單克隆抗體制備專家講座

單克隆抗體制備Monoclonalantibody單個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生針對同一個(gè)抗原決定簇抗體。分三個(gè)階段：（1）免疫Balb/c小鼠（2）建立篩選方法和程序（3）雜交瘤生成單克隆抗體制備專家講座第1頁一、動物免疫1Balb/c小鼠6-8周齡，25g左右，雌性較佳2免疫方法（1）首次腹腔免疫0.5ml抗原與福氏完全佐劑1：1混和液，普通2-3只鼠（2）30天后加強(qiáng)免疫，用福氏不完全佐劑單克隆抗體制備專家講座第2頁（3）15天后，尾靜脈注射0.1mL水劑抗原，免疫3天后，去脾臟融合對于抗原性弱抗原，可增加免疫次數(shù)，詳細(xì)程序依抗原性質(zhì)而定。單克隆抗體制備專家講座第3頁可溶性蛋白（提取或表示蛋白）50-100μg顆粒性蛋白（病毒）50-100μg細(xì)菌106CFU活細(xì)胞（哺乳動物細(xì)胞）105-7CFU活癌源細(xì)胞104-6CFU糖類（多糖、糖蛋白）100-200μg核酸100-200μg單克隆抗體制備專家講座第4頁1在液氮罐中取保留SP2/0細(xì)胞，以MEM培養(yǎng)基復(fù)蘇，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2在對數(shù)生長久收獲107-108CFUSP2/0細(xì)胞3500g離心5min，棄上清4輕輕振動離心管以松動細(xì)胞，重懸于20mLMEM營養(yǎng)液中二、骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)單克隆抗體制備專家講座第5頁注意關(guān)鍵點(diǎn)：1如細(xì)胞外觀不健康，或生長密度不好，應(yīng)檢測是否有支原體污染2一次用一個(gè)凍存管里細(xì)胞融合，應(yīng)防止長久培養(yǎng)3融合細(xì)胞要處于對數(shù)生長久單克隆抗體制備專家講座第6頁三、喂養(yǎng)細(xì)胞制備1取清潔級ICR小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹部皮膚4用20mL注射器吸收15mLMEM營養(yǎng)液，注入小鼠腹腔單克隆抗體制備專家講座第7頁5輕輕擠壓小鼠腹腔，并用注射器往返抽吸幾次，將小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞吸出，置細(xì)胞瓶內(nèi)待用6將喂養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)至50mL離心管內(nèi)，500g離心5min，以HAT培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)待用單克隆抗體制備專家講座第8頁注意事項(xiàng)：1禁止用燃燒棉球?qū)π∈笙?吸收腹腔喂養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，不能將腸道刺破，否則會造成污染3如腹腔里脂肪塊堵塞針頭，應(yīng)調(diào)整針頭位置，重新吸收細(xì)胞液單克隆抗體制備專家講座第9頁四、脾細(xì)胞制備1取Balb/c小鼠2只，斷頸椎殺死小鼠，置70%酒精溶液中浸泡10min2將小鼠四肢固定，腹部朝上3在生物安全柜內(nèi)，無菌打開小鼠腹腔4小心分離出脾臟，置含有7mLMEM營養(yǎng)液培養(yǎng)皿內(nèi)單克隆抗體制備專家講座第10頁5用針頭刺破脾臟，并用彎針頭擠壓脾臟，將脾細(xì)胞分離出來6用吸管吹打細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液吸置50mL離心管中，沉降5min7將細(xì)胞懸液吸置另外一支離心管中，500g離心5min，棄上清，沉淀以20mLMEM培養(yǎng)基重懸單克隆抗體制備專家講座第11頁注意事項(xiàng)：1禁止用燃燒棉球?qū)π∈笙?取脾臟時(shí)，假如脾臟被脂肪粘連，需小心，不能撕裂或撕碎脾臟，更不能將腸道撕破3假如脾臟沒用腫脹，表明免疫效果不好，應(yīng)選取備用小鼠脾臟單克隆抗體制備專家講座第12頁五、細(xì)胞融合及培養(yǎng)1以2：1混合脾臟細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞，加至細(xì)胞融合管中2在室溫下500g離心10min，棄上清3輕輕振動離心管以松動和混合細(xì)胞，后置37℃水浴4在60S內(nèi)用巴氏吸管將0.8mL預(yù)熱至37℃PEG1500遲緩加至細(xì)胞內(nèi)，并輕輕抽吸兩次單克隆抗體制備專家講座第13頁5在90S內(nèi)，用移液管輕輕將30mL預(yù)熱至37℃MEM培養(yǎng)基加至融合管中37℃水浴5min室溫下500g離心10min，棄上清在融合管內(nèi)加入HAT培養(yǎng)基20mL，將沉淀懸浮，后移置250mL玻璃瓶中，并加入HAT培養(yǎng)基30mL，后加入10-15mL喂養(yǎng)細(xì)胞懸液單克隆抗體制備專家講座第14頁9將細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2-3滴，約0.1-0.15mL10將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11培養(yǎng)3天后可取出細(xì)胞板在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞融合情況單克隆抗體制備專家講座第15頁12培養(yǎng)置第5天時(shí)用HAT培養(yǎng)基換液，換1/2137-8天用HT培養(yǎng)基換液，全部換液1410-14天后，雜交瘤細(xì)胞占孔底1/3以上，細(xì)胞上清變黃，能夠檢測融合細(xì)胞上清里抗體。單克隆抗體制備專家講座第16頁注意事項(xiàng)：1脾臟細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞百分比在2：1—5：1最好2細(xì)胞融合是關(guān)鍵步驟，防止用力吸打3細(xì)胞融合后3天要注意檢驗(yàn)是否污染，包含細(xì)菌和真菌，一發(fā)覺污染，要盡快棄去4換液時(shí)不要影響孔底雜交瘤細(xì)胞，不要吸出或沖散單克隆抗體制備專家講座第17頁六、雜交瘤細(xì)胞篩選大約有10%雜交瘤細(xì)胞能分泌抗體，而分泌特異性抗體雜交瘤細(xì)胞更少，故需要篩選。篩選抗體分泌細(xì)胞有各種方法，如HA-HI、IFA、ELISA等。其中間接ELISA應(yīng)用最廣。單克隆抗體制備專家講座第18頁注意事項(xiàng)：1因單抗是鼠源，故酶標(biāo)識抗抗體慣用酶標(biāo)羊抗鼠或兔抗鼠抗體，包含抗IgG、IgM抗體。如單用酶標(biāo)識抗IgG抗體，則IgM類單抗就不能被篩選出來。2陽性克隆轉(zhuǎn)移到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞長滿后，上清再檢測一次3篩選方法應(yīng)在細(xì)胞融合前建立好，一部篩選特異單抗方法最好單克隆抗體制備專家講座第19頁七、雜交瘤細(xì)胞克隆在分泌特異性單抗雜交瘤細(xì)胞中，可能混有不分泌單抗細(xì)胞克隆；另外分泌單抗克隆在初代不穩(wěn)定，有一部分細(xì)胞染色體常丟失，為了預(yù)防不分泌抗體細(xì)胞過分生長，在早期應(yīng)對細(xì)胞進(jìn)行克隆。慣用有限稀釋法，普通來說，雜交瘤經(jīng)過3-4次克隆后就穩(wěn)定了。單克隆抗體制備專家講座第20頁1在克隆前一天，準(zhǔn)備數(shù)塊含有0.1mL喂養(yǎng)細(xì)胞96孔板2將24孔板里待克隆細(xì)胞懸浮，取0.1mL細(xì)胞懸液加入0.9mL臺盼藍(lán)染色液，混勻3血液計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)4在24孔培養(yǎng)板上，對待克隆細(xì)胞懸液進(jìn)行10倍比稀釋單克隆抗體制備專家講座第21頁5當(dāng)稀釋至100CFU/mL時(shí)，取1mL細(xì)胞懸液至裝有10mLHT培養(yǎng)基瓶中，再分別加至96孔板中（預(yù)先加有喂養(yǎng)細(xì)胞），0.1mL/孔6將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天左右，注意觀察7大約3-4天在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞克隆，5-7天換液一次，810天左右克隆長滿，能夠檢測上清單克隆抗體制備專家講座第22頁注意事項(xiàng)：1上清液要在24h內(nèi)測定2細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)只計(jì)活細(xì)胞（淡藍(lán)色），死細(xì)胞為深藍(lán)色，且沒有光澤3如有高質(zhì)量FCS ，可不用喂養(yǎng)細(xì)胞4一個(gè)克隆需亞克隆3-4次，才穩(wěn)定5如有孔污染，可向感染孔及臨近孔滴加1mol/mLCuSO4溶液單克隆抗體制備專家講座第23頁七、試驗(yàn)室規(guī)?？贵w制備體外上清液培養(yǎng)1雜交瘤細(xì)胞先在25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2細(xì)胞長滿瓶底后轉(zhuǎn)至50或100mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3當(dāng)細(xì)胞液變黃后，搜集上清液，再加新鮮培養(yǎng)液，并重復(fù)搜集上清2次4讓細(xì)胞長至飽和狀態(tài)，直至死亡，并搜集上清單克隆抗體制備專家講座第24頁體內(nèi)生產(chǎn)腹水1正常培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞2喂養(yǎng)Balb/c小鼠，注射細(xì)胞一周前經(jīng)過腹腔注射0.5mL降植烷3在細(xì)胞對數(shù)生長久收獲細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，將細(xì)胞數(shù)量以培養(yǎng)液調(diào)整至（2-10）