲藍(lán)殘留量?！度俺煞菅|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》

GB18467-—5.16病毒滅活冰凍血漿質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，亞甲藍(lán)殘留量≤0.30μmol/L。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第14頁(yè)15血漿中亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)所需試驗(yàn)儀器、試劑試驗(yàn)儀器:固相萃取富集裝置及配套固相萃取耗材：推薦使用WatersOasis產(chǎn)品（）真空泵分光光度計(jì)試管離心機(jī)試劑：亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)品粉劑、甲醇、乙酸、蒸餾水其它耗材：容量瓶、移液器、試管等亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第15頁(yè)亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)原理固相萃取-分光光度法

利用固相小柱內(nèi)吸附介質(zhì)是一個(gè)大孔聚合物，對(duì)血漿中亞甲藍(lán)含有很強(qiáng)選擇性吸附，可排除血漿蛋白、脂肪和其它雜質(zhì)干擾，當(dāng)血漿標(biāo)本經(jīng)過(guò)小柱時(shí)，血漿中血漿中亞甲藍(lán)被柱子中大孔聚合物吸附，最終用洗脫液洗脫液洗脫亞甲藍(lán)，采取柱子提取血漿中殘留亞甲藍(lán)，用含1%醋酸甲醇溶液調(diào)零，在653nm檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控、測(cè)定管，其吸光度與濃度呈正比。亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第16頁(yè)WatersOasis小柱特征:-大孔聚合物.對(duì)化合物保留強(qiáng)

-是一個(gè)通用性吸附劑（pH范圍較寬1-14）-

30%甲醇清洗,可完全去除血漿中蛋白、脂質(zhì)和其它雜質(zhì)

-亞甲藍(lán)在不一樣溶劑中,最大吸收峰不一樣：甲醇溶液為653nm,故本法選653nm為測(cè)試波長(zhǎng).

-

可用1％乙酸甲醇溶液,快速將柱床頂亞甲藍(lán)洗脫.亞甲藍(lán)酸性染料，（pH3.51％乙酸甲醇溶液）亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第17頁(yè)18主要檢測(cè)設(shè)備：固相萃取富集裝置亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第18頁(yè)亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)方法使用WatersOasis小柱萃取血漿中亞甲藍(lán)使用前Waters小柱1、用6ml甲醇活化Waters小柱2、加入6ml供試血漿亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第19頁(yè)亞甲藍(lán)殘留量檢測(cè)方法將萃取出亞甲藍(lán)洗脫后進(jìn)行比色

Waters小柱萃取出血漿中亞甲藍(lán)3、萃取亞甲藍(lán)4、用30％甲醇6mL清洗5、用含1％乙酸甲醇溶液2ml洗脫6、洗脫液離心（3500rpm/10min）

7、用含1％乙酸甲醇溶液作試劑空白，在654±2nm波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定吸光度注：用一樣方法萃取檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第20頁(yè)成品試劑盒組成小柱R1：活化液R2：清洗液R3：洗脫液亞甲藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)液：（100μmol/L)質(zhì)控液：（0.300μmol/L）亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第21頁(yè)操作方法（詳讀說(shuō)明書(shū)、按說(shuō)明書(shū)操作）1、柱預(yù)處理 取小柱三支表明測(cè)定、標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)控，分別插入固相萃取裝置過(guò)濾柱子中，加入3ml活化液活化小柱。2、加標(biāo)準(zhǔn)液（10μmol/L）：（取血漿0.36ml,加100μmol/L標(biāo)準(zhǔn)液0.04ml混勻）于標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)小柱內(nèi)加0.3ml標(biāo)準(zhǔn)液3、加質(zhì)控液（0.300μmol/L）：

（取血漿0.36ml,加質(zhì)控液0.04ml混勻）于標(biāo)明標(biāo)準(zhǔn)小柱內(nèi)加0.3ml質(zhì)控液4、加樣：于標(biāo)明測(cè)定小柱內(nèi)加6.0ml血漿亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第22頁(yè)5、清洗

待血漿完全進(jìn)入小柱后，用3ml清洗液清洗小柱，去血漿中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和其它雜質(zhì)，血漿中亞甲藍(lán)被吸附于吸附劑上。6、洗脫

換潔凈試管，加2ml洗脫液洗脫小柱上亞甲藍(lán)。

亞甲藍(lán)病毒滅活血漿的質(zhì)量測(cè)專家講座第23頁(yè)7、檢測(cè)

將洗脫液離心3000轉(zhuǎn)/5分鐘，取上清液于4040半自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)洗脫液調(diào)零，654nm波長(zhǎng)，分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管吸光