中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座

中國(guó)極地微生物學(xué)考查研究簡(jiǎn)史

從1981年起,中國(guó)微生物學(xué)家即涉足南極,并于1987年發(fā)表了第一篇論文(Nichuzhietal.,1987),即《ThehetertrophicmicrobesindryVictorialandandRossIslandAntarctica》；1984年之前,中國(guó)學(xué)者曾參加南大洋水體細(xì)菌和生物量考查,并發(fā)表過(guò)數(shù)篇論文；從1984年起,中國(guó)開(kāi)始獨(dú)立組隊(duì)進(jìn)行南極考查,中國(guó)海洋微生物學(xué)家參加了相關(guān)考查活動(dòng)；上世紀(jì)末,我們進(jìn)行了中國(guó)首次北極考查,微生物研究涉足北極地域(50年代吳寶鈴先生曾隨前蘇聯(lián)學(xué)者赴北極作過(guò)考查),并發(fā)表過(guò)論文；中國(guó)南北極微生物考查研究結(jié)果為掌握極地微生物基本情況,及研究全球改變對(duì)該特定生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)影響奠定了初步基礎(chǔ)；本世紀(jì)初,中國(guó)學(xué)者又開(kāi)始關(guān)注世界第三極—青藏高原微生物及其環(huán)境情況。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第1頁(yè)（一）類別當(dāng)前中國(guó)所取得南極微生物主要類別見(jiàn)表2。中國(guó)極地微生物調(diào)查研究主要結(jié)果

中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第2頁(yè)中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第3頁(yè)由該表可見(jiàn),研究微生物以細(xì)菌為主,次為菌物(即真菌)。不完全統(tǒng)計(jì)表明所研究細(xì)菌大約有38屬(種),絲狀菌物6屬,酵母8屬(種),另外還有腸系細(xì)菌。不一樣功效類型微生物包含固氮細(xì)菌、硝化細(xì)菌、石油烴降解菌、耐重金屬菌、耐LPS菌、耐酸菌及衛(wèi)生情況指示菌等等。南極微生物優(yōu)勢(shì)菌群：α、β-變性細(xì)菌群，噬纖維菌-黃桿菌-擬桿菌群（CFBgroup）。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第4頁(yè)（二）極地生態(tài)環(huán)境與環(huán)境微生物學(xué)研究這方面研究主要將微生物置于整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)中分析,如南極磷蝦集群過(guò)程、集群區(qū)及磷蝦本身微生物學(xué)研究，,在潮間帶生態(tài)系統(tǒng)、食物鏈中作用,菲爾德斯半島及附近區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)中微生物多樣性、生態(tài)結(jié)構(gòu)特征、食物鏈及與生物/非生物因子間關(guān)系分析(吳寶鈴等,1998)。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第5頁(yè)（三）極地微生物開(kāi)發(fā)利用研究1、抗凍物質(zhì)冷適應(yīng)微生物最顯著特征便是含有相對(duì)低代謝速率，在長(zhǎng)久生物進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列適應(yīng)低溫機(jī)制。這些機(jī)制包含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)、DNA復(fù)制合成、蛋白質(zhì)合成、合成代謝和分解代謝正常進(jìn)行、能量代謝正常進(jìn)行、細(xì)胞分裂等。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第6頁(yè)2、多不飽和脂肪酸(PolyUnsaturatedFattyAcids，PUFA)含有廣泛而主要生物功效，這已經(jīng)被越來(lái)越多人所認(rèn)識(shí)。然而伴隨PUFA開(kāi)發(fā)應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)大，來(lái)自于植物、哺乳動(dòng)物和海洋魚PUFA遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)需求，微生物尤其是藻類、真菌能合成幾乎全部PUFA并能在工業(yè)規(guī)模上培育而被視為有開(kāi)發(fā)價(jià)值可替換生物資源。在南極細(xì)菌中含有多聚不飽和脂肪酸(PUEA)生成能力細(xì)菌所占百分比高于其在溫帶海洋細(xì)菌中百分比。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第7頁(yè)3、抗紫外輻射物質(zhì)在南極上空臭氧層最薄時(shí)厚度僅為平時(shí)50%，并出現(xiàn)了臭氧空洞，從而使UV一B總輻照度百分比增加uv一B對(duì)藻類傷害主要目標(biāo)是藻細(xì)胞中分子中蛋白質(zhì)、色素、DNA等，抑制光合作用、生長(zhǎng)發(fā)育，甚至造成細(xì)胞死亡。為了防止或降低UV輻射，生活在高輻射環(huán)境下生物體形成了許多物理或者化學(xué)保護(hù)機(jī)制。Scytonemin、MAAs是兩類抗輻射物質(zhì)，假如提取這種化合物、了解其吸收紫外線機(jī)理，有望將其作為預(yù)防紫外線保護(hù)劑應(yīng)用到化裝品中。類胡蘿卜素在保護(hù)細(xì)胞和生物體免受光、氣體和感光色素等損傷中起主要作用。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第8頁(yè)4、低溫酶低溫酶低溫催化能力，低熱穩(wěn)定性使其在工業(yè)應(yīng)用上有以下優(yōu)勢(shì):經(jīng)過(guò)溫和熱處理使低溫酶失活，快速而經(jīng)濟(jì)地終止反應(yīng);生產(chǎn)過(guò)程在低溫或室溫下進(jìn)行，無(wú)需加熱和冷卻，能夠降低成本;生產(chǎn)過(guò)程便于監(jiān)控。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第9頁(yè)5、抗菌、抗腫瘤活性物質(zhì)據(jù)統(tǒng)計(jì)，人們己經(jīng)從微生物中發(fā)覺(jué)了8000各種含有抗菌和抗腫瘤活性天然產(chǎn)物。然而，從陸生微生物中新發(fā)覺(jué)生物活性物質(zhì)種類正在降低，而且大部分是己知化合物。另首先，越來(lái)越多傳染性病菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素逐步產(chǎn)生了抗藥性，威脅人類健康三大疾病之一癌癥也難以找到有效治療藥品，從而迫使生物學(xué)家尋找新天然生物活性物質(zhì)來(lái)處理當(dāng)前面臨問(wèn)題。所以，極地微生物因?yàn)楹歇?dú)特生理機(jī)制而成為最有希望為人類提供產(chǎn)生含有生物活性新化合物微生物資源寶庫(kù)之一中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第10頁(yè)傳統(tǒng)環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究方法采取計(jì)數(shù)、微生物培養(yǎng)及判定，生理生化分析等伎倆進(jìn)行，這些方法在很大程度上依賴于微生物培養(yǎng)和純種分離技術(shù)。純培養(yǎng)極難，尤其是在南北極這么極端環(huán)境中?，F(xiàn)有研究認(rèn)為在自然界中僅有0.001%一1%微生物能夠用現(xiàn)有技術(shù)伎倆進(jìn)行人工培養(yǎng)。而且經(jīng)過(guò)平板培養(yǎng)微生物有機(jī)體還有可能會(huì)偏離原來(lái)自然種群生理習(xí)性，甚至有可能偏離它們?cè)瓉?lái)基因型組合。伴隨各種分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用，使我們無(wú)須培養(yǎng)微生物，而直接經(jīng)過(guò)對(duì)環(huán)境中遺傳物質(zhì)研究來(lái)到達(dá)目標(biāo)，也為從分子水平上開(kāi)展較為全方面、無(wú)偏差微生物生態(tài)學(xué)研究開(kāi)辟了新路徑。極端環(huán)境微生物分子研究方法及進(jìn)展中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第11頁(yè)（一）從自然樣品中直接提取核酸：從環(huán)境樣品中提取核酸方法可分為兩類，一是轉(zhuǎn)移后裂解法，即先將微生物菌體與土壤顆粒分開(kāi)，再提取DNA。另一類是直接裂解法，即在土壤中直接裂解微生物菌體后提取DNA。相比之下，直接裂解法能夠提取出沉積物樣品中近乎全部微生物種群，且DNA產(chǎn)量大。在高效裂解細(xì)胞同時(shí)對(duì)己釋放出DNA不予破壞是提升DNA產(chǎn)出率決定原因。當(dāng)前己報(bào)道裂解法有碾磨法、超聲波裂解法、液氮凍融法、變性劑熱裂解法、酶解法等。需要提取DNA方法中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第12頁(yè)（二）分子生物學(xué)分析1.DNA熔解(解鏈)及復(fù)性分析該方法可應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析。經(jīng)過(guò)測(cè)定整個(gè)群落堿基組成和DNA復(fù)雜性可預(yù)計(jì)出總?cè)郝溥z傳結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜性。分析DNA熔解曲線能夠得到堿基組成于G+C%。在限定條件下，測(cè)定溶液中剪切或熱失活DNA復(fù)性動(dòng)力學(xué)能夠測(cè)定DNA序列復(fù)雜性。2.質(zhì)粒指紋圖譜分析:質(zhì)粒大小和數(shù)目隨物種不一樣有所差異。質(zhì)粒數(shù)是相對(duì)穩(wěn)定,它可用來(lái)區(qū)分同一物種不一樣菌株。3.低分子量RNA分布圖這種方法為tRNA(75-90%個(gè)核苷酸)和5SrRNA(105-120個(gè)核苷酸)雙相電泳分離。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第13頁(yè)4.結(jié)合PCR一些技術(shù)：克隆文庫(kù)分析法限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP)末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP)變性梯度凝膠電泳(DGGE)或者溫度梯度凝膠電泳(TGGE)單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性分析(RAPD)將兩種以上上述分子生物學(xué)方法結(jié)合利用。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第14頁(yè)①克隆文庫(kù)分析法主要步驟包含：(1)樣品中總DNA提?。?2)建立16SrRNA基因克隆文庫(kù)；(3)以限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切篩選文庫(kù)；(4)測(cè)序；(5)序列比較分析。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第15頁(yè)②變性梯度凝膠電泳(DGGE)或者溫度梯度凝膠電泳(TGGE)在含有連續(xù)變性劑梯度或者連續(xù)溫度梯度凝膠中，加入雙鏈PCR產(chǎn)物，依據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中不一樣G+C含量DNA組分在凝膠中移動(dòng)速度不一樣，直接反應(yīng)DNA多態(tài)性。低G+C含量組分在凝膠中變性較快，在凝膠中移動(dòng)速度較慢，高G+C含量DNA在凝膠中變性較慢，在凝膠中移動(dòng)速度快，從而使不一樣DNA在凝膠中位置不一樣，產(chǎn)生不一樣帶。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究中，包含微生物群落多樣性研究、環(huán)境改變對(duì)微生物群落影響研究比較不一樣微環(huán)境微生物群落差異等。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第16頁(yè)《南極中山站沉積物中微生物多樣性分析及宏基因組文庫(kù)研究》1.南極沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)調(diào)查：DNA提取純化、PCR擴(kuò)增、DGGE、序列測(cè)定和系統(tǒng)計(jì)劃關(guān)系分析。2.南極中山站排污入?？诔练e物中微生物宏基因組文庫(kù)構(gòu)建和研究：沉積物中總DNA提取、大片段目標(biāo)DNA篩選和回收、插入DNA片段末端補(bǔ)平、連接、體外包裝。cosmid宏基因組文庫(kù)保留和陽(yáng)性克隆篩選、宏基因組文庫(kù)評(píng)定、宏基因組文庫(kù)中抗菌活性物質(zhì)篩選、宏基因組文庫(kù)中抗腫瘤活性物質(zhì)篩選、宏基因組文庫(kù)中酶活篩選。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第17頁(yè)《北極深海沉積物中細(xì)菌多樣性研究》對(duì)溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法等5種方法提取北極深海沉積物宏基因組DNA進(jìn)行了比較;并對(duì)沉積物宏基因組中16SrDNA基因PCR擴(kuò)增相關(guān)引物序列、引物濃度、退火溫度和模板稀釋度等條件，以及PCR產(chǎn)物變性梯度凝膠電泳(DenaturingGradientGelElectrophoresis，DGGE)聚丙烯酞胺凝膠濃度、變性劑濃度梯度進(jìn)行了優(yōu)化。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第18頁(yè)1.溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法1mLTENP緩沖液(50mMTris，pH8.0，20mMEDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP)等5種方法提取北極深海沉積物宏基因組DNA。2.沉積物宏基因組DNA純化（腐殖酸是土壤DNA提取過(guò)程中極難去除污染物，在PCR擴(kuò)增時(shí)，極少許腐殖酸，就會(huì)抑制DNA聚合酶活性，干擾擴(kuò)增結(jié)果）①電泳切膠回收②PEG8000純化在上述粗提沉積物DNA溶液中加入20μL4MNaCl溶液與80μL13%PEG8000溶液(w/v)，冰浴放置30min;10000r/min離心15mim搜集沉淀;用70%酒精洗沉淀后11000r/min離心l0min;用滅菌濾紙條干燥沉淀;加入40μLTEbuffer。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第19頁(yè)3.16SrDNA基因PCR擴(kuò)增4.16SrDNA基因PCR產(chǎn)物DGGE檢測(cè)？5.優(yōu)勢(shì)條帶回收及PCR擴(kuò)增6.回收條帶克隆7.感受態(tài)細(xì)胞制備8.PCR產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化9.質(zhì)粒DNA提取10.陽(yáng)性克隆判定11.16SrDNAV3-V5區(qū)PCR擴(kuò)增及DGGE再判定確定位置？12.測(cè)序，序列分析，建樹中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第20頁(yè)DGGE變性劑濃度選擇，電泳時(shí)間選擇，染色方法選擇電泳時(shí)間選擇：采取了時(shí)間間歇(timetravel)方法，每隔一小時(shí)加一次樣，最終依據(jù)圖譜清楚分離度來(lái)確定出最適當(dāng)時(shí)間。染色方法選擇：EB染色后所顯現(xiàn)條帶要少一些（只能染雙鏈DNA，不能染單鏈DNA），所以這種方法靈敏度要低一些。相較而言，銀染法靈敏度就高了（因?yàn)樗鼏坞p鏈DNA都能染色）。不過(guò)它無(wú)法順利從條帶中回收出DNA。因次在構(gòu)建和觀察指紋圖譜時(shí)采取銀染法。在要做回收克隆測(cè)序工作時(shí)，則采取EB染色。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第21頁(yè)③限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(RFLP,RestrictionFragmentLengthPolymorphism)

RFLP技術(shù)基本原理是依據(jù)不一樣生物個(gè)體或種群之間DNA片段酶切位點(diǎn)有所差異特點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不一樣限制性片段，然后對(duì)這些特定DNA片段限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物進(jìn)行分析。凡是能夠引發(fā)酶切位點(diǎn)變異突變包含點(diǎn)突變(新產(chǎn)生和去除酶切位點(diǎn))、基因插人或缺失(插入和缺失造成酶切位點(diǎn)間長(zhǎng)度發(fā)生改變)等均可造成多態(tài)性產(chǎn)生。將PCR技術(shù)與RFLP分析相結(jié)合，用于研究環(huán)境中微生物多樣性及群落分布，詳細(xì)方法是采取特定引物，如16SrRNA基因通用引物對(duì)環(huán)境樣品總基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用不一樣限制性內(nèi)切酶酶切，經(jīng)過(guò)電泳分析比較酶切帶型，對(duì)特殊帶型序列進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)而了解該樣品中所包含微生物序列信息。該方法廣泛用于環(huán)境微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)研究。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第22頁(yè)末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析(T-RFLP,TerminalRestrictionFragmentLengthPolymorphism)T-RFLP技術(shù)與RFLP技術(shù)基本原理類似，不一樣只是在其中一條PCR引物末端加上熒光標(biāo)記，如TET(4,7,2,7-tetrachloro-6-carboxyfluorescein)，6-FAM(phosphoramiditefluorochrome5-carboxyfluorescein)等。在對(duì)目標(biāo)基因如16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后一樣采取不一樣限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，產(chǎn)生不一樣長(zhǎng)度片段，電泳結(jié)果在測(cè)序儀上用基因掃描程序進(jìn)行掃描，只有那些末端帶有熒光標(biāo)識(shí)片段能夠被檢測(cè)到。簡(jiǎn)化了圖譜，就能夠用來(lái)分析復(fù)雜微生物群落，以及能提供一些多樣性信息，因?yàn)槊恳粋€(gè)可見(jiàn)條帶都代表一個(gè)單個(gè)OTU或核糖體類型。經(jīng)過(guò)這個(gè)圖譜，能夠計(jì)算種豐度，均度，以及樣品之間相同性。這一技術(shù)能自動(dòng)分析大量土壤樣品，包含點(diǎn)樣和分析。當(dāng)前T-RFLP技術(shù)在微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)研究方面應(yīng)用非常廣泛。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第23頁(yè)《東_西太平洋深海沉積物細(xì)菌多樣性研究》采取土壤DNA快速提取試劑盒對(duì)樣品DNA進(jìn)行了提取→瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)→16SrRNA基因序列PCR擴(kuò)增（用FAM標(biāo)識(shí)引物27F（5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和無(wú)標(biāo)識(shí)引物926R（5‘-CCGTCAATTCATTTGAGT-3’）作為PCR擴(kuò)增引物對(duì)）→PCR產(chǎn)物純化與上樣純化（產(chǎn)物分別用HhaI和MspI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，并于37℃過(guò)夜。酶切產(chǎn)物分別用乙醇沉淀濃縮（乙醇終濃度為70%）。濃縮后酶切產(chǎn)物用3100基因分析儀（ABI,USA）進(jìn)行T-RFLP分析。Liz-500作為T-RFLP分析分子內(nèi)標(biāo)）→末端限制性片段（T-RFs）統(tǒng)計(jì)與聚類分析（每一個(gè)峰即代表一個(gè)末端限制性片段，而且統(tǒng)計(jì)數(shù)值采取二元統(tǒng)計(jì)（有峰計(jì)為1；無(wú)峰計(jì)為0），按照統(tǒng)計(jì)數(shù)值進(jìn)行聚類分析，以分析研究不一樣層位細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。）中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第24頁(yè)16SrRNA基因文庫(kù)構(gòu)建及序列分析感受態(tài)細(xì)胞制備→細(xì)菌16SrRNA基因片斷擴(kuò)增→PCR產(chǎn)物純化與連接→重組載體轉(zhuǎn)化→擴(kuò)增16SrRNA基因基因限制性酶切分析用水煮法快速提取細(xì)胞中基因組DNA，用特定引物進(jìn)行PCR檢測(cè)篩選克隆是否是陽(yáng)性克隆以及插入片段大小是否正確，片斷大小適當(dāng)PCR產(chǎn)物分別用MspI和HhaI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。依據(jù)酶切帶型判斷分類學(xué)單元（OTUs）多少。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第25頁(yè)→多樣性覆蓋率分析與稀釋曲線分析構(gòu)建16SrRNA基因文庫(kù)多樣性覆蓋百分率用公式：[1－(m/N)]×100計(jì)算，其中m是指每個(gè)16SrRNA基因文庫(kù)中OTUs數(shù)目，N是指每個(gè)文庫(kù)總克隆數(shù)。百分率越高表明文庫(kù)多樣性覆蓋率越高?！?6SrRNA基因測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化分析經(jīng)過(guò)兩對(duì)引物確定目標(biāo)基因插入方向，從而確定測(cè)序引物中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第26頁(yè)當(dāng)然僅僅依靠16SrDNA序列評(píng)定微生物多樣性并不完全可靠，比如16SrDNA序列同源>98%，也可能是兩個(gè)完全不一樣菌屬同時(shí)同種物種(古菌)也有可能相同性差異度到達(dá)5%。熒光原位雜交（FISH）：是一個(gè)不依賴于PCR分子生物學(xué)分析技術(shù)，能夠較為準(zhǔn)確快速和動(dòng)態(tài)觀察微生物種群改變，并同時(shí)提供形態(tài)數(shù)量和空間分布方面信息，同時(shí)能夠克服核酸提取和PCR擴(kuò)增過(guò)程中存在偏差。1.熒光顯微鏡2.流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FCM）選擇不一樣單克隆抗體及熒光染料，能夠利用流式細(xì)胞儀同時(shí)測(cè)定一個(gè)細(xì)胞上多個(gè)不一樣特征，它能夠高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能同時(shí)從一個(gè)細(xì)胞中測(cè)得多個(gè)參數(shù)，與傳統(tǒng)熒光鏡檢驗(yàn)相比，含有速度快、精度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，成為當(dāng)代最先進(jìn)細(xì)胞定量分析技術(shù)。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第27頁(yè)潛在問(wèn)題：1.核酸回收過(guò)程中偏差，并非全部類群細(xì)胞都能同等有效裂解，另外，與核酸一起被提取出來(lái)腐殖質(zhì)會(huì)干擾隨即酶處理步驟。2.PCR及克隆過(guò)程中產(chǎn)生偏差，因?yàn)镻CR對(duì)一些模板擴(kuò)增含有有限性，從而造成對(duì)rRNA基因自然豐度預(yù)計(jì)會(huì)產(chǎn)生潛在偏差?？赡芤?jiàn)面臨不一樣物種基因序列相互集結(jié)形成聚合物危險(xiǎn)，PCR技術(shù)還面臨著污染問(wèn)題。因?yàn)椴灰粯蛹?xì)菌其染色體上rRNA基因操縱元拷貝數(shù)并不一樣，從而依據(jù)特定rDNA克隆相對(duì)豐度來(lái)估算其對(duì)應(yīng)種群相對(duì)豐度必定也會(huì)產(chǎn)生偏差。中國(guó)極地微生物的研究進(jìn)展專家講座第28頁(yè)