VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座

WhatareRNAi?RNAi現(xiàn)象早在1993年就有報道:將產(chǎn)生紫色素基因轉(zhuǎn)入開紫花矮牽牛中,希望得到紫色更深花,可是事與愿違,非但沒有加深紫色,反而成了白色。當初認為這是矮牽牛原來有紫色素基因和轉(zhuǎn)入外來紫色素基因都失去了功效,稱這種現(xiàn)象是“共抑制”。直到1998年,Fire等研究證實,在正義RNA阻斷了基因表示試驗中,真正起作用是雙鏈RNA,使基因“緘默”了。研究人員將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾(RNA

interference,RNAi)。研究者所以取得了年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第1頁WhatareRNAi?RNA干擾廣泛存在于生物界，在不一樣物種中RNA干擾被賦予不一樣名稱:在植物體中被稱為基因共抑制（co-suppression）在真菌中被稱為基因阻抑（qulling）在動物體內(nèi)被稱為RNA干擾（RNAi）現(xiàn)今用于植物RNAi技術(shù)按導入方式不一樣有粒子轟擊、病毒誘導基因緘默(VIGS)、農(nóng)桿菌介導等方式。VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第2頁VirusInducedGeneSilencing(VIGS)病毒誘導基因緘默(virusinducedgenesilencing,VIGS)是指經(jīng)過對已知植物病毒改造，將目標基因片段整合入病毒載體中，然后侵染植物,誘發(fā)RNAi路徑,伴隨病毒復制和轉(zhuǎn)錄而特異性地誘導序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修飾，從而引發(fā)植物表型或生理指標改變，實現(xiàn)對該功效基因判定。VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第3頁VIGS原理

dsRNA:雙鏈RNA;Dicer酶:核糖核酸酶Ⅲ(RibonucleaseⅢ,RNaseⅢ)家族組員;

siRNA:小干擾RNA;

RISC:RNA誘導緘默復合體VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第4頁VIGS應用載體利用植物病毒作為載體優(yōu)點:病毒能吸附到完整植物細胞并將它們核酸導入到細胞中感染植物細胞產(chǎn)生大量病毒，所以重組病毒載體能夠高效表示轉(zhuǎn)入外源基因。病毒感染能夠蔓延整個植株病毒感染快VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第5頁VIGS應用載體RNA病毒(最早最多)→1995,首次基于煙草花葉病毒TMV載體構(gòu)建(攜帶八氫番茄紅素脫氫酶PDS侵染煙草，上位葉片褪綠白化)→1998,馬鈴薯X病毒PVX(緘默PDS誘發(fā)白化效應)→,煙草脆裂病毒TRV(因其含有病毒癥狀較輕、緘默效率高、連續(xù)時間長、能夠侵染分生組織應用，當前應用最廣泛VIGS載體)PDS即八氫番茄紅素脫氫酶，是類胡卜素合成所必需酶，具保護葉綠素免受光漂白作用，而PDS基因發(fā)生緘默后被侵染植物就會表現(xiàn)出光漂白癥狀。PDS表型變異易于區(qū)分，所以PDS基因成為VIGS體系評價參考基因。VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第6頁VIGS應用載體DNA病毒(載體構(gòu)建簡便、無需體外轉(zhuǎn)錄、操作難度低)→1998,基于雙生病毒番茄金色花葉病毒TGMVVIGS體系成功建立(第一例DNA病毒載體)→,非洲木薯花葉病毒ACMV→,棉花皺葉病毒CLCrV→,水稻東格魯桿狀病毒RTBV(實現(xiàn)農(nóng)桿菌介導接種高效緘默水稻內(nèi)源基因PDS，第1例能夠經(jīng)過農(nóng)桿菌介導接種水稻VIGS載體)VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第7頁VIGS應用寄主寄主范圍有限，針對不一樣寄主植物往往需要開發(fā)不一樣病毒載體。，大麥抑制PDS（大麥條紋花葉病毒BSMV，深入在小麥上應用）→，水稻、大麥和玉米（雀麥花葉病毒BMV→，大豆（多組分病毒菜豆莢斑駁病毒BPMV）→，大豆（改造后無需體外轉(zhuǎn)錄，增加緘默效率）VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第8頁VIGS應用抗旱研究中相關基因功效分析，緘默小麥上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(γ-ECS)三個基因。緘默植株經(jīng)干旱脅迫后較正常植株在形態(tài)上有顯著改變，其葉片卷曲萎蔫程度較為突出，說明這三個基因在小麥抗干旱脅迫中含有主要功效。VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第9頁VIGS應用品質(zhì)改良相關基因功效分析，利用VIGS技術(shù)發(fā)覺高分子量谷蛋白亞基HMV-GS

1Bx14和小麥籽粒中麥谷蛋白聚合體合成相關。這也是首次報道VIGS技術(shù)應用于小麥穗子和籽粒相關基因功效，同時這個體系建立將會對研究與籽粒品質(zhì)和在小麥漸成籽粒中相關基因功效起到很大幫助作用。VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第10頁VIGS優(yōu)點在未獲取全長序列甚至事先不知道序列情況下即可進行VIGS分析。操作簡便，能快速獲取表型。無需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株。這對于那些轉(zhuǎn)基因植株獲取非常困難植物種類來說至關主要可用于突變致死基因功效研究?？捎糜诠π哂嗷蚬πа芯俊？捎糜诳焖俨灰粯又参锓N類間比較基因組學研究。VIG病毒誘導基因沉默技術(shù)專家講座第11頁VIGS缺點

VIGS引發(fā)目標基因緘默特征不含有遺傳性，以致VIGS技術(shù)并不能徹底揭示基因功效，這是此種技術(shù)本身