病原學(xué)診斷與防治

第一篇微生物學(xué)基礎(chǔ)第八章病原學(xué)診斷與防治

LaboratoryDiagnosisandPreventionPrinciples

第一節(jié)細(xì)菌學(xué)診斷第二節(jié)病毒學(xué)診斷第三節(jié)真菌學(xué)診斷第四節(jié)特異性預(yù)防與治療4/18/20241OutlineLaboratorydiagnosisforbacterialinfectionsMorphological--microscopicMolecularSerologicalLaboratorydiagnosisforviralinfectionsMorphological--electronmicroscopicIsolationMolecular:nucleicacidsandproteinsSerologicalLaboratorydiagnosisforfungalinfectionsMorphological--microscopicIsolation4/18/202424/18/20243AssaysMorphologicalassaysLightorelectronmicroscopiesIsolationanddifferentiationSerologicalassaysAntigen-antibodyassaysMolecularassaysMicroorganism’sgene(DNA&RNA)4/18/20244PrinciplesforSpecimenCollectionSterilemanipulation,avoidcontaminationObtainaspecimenfromtheinfectedsiteaccordingtothediseasephasebeforeadministratingantibioticsDoubleseraforantibodydetections,acuteandrecoveryphaseeachPositiveifthetiterofthelaterspecimenisabove4XtothefirstspecimenTransport,andstorecorrectlyassoonaspossibleStoreat-4oCformostbacterialspecimens,butkeepwarmforNeisseria

meningitidisandNeisseria

gonorrhoeaeStoreat-4oC~-70oCforviralspecimens4/18/20245LaboratoryDiagnosisforBacterialInfections

Morphological

ProteinandNucleicacids

Antibody4/18/20246標(biāo)本的采集和送檢六原則無(wú)菌取材,避免雜菌污染不同期不同標(biāo)本用抗生素以前采集病變明顯部位運(yùn)送注意保存標(biāo)本必須新鮮4/18/20247病原菌的檢查程序藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)本直接涂片鏡檢分離培養(yǎng)生化試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)明確診斷初步診斷分子生物學(xué)技術(shù)其他檢測(cè)技術(shù)4/18/20248BacteriologicalDiagnosisIdentifyingtheorganismMorphologicalIsolation&cultureBiochemicalreactionSerologicalassaysPathogenesis&antibioticssusceptibilityAnimalexperimentVirulencetestantibioticssusceptibility4/18/20249MorphologicalNon-stainedmicroscopicobservationDark-fieldmicroscopyObservingthemovementoflivebacteriaStainedmicroscopicobservationsGramstainAcid-faststainFluorescencestain4/18/2024104/18/2024114/18/2024124/18/2024134/18/2024144/18/2024154/18/202416Isolation&Culture:ColonySizeShapeColorSurfacefeaturesSmooth-RoughTransparencyHemolysis4/18/2024174/18/2024184/18/202419分離培養(yǎng)

isolationandcultivation

分離培養(yǎng)是微生物學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是最可靠的傳統(tǒng)診斷技術(shù)。（圖為普通培養(yǎng)箱）4/18/202420

厭氧罐厭氧袋4/18/202421BiochemicalReactions

SugarFermentationH2STestCitrateutilization4/18/202422SerologicalAssaysDetectionantibodyinthepatient’sserumAcurrentinfectionshouldbeIgMpositiveA4-foldorgreaterriseonantibodytiterbetweentheacuteserumsampleandtheconvalescentserumsampleMajordrawbacksAsingleIgGantibodytiterisdifficulttointerpretbecauseitisunclearwhetheritrepresentsacurrentorapreviousinfectiontheconvalescentsampleisusuallytaken10-14daysaftertheacutesample.Bythistime,thepatienthasoftenrecoveredandthediagnosisbecomesaretrospectiveoneSomeexceptionsIncertaindiseases,asingletiterofsufficientmagnitudecanbeusedaspresumptiveevidenceofacurrentinfection4/18/202423基本原則①用已知抗體檢測(cè)未知抗原；②用已知抗原檢測(cè)未知抗體。最簡(jiǎn)易的方法有玻片凝集等試驗(yàn)。常用的方法有：凝集試驗(yàn)、沉淀試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)、ELISA、免疫熒光等。免疫學(xué)試驗(yàn)4/18/202424AnimalexperimentAnimals

Mouse

GuineaPig

RabbitDogMonkeyInoculationroutesIntradermalSubcutaneousIntraperitoneal

Intravenous

Intracranial/intracerebral

IntraspinalIntranasalLavage4/18/202425VirulenceTestMedianlethaldose,LD50Medianinfectivedose,ID50ElekPlateDiphtherotoxin

Corynebacterium

diphtheriae

Enterotoxinenterotoxigenic

E.coli4/18/202426AntibioticSusceptibilityTestMethod4/18/202427MIC&MBCMinimumInhibitoryConcentration，MICMinimumBactericidalConcentration，MBCBactericidaldrugsusuallyhaveanMBCequalorverysimilartotheMICBacteriostaticdrugsusuallyhaveanMBCsignificantlyhigherthantheMIC4/18/2024284/18/202429BacterialProteins,DNA&RNAAntigens(Proteins)KnownantibodiesAgglutination,coagulation,precipitation,ELISA,Immunofluorescence,radioimmunoassayDNA&RNAPCRNucleicacidhybridization4/18/202430DetectionofBacterialAntigensPrecipitationtestCoagglutinationtestImmunoflorecence,IFMcAbtechnique4/18/2024314/18/2024324/18/202433BacterialDNA&RNA

PCRDNAprobe&hybridizationDNAhybridization(southernblot)PlasmidfingerprintanalysisRestrictmultimorphologicanalysis4/18/2024344/18/2024354/18/202436PCR4/18/202437分子生物學(xué)技術(shù)

molecularbiologicaltechniques

核酸雜交

nucleotidehybridization

原位雜交

insituhybridization

斑點(diǎn)雜交

dotblot

Southernblot

Northernblot

PCR技術(shù)：多聚酶鏈反應(yīng)

(polymerasechainreaction，PCR)4/18/202438

PCR

是一種無(wú)細(xì)胞的分子克隆技術(shù)，能在體外將一個(gè)基因或一段DNA序列經(jīng)過(guò)多次循環(huán)的DNA復(fù)制，在數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增上百萬(wàn)倍。既便于基因診斷，又利于研究。4/18/2024394/18/202440GeneChip/microarray4/18/202441DiagnosisStrategyforBacterialInfection4/18/202442第25章病毒感染的診斷P238

LaboratoryDiagnosisforViralInfection

MorphologicalIsolation&CultureProtein&NucleicacidsSerological4/18/202443

病毒感染的檢測(cè)一、標(biāo)本的采集與運(yùn)送

急性期標(biāo)本；根據(jù)感染性質(zhì)取不同的標(biāo)本；標(biāo)本置于轉(zhuǎn)運(yùn)液中；冷藏快運(yùn)。4/18/202444MorphologicalElectronmicroscopy,EMImmunoelectronmicroscopy,IEMLightMicroscopyInclusionbodyNegribody4/18/2024454/18/202446二、病毒分離培養(yǎng)

病毒分離的一般程序是

接種易感動(dòng)物出現(xiàn)癥狀血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)本殺滅雜菌雞胚病變或死亡鑒定細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞病變4/18/202447IsolationandCultureAnimalinoculationChickeneggculture:9~14daysTissuecultureOrgancultureTissuecultureCellculture4/18/202448Cellculture4/18/2024494/18/202450TypeofCulturedCellsPrimarycellculturePassage2-3generationsDiploidcellculture2-foldchromosomes,Passage50~100generations,safe,canbeusedforvaccinemanufactureContinuouscelllinecultureMutantdiploidcells,mostlytumorcells,easytopassageandmaintainNotsensitiveasdiploidcells,mayhaveendogenousviruses,cannotbeusedforvaccinemanufacture4/18/202451IndicationsofViralPropagationCytopathiceffect,CPEHemadsorptionHemagglutinationViralinterferenceNeutralizationtest,NT4/18/2024524/18/2024534/18/202454（1）原代細(xì)胞培養(yǎng)：

動(dòng)物或人組織直接用蛋白酶消化所得的細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后可貼壁或懸浮生長(zhǎng)。（2）二倍體細(xì)胞株：在體外連續(xù)培養(yǎng)50~60代仍保持其二倍染色體數(shù)目的單型細(xì)胞。為生產(chǎn)人用疫苗的首選細(xì)胞株。（3）傳代細(xì)胞系

能在體外連續(xù)傳代、來(lái)自癌細(xì)胞或發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化、突變的原代細(xì)胞或二倍體細(xì)胞株。4/18/202455

臨床病毒實(shí)驗(yàn)室常用的細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)常用的名稱組織來(lái)源傳代數(shù)原代HEKPMKRKGPE/CE人胚腎恒河猴腎兔腎豚鼠胚或雞胚1～2二倍體HEL(MRC-5)HDF人胚肺人新生兒包皮20～50異倍體Hep-2HeLaA549Vero人喉癌人子宮頸癌人肺癌非洲綠猴腎無(wú)限4/18/202456識(shí)別病毒增殖的方法（1）細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）：溶細(xì)胞型病毒感染細(xì)胞后，可出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)縮、裂解或細(xì)胞腫大、數(shù)個(gè)細(xì)胞融合成多核巨細(xì)胞或細(xì)胞聚集成葡萄串狀、脫落或死亡等。4/18/202457epithelialcells-adenovirusuninfectedearlyinfectionlateinfection4/18/202458NegriBody4/18/202459（2）紅細(xì)胞吸附：流感病毒和某些副粘病毒感染細(xì)胞后24～48小時(shí)，細(xì)胞膜上出現(xiàn)病毒的血凝素，能吸附豚鼠、雞等動(dòng)物及人的紅細(xì)胞，發(fā)生紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。（3）干擾現(xiàn)象4/18/202460病毒量測(cè)定（1）測(cè)定病毒數(shù)量可用空斑形成單位（PFU）表示。一個(gè)空斑是標(biāo)本中一個(gè)病毒大量復(fù)制所致，有感染性的病毒經(jīng)適當(dāng)稀釋后接種于單層細(xì)胞，由于單個(gè)病毒的復(fù)制增殖使局部單層細(xì)胞脫落，此即空斑。經(jīng)染色后空斑可用肉眼觀察，計(jì)算空斑數(shù)即可計(jì)數(shù)病毒數(shù)量。4/18/202461PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY4/18/202462PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY4/18/202463PLAQUEASSAYPLAQUEASSAY4/18/202464三、光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡1、光學(xué)顯微鏡：觀察病毒的包涵體4/18/2024652、電子顯微鏡：直接觀察病毒4/18/202466ViralQuantityDeterminationTCID5050%tissuecultureinfectiousdoseDeterminetheinfectivityoftheexaminedvirusesPFUPlaqueformationpfu/mlPreciselyquantitatethenumberofthelivingviralparticles4/18/2024674/18/202468Plaque4/18/202469Differencesbetweenviralparticle(VP),plaqueformationunit(PFU)Viralparticles(VPs)representthetotalnumberofviralparticles(liveanddeadcombined).Duetovariationsinviruspreparationstheratiooflive/deadvariessignificantlyandtherefore,VPdoesnotreflecttheamountofactivevirusinthepreparationPFU(plaqueformationunit)representsthenumberofinfectiousorliveviruses.ItreflectstheamountofworkingvirusesinthepreparationFormostviruspreps,theVP/PFUratiois20:1to50:1Whichonebetterreflectstheamountofactivevirusused?UsingVP(viralparticles)astheunitwillresultinsignificantvariationsintheamountofactuallivevirusesused,andusingIFUorPFUastheviralunitwillgivemoreconsistentoutcomes.4/18/202470ProteinsandNucleicAcidsProteins(antigens)Fluoresece-labeled,enzyme-labeled(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)andradio-labeledanitbodiesViralDNAorRNAGenechipDNAchip/cDNA

Microarray4/18/202471Virus-specificAntibodiesNeutralizationtest,NTHemagglutinationinhibitiontest,HIComplementfixation,CFELISAWesternblot4/18/202472三、病毒感染的血清學(xué)診斷方法P2401、中和試驗(yàn)

2、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)

3、紅細(xì)胞凝集和凝集抑制試驗(yàn)

病毒＋抗體失去感染性恢復(fù)期/早期4:1，有診斷意義。4/18/202473ELISAforHIVantibodyMicroplateELISAforHIVantibody:colouredwellsindicatereactivity4/18/2024744/18/202475DiagnosisStrategyforViralInfection

4/18/202476RapidDiagnosisforViralInfectionMorphologicalEM&IEM,occasionallyLightMicroscopy:inclusionbodyViralantigensImmunofluorescenceRadioimmunoassaysELISASpecificantibodies:IgMNucleicacids:PCR4/18/202477小結(jié)細(xì)菌感染的微生物學(xué)檢查法病原體檢查核酸的檢測(cè)抗原、抗體的檢測(cè)病毒感染的微生物學(xué)檢查法電鏡及免疫電鏡病毒的分離培養(yǎng)和鑒定核酸的檢測(cè)抗原、抗體的檢測(cè)真菌感染的微生物學(xué)檢查法直接鏡檢真菌的分離培養(yǎng)4/18/202478第四節(jié)特異性預(yù)防與治療PreventionPrinciples4/18/202479特異性免疫的分類自然免疫NaturalImmunization自然主動(dòng)免疫：隱性或顯性感染自然被動(dòng)免疫：通過(guò)胎盤或初乳獲得母體抗體人工免疫ArtificialImmunization人工主動(dòng)免疫：接種疫苗或類毒素等人工被動(dòng)免疫：注射抗毒素或丙種球蛋白等4/18/202480一、人工免疫(artificialimmunization)用人工的方法給機(jī)體輸入抗原性物質(zhì)（如疫苗、類毒素等）或直接輸入免疫效應(yīng)分子（如抗體、細(xì)胞因子等），使機(jī)體獲得特異性免疫力的方法。人工主動(dòng)免疫artificialactiveimmunization人工被動(dòng)免疫artificialpassiveimmunization4/18/202481人工免疫：采用人工方法將疫苗、類毒素等或含有某種特異性抗體、細(xì)胞免疫制劑等接種于人體，以增強(qiáng)宿主體的抗病能力。人工自動(dòng)免疫

artificialactiveimmunization疫苗（vaccine）類毒素人工被動(dòng)免疫artificialpassiveimmunization抗毒素抗菌血清血清丙種球蛋白4/18/202482人工自動(dòng)與被動(dòng)免疫比較區(qū)別點(diǎn)人工自動(dòng)免疫人工被動(dòng)免疫免疫物質(zhì)接種次數(shù)免疫力出現(xiàn)時(shí)間免疫力維持時(shí)間用途抗原1~3次慢(2~4周)長(zhǎng)(數(shù)月~數(shù)年)多用于預(yù)防抗體或細(xì)胞因子1次快(立即出現(xiàn))短(2~3周)用于治療或應(yīng)急預(yù)防4/18/202483生物制品(biologicalproducts)：人工免疫的免疫原、免疫血清、細(xì)胞制劑及診斷制劑的生物性制劑。人工主動(dòng)免疫生物制品疫苗類毒素人工被動(dòng)免疫生物制品抗毒素丙種球蛋白4/18/202484疫苗（vaccine）減毒活疫苗（attenuatedlivevaccine）卡介苗（BCG）滅活疫苗（inactivatedvaccine）傷寒沙門菌與甲、乙型副傷寒沙門菌混合的三聯(lián)疫苗亞單位疫苗（subunitvaccine）基因工程疫苗（geneengineeredvaccine）核酸疫苗（nucleicacidvaccine）4/18/2024854/18/2024864/18/202487類毒素（toxoid）細(xì)菌外毒素經(jīng)0.4％甲醛液處理后，其毒性消失而仍保留抗原性的生物制品常用的類毒素白喉類毒素破傷風(fēng)類毒素等白、百、破三聯(lián)疫苗4/18/202488人工被動(dòng)免疫生物制品抗毒素（antitoxin）通常是用細(xì)菌類毒素給馬多次注射后，取其免疫血清提取免疫球蛋白精制而成常用破傷風(fēng)抗毒素白喉抗毒素免疫球蛋白（immunoglobulin）4/18/202489人工主動(dòng)免疫－病毒疫苗

減毒活疫苗（attenuatedlivevaccine）滅活疫苗（inactivatedvaccine）亞單位疫苗（subunitvaccine）基因工程疫苗（geneengineeredvaccine）基因工程亞單位疫苗（geneengineeredsubunitvaccine）基因工程載體疫苗（geneengineeredvectoredvaccine）基因缺失活疫苗（genedeletedlivevaccine）核酸疫苗（nucleicacidvaccine）。合成肽疫苗（syntheticpeptidevaccine）抗獨(dú)特型疫苗（anti-idiotypevaccine）4/18/202490活疫苗（Livingvaccine）減毒活疫苗基于基因工程技術(shù)的新型活疫苗遺傳重組活疫苗基因缺失活疫苗載體活疫苗4/18/202491減毒活疫苗(Attenuatedvaccine)自然或人工選擇法（如Ts株）對(duì)人低毒或無(wú)毒的變異株，如脊灰、流感、麻疹的減毒株。優(yōu)點(diǎn)：模擬自然感染，免疫效果好，局部IgA。理論上的缺點(diǎn)，實(shí)際工作中少見變異株可能回復(fù)到有毒力的野生株如果機(jī)體免疫缺陷，減毒株仍可能引起感染或并發(fā)癥可能激活機(jī)體內(nèi)其他病毒的感染減毒活苗可能引起持續(xù)感染成功的范例：1961年我國(guó)應(yīng)用脊灰疫苗，脊灰發(fā)病率大幅度下降。1980年天花病毒滅絕。4/18/202492遺傳重組疫苗將野毒株表面抗原基因與弱毒株其他基因組合而獲得減毒活病毒。適用于基因組分節(jié)段雙鏈RNA病毒，如流感病毒、輪狀病毒等。4/18/202493基因缺失活疫苗利用DNA重組技術(shù)，定向缺失病毒基因組的某一區(qū)段，使病毒喪失毒力而保留增殖能力和免疫原性。優(yōu)點(diǎn)：疫苗株的遺傳背景清楚，不易突變回到野毒株。4/18/202494載體活疫苗利用DNA重組技術(shù)，將編碼病毒抗原的基因插入到另一無(wú)毒力的載體病毒，使之高效表達(dá)易建立多價(jià)疫苗載體病毒常用的有痘苗病毒、腺病毒、HSV-14/18/202495滅活疫菌（Killedvaccine）滅活全病毒疫苗亞單位疫苗合成肽病毒疫苗基因工程疫苗獨(dú)特型病毒疫苗核酸疫苗4/18/202496滅活全病毒疫苗物理或化學(xué)方法滅活病毒。適用烈性或易變異病毒如乙腦病毒、狂犬病病毒、流感病毒。優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)簡(jiǎn)單、易保存運(yùn)輸缺點(diǎn)需要大量培養(yǎng)病毒，成本高無(wú)局部抗體，不激活CTL，可激活TDTH甲醛滅活的麻疹病毒和RSV疫苗可加重疾病，機(jī)制不詳4/18/202497亞單位疫苗（Subunit）種類化學(xué)方法制備：如HBsAg和流感HA基因工程亞單位疫苗優(yōu)點(diǎn)不含病毒核酸，僅有能誘導(dǎo)中和抗體的衣殼蛋白或包膜表面抗原。免除了回復(fù)突變和交叉復(fù)活的可能。消除腫瘤病毒的潛在的致癌作用。4/18/202498合成肽病毒疫苗人工合成病毒保護(hù)性抗原決定簇肽段。優(yōu)點(diǎn)制備容易，可大量生產(chǎn)，易保存，副作用少理論與實(shí)踐上的缺點(diǎn)免疫原性弱，使用時(shí)需要加佐劑。不同肽免疫活性有差異。部分肽只激發(fā)B細(xì)胞表位，缺乏激發(fā)TH細(xì)胞的表位。4/18/202499基因工程疫苗利用DNA重組技術(shù)制備的生物制品。如將編碼病毒特異抗原的基因用適當(dāng)?shù)妮d體將此基因帶入大腸桿菌或真核細(xì)胞，使之表達(dá)。研發(fā)成本高，生產(chǎn)成本低，下游工程復(fù)雜。4/18/2024100核酸疫苗將病毒基因?qū)隓NA載體（通常是帶有真核表達(dá)調(diào)控基因的質(zhì)?；虿《荆?，將重組DNA導(dǎo)入機(jī)體，重組DNA可以在細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)表達(dá)出目的蛋白。優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)刺激產(chǎn)生體液和細(xì)胞免疫，能誘導(dǎo)CTL活性，易生產(chǎn)，易保存。理論上缺點(diǎn)：安全性尚待考