代謝調(diào)控緒論

代謝調(diào)控緒論代謝調(diào)控緒論第1頁10:34:09第一章緒論2、代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)必定性1、發(fā)酵技術(shù)是工業(yè)生物技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)5、課程內(nèi)容和學(xué)習(xí)方法3、代謝工程基礎(chǔ)思想4、正向代謝工程面臨挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢代謝調(diào)控緒論第2頁10:34:09？資源危機(jī)能源危機(jī)環(huán)境危機(jī)化石經(jīng)濟(jì)石油煉制尋求化石資源替換已經(jīng)成為社會(huì)經(jīng)濟(jì)可連續(xù)發(fā)展重大戰(zhàn)略社會(huì)經(jīng)濟(jì)可連續(xù)發(fā)展生物煉制1、發(fā)酵技術(shù)是工業(yè)生物技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)代謝調(diào)控緒論第3頁10:34:09可連續(xù)發(fā)展兩個(gè)方面：◆以可再生生物資源取代化石資源，以可再生生物能源取代不可再生化石能源;◆以清潔高效生物加工方式取代低效污染傳統(tǒng)物質(zhì)加工方式，以精細(xì)產(chǎn)品取代大量粗加工產(chǎn)品;背景代謝調(diào)控緒論第4頁10:34:09RenewablerawmaterialsBiofuelsBiomaterialsChemicalsFoodstaffsetc.微生物細(xì)胞工廠環(huán)境、資源、能源代謝調(diào)控緒論第5頁10:34:09大型跨國企業(yè)美國Cargill-Dow企業(yè)利用玉米為原料生產(chǎn)聚乳酸（14萬噸/年），是工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)興起標(biāo)志。淀粉糖化乳酸聚乳酸發(fā)酵生物材料代謝調(diào)控緒論第6頁10:34:09以淀粉、再生纖維素等原料，實(shí)現(xiàn)聚酯、聚乳酸、聚氨基酸等生物可降解材料低成本生產(chǎn)，逐步降低對(duì)化石資源依賴與環(huán)境污染。代謝調(diào)控緒論第7頁10:34:09

“十一五”以來我國生物產(chǎn)業(yè)產(chǎn)值以年均22.9%速度增加，年實(shí)現(xiàn)總產(chǎn)值約2萬億元。爭取到年，把生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展成為國民經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)。代謝調(diào)控緒論第8頁10:34:09問題：微生物既不會(huì)使代謝物大量積累而造成浪費(fèi)，也不會(huì)因代謝物缺失而供不應(yīng)求。微生物會(huì)保持各種代謝物濃度相對(duì)穩(wěn)定和動(dòng)態(tài)平衡，適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境改變。怎樣使微生物過量積累某種代謝產(chǎn)物？？代謝調(diào)控緒論第9頁10:34:09

代謝控制發(fā)酵：利用遺傳學(xué)或其它生物化學(xué)方法，人為地在脫氧核糖核酸（DNA）分子水平上，改變和控制微生物代謝，使有用代謝產(chǎn)物大量生成、積累發(fā)酵技術(shù)。2、代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)必定性代謝調(diào)控緒論第10頁10:34:09

微生物代謝調(diào)控機(jī)制能否被解除是代謝控制發(fā)酵關(guān)鍵所在。

研究方法：先研究目標(biāo)產(chǎn)物生物合成路徑、遺傳控制及代謝調(diào)整機(jī)制，然后定向選育大量積累目標(biāo)產(chǎn)物微生物。代謝調(diào)控緒論第11頁10:34:09代謝控制發(fā)酵出現(xiàn)和發(fā)展現(xiàn)實(shí)基礎(chǔ)生物化學(xué)酶變構(gòu)動(dòng)力學(xué)各種操縱子調(diào)控機(jī)制誘變育種原生質(zhì)體融合等重組DNA技術(shù)發(fā)酵過程控制合成路徑+調(diào)整機(jī)制菌株改造技術(shù)菌株發(fā)酵環(huán)境代謝調(diào)控緒論第12頁10:34:09

正向(Constructive)代謝工程1991年BaileyJE在Science上正式提出，基礎(chǔ)思想是：依據(jù)已經(jīng)有遺傳和生化知識(shí)，找出限速步驟，進(jìn)行遺傳操作3、代謝工程基礎(chǔ)思緒代謝調(diào)控緒論第13頁10:34:09代謝工程定義采取重組DNA技術(shù)和高精度分析生物學(xué)技術(shù)相關(guān)遺傳學(xué)方法，進(jìn)行準(zhǔn)確目標(biāo)基因操作，改變微生物原有調(diào)整系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)提升目標(biāo)代謝活性和目標(biāo)代謝產(chǎn)物量。代謝調(diào)控緒論第14頁10:34:09

代謝工程詳細(xì)思緒改變代謝流擴(kuò)展或構(gòu)建新代謝路徑代謝調(diào)控緒論第15頁10:34:09C3烯酰CoAC3羥酸C3烯酸碳水化合物原料C2酸C2醇C2CoAC3酮酸C2醛C2~PC3酮酸~PC3酸~PC4CoAC3酮C4醇C6糖~PC3醛~PC6糖~PC6糖~P

酸~PC3二醇C3羥酮~PC4酸C5酮酸C4CoAC6酸

C3烯酰CoAC3羥酸C3烯酸丙烯酸實(shí)當(dāng)代謝路徑重構(gòu)丙酮丁醇

代謝調(diào)控緒論第16頁10:34:09NAD+NADHPyruvatePDCAcetaldehydeEthanolADHHKGlucoseGAP1,3-DPGG-6-PF-6-PF-1,6-BPPFKGAPDHPKAcetaldehyde110%丙酮酸產(chǎn)率提升44%突變株親株提升乙醇脫氫酶活性①加速速度限制反應(yīng)代謝調(diào)控緒論第17頁10:34:09②改變分支代謝路徑流向GlucosePyruvateAlanineAcetaldehydeEthanolCitrateOAA

-KGAcCoAPyruvateOAAPDH(B1,NA)PDC(B1)PT(B6)PC(Bio)B1：硫胺素NA：煙酸Bio：生物素B6：吡哆醛光滑球擬酵母中丙酮酸代謝路徑XXXX策略：選育維生素缺點(diǎn)型酵母目標(biāo)：積累丙酮酸代謝調(diào)控緒論第18頁10:34:09Nissen等在Azotobactervinelandii

基因雙缺失型菌株中構(gòu)建了一個(gè)產(chǎn)生NAD+新路徑，使甘油降低40%。3-磷酸甘油醛脫氫酶（GDP1和GDP2基因）NAD+←←③構(gòu)建代謝旁路代謝調(diào)控緒論第19頁10:34:09④改變能量代謝路徑丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提升42.9%發(fā)酵時(shí)間縮短23%抑制氧化磷酸化路徑提升酵解速度丙酮酸生產(chǎn)強(qiáng)度提升42.9%發(fā)酵時(shí)間縮短23%代謝調(diào)控緒論第20頁10:34:09Okumagai等從巴斯德畢赤氏酵母中分離了一個(gè)不受乙醇阻遏醇氧化酶基因(AOX1)開啟子表示淀粉酶基因使淀粉酶分泌量大大提升，這個(gè)工程菌能夠由淀粉直接發(fā)酵乙醇，以3％淀粉最少產(chǎn)生2％乙醇。⑤延伸代謝路徑代謝調(diào)控緒論第21頁10:34:09P.stipitis中分離到木糖還原酶基因XYL1和木糖醇脫氫酶XYL2基因,將其克隆進(jìn)S.cerevisiae。木糖還原酶木糖醇脫氫酶⑥構(gòu)建新生物合成途徑木糖還原酶木糖醇脫氫酶代謝調(diào)控緒論第22頁10:34:09①正向代謝工程問題提出天然存在各種基因或經(jīng)改造各種新基因足于應(yīng)付代謝工程需要，但要使代謝工程目標(biāo)真正實(shí)現(xiàn)卻只有極少一個(gè)別基因有效，要找到這一小個(gè)別基因無益大海撈針。對(duì)于復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，傳統(tǒng)代謝工程思緒碰到了難題。4、正向代謝工程面臨挑戰(zhàn)及發(fā)展趨勢代謝調(diào)控緒論第23頁10:34:091996年BaileyJE首次提出“反向代謝工程”概念②反向代謝工程興起代謝調(diào)控緒論第24頁10:34:09反向代謝工程基礎(chǔ)思想是：對(duì)試驗(yàn)室菌株（或野生型）突變、定向進(jìn)化和定向篩選，取得預(yù)期表型，并確定其基因型。選擇工業(yè)菌株并對(duì)其對(duì)應(yīng)基因進(jìn)行遺傳操作，以期取得一樣表型。代謝調(diào)控緒論第25頁10:34:09當(dāng)前為止，反向代謝工程在很多方面應(yīng)用都取得成功。逆代謝工程防止了對(duì)復(fù)雜代謝網(wǎng)絡(luò)充分認(rèn)識(shí)過程，處理了許多正向代謝工程思緒處理不了問題。代謝調(diào)控緒論第26頁10:34:09Khosla和Bailey：專性需氧透明顫菌在限氧條件下合成了大量透明顫菌血紅蛋白VHb合成血紅蛋白可能是透明顫菌在氧限制條件下提升代謝和生長一個(gè)“基因策略”表示VHb大腸桿菌在限氧條件下可到達(dá)較高生長密度將該血紅蛋白基因克隆到一系列需氧工業(yè)微生物中。實(shí)例代謝調(diào)控緒論第27頁10:34:09在大家并不知道VHb產(chǎn)生路徑及影響機(jī)制前提下，上述方法成功處理了限氧瓶頸。正是這些成功實(shí)例推進(jìn)了對(duì)VHb重新認(rèn)識(shí)。代謝調(diào)控緒論第28頁10:34:09逆代謝工程關(guān)鍵在于確定希望表型遺傳基礎(chǔ)。微生物和細(xì)胞培養(yǎng)積累關(guān)于遺傳刺激表型反應(yīng)數(shù)據(jù)庫，以及標(biāo)準(zhǔn)微生物系統(tǒng)遺傳、生理和生物化學(xué)特征方面研究結(jié)果，加上高度自動(dòng)化當(dāng)代分析工具，將使基因和表型之間相關(guān)性分析變得越來越輕易。代謝工程前景

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蛋白質(zhì)工程興起，使代謝工程僅僅利用天然存在基因克隆這一局限將被打破，從而解除原有細(xì)胞代謝很多限制原因。這種逆向思維已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了逆代謝工程創(chuàng)建之初構(gòu)想，并將成為代謝工程研究主流方向。代謝調(diào)控緒論第30頁10:34:095.課程主要內(nèi)容1、緒論2、代謝控制發(fā)酵基礎(chǔ)思想3、代謝控制發(fā)酵育種基礎(chǔ)技術(shù)4、糖代謝與控制5、脂類代謝與控制6、氨基酸代謝與控制7、核酸類物質(zhì)代謝控制與發(fā)酵8、抗生素發(fā)酵代謝與控制代謝調(diào)控緒論第31頁10:34:091、抓住課程內(nèi)容基礎(chǔ)邏輯結(jié)構(gòu)2、認(rèn)真了解和體會(huì)其中原理和技術(shù)3、結(jié)合實(shí)例深入鞏固所學(xué)理論4、課后要及時(shí)復(fù)習(xí)和總結(jié)所學(xué)習(xí)知識(shí)學(xué)習(xí)方法代謝調(diào)控緒論第32頁10:34:09參考書目使用教材：張克旭等編著《代謝控制發(fā)酵》

中國輕工業(yè)出版社，年參考書目：陶文沂編著《工業(yè)微生物生理與遺傳育種學(xué)》

中國輕工業(yè)出版社，1997年王鏡巖等編著《生物化學(xué)》（第三版）高等教育出版社，年