蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第1頁概述

蛋白質(zhì)是對(duì)生命至關(guān)主要一類生物大分子物質(zhì)，各種生命功效、生命現(xiàn)象、生命活動(dòng)都和蛋白質(zhì)相關(guān)。在生命有機(jī)體催化、運(yùn)動(dòng)、結(jié)構(gòu)、識(shí)別和調(diào)整等許多方面，起著關(guān)鍵作用。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第2頁酶.幾乎全都是蛋白質(zhì)。肌肉收縮、精子移動(dòng)、細(xì)胞分裂過程中染色體移動(dòng).高等生物有序生長和分化過程?？贵w蛋白能識(shí)別和結(jié)合特異性外源物質(zhì)，使人體具備抵抗各種細(xì)菌、真菌和病毒能力。由神經(jīng)細(xì)胞膜蛋白組成離子通道，負(fù)責(zé)神經(jīng)沖動(dòng)形成和傳導(dǎo)。血紅蛋白含有結(jié)合和釋放氧能力，是血液中氧、二氧化碳和氫離子攜帶者。另外，人體毛發(fā)和指甲屬于角蛋白，而血栓是由血纖蛋白單體聚合而成。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第3頁蛋白質(zhì)生物學(xué)功效1.催化功效：酶2.調(diào)整功效：激素3.結(jié)構(gòu)功效：皮、毛、骨、牙、細(xì)胞骨架4.運(yùn)輸功效：血紅蛋白5.免疫功效：免疫球蛋白6.運(yùn)動(dòng)功效：鞭毛、肌肉蛋白7.儲(chǔ)備功效：酪蛋白8.生物膜功效：及神經(jīng)傳導(dǎo)等蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第4頁

蛋白質(zhì)是生命表達(dá)者，離開了蛋白質(zhì)，生命將不復(fù)存在。可是，生物體內(nèi)存在天然蛋白質(zhì)，有往往不盡人意，需要進(jìn)行改造。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由許多氨基酸按一定次序連接而成，每一個(gè)蛋白質(zhì)有自己獨(dú)特氨基酸次序，所以改變其中關(guān)鍵氨基酸就能改變蛋白質(zhì)性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定，只要改變組成遺傳密碼一個(gè)或兩個(gè)堿基就能到達(dá)改造蛋白質(zhì)目標(biāo)。蛋白質(zhì)工程一個(gè)主要路徑就是依據(jù)大家需要，對(duì)負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)基因重新進(jìn)行設(shè)計(jì)，使合成蛋白質(zhì)變得更符合人類需要。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第5頁一、蛋白質(zhì)工程崛起緣由1、基因工程產(chǎn)物基因工程在標(biāo)準(zhǔn)上只能生產(chǎn)自然界已存在蛋白質(zhì)。

這些天然蛋白質(zhì)是生物在長久進(jìn)化過程中形成,它們結(jié)構(gòu)和功效符合特定物種生存需要,卻不一定完全符合人類生產(chǎn)和生活需要。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第6頁實(shí)例1：玉米中賴氨酸含量比較低

假如對(duì)賴氨酸合成過程中兩個(gè)關(guān)鍵酶進(jìn)行改造,能夠使玉米葉片和種子中游離賴氨酸分別提升5倍和2倍。

原因：賴氨酸合成過程中兩個(gè)關(guān)鍵酶——天冬氨酸激酶和二氫吡啶二羧酸合成酶活性，受細(xì)胞內(nèi)賴氨酸濃度影響。當(dāng)賴氨酸濃度到達(dá)一定量時(shí)，就會(huì)抑制這兩種酶活性。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第7頁實(shí)例2:工業(yè)用酶在已研究過幾千種酶中，只有極少數(shù)能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，絕大多數(shù)酶都不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，這些酶即使在自然狀態(tài)下有活性，但在工業(yè)生產(chǎn)中沒有活性或活性很低。這是因?yàn)楣I(yè)生產(chǎn)中每一步反應(yīng)體系中經(jīng)常會(huì)有酸、堿或有機(jī)溶劑存在，反應(yīng)溫度較高，在這種條件下，大多數(shù)酶會(huì)很快變性失活。提升蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是工業(yè)生產(chǎn)中一個(gè)非常主要課題。普通來說，提升蛋白質(zhì)穩(wěn)定性包含：延長酶半衰期，提升酶熱穩(wěn)定性，延長藥用蛋白保留期，抵抗因?yàn)橹饕被嵫趸l(fā)活性喪失等。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第8頁3、蛋白質(zhì)工程產(chǎn)物是自然界原本不存在新蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第9頁

你知道人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃嗎？它與蛋白質(zhì)工程有什么關(guān)系？我國科學(xué)家負(fù)擔(dān)了什么任務(wù)？

人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃是繼人類基因組計(jì)劃之后，生命科學(xué)乃至自然科學(xué)領(lǐng)域一項(xiàng)重大科學(xué)命題。年，國際人類蛋白質(zhì)組組織宣告成立。之后，該組織正式提出開啟了兩項(xiàng)重大國際合作行動(dòng)：一項(xiàng)是由中國科學(xué)家牽頭執(zhí)行“人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”；另一項(xiàng)是以美國科學(xué)家牽頭執(zhí)行“人類血漿蛋白質(zhì)組計(jì)劃”，由此拉開了人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃帷幕。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第10頁“人類肝臟蛋白質(zhì)組計(jì)劃”是國際上第一個(gè)人類組織／器官蛋白質(zhì)組計(jì)劃，由我國賀福初院士牽頭，這是中國科學(xué)家第一次領(lǐng)銜重大國際科研協(xié)作計(jì)劃，總部設(shè)在北京，當(dāng)前有16個(gè)國家和地域80多個(gè)試驗(yàn)室報(bào)名參加。它科學(xué)目標(biāo)是揭示并確認(rèn)肝臟蛋白質(zhì)，為重大肝病預(yù)防、診療、治療和新藥研發(fā)突破提供主要科學(xué)基礎(chǔ)。人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃深入研究將是對(duì)蛋白質(zhì)工程有力推進(jìn)和理論支持。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第11頁思索：對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，你認(rèn)為應(yīng)該直接對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行操作，還是經(jīng)過對(duì)基因操作來實(shí)現(xiàn)？應(yīng)該從對(duì)基因操作來實(shí)現(xiàn)對(duì)天然蛋白質(zhì)改造，主要原因以下：（1）任何一個(gè)天然蛋白質(zhì)都是由基因編碼，改造了基因即對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行了改造，而且改造過蛋白質(zhì)能夠遺傳下去。假如對(duì)蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造過蛋白質(zhì)分子還是無法遺傳。（2）對(duì)基因進(jìn)行改造比對(duì)蛋白質(zhì)直接改造要輕易操作，難度要小得多。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第12頁二、蛋白質(zhì)工程基礎(chǔ)原理1、蛋白質(zhì)工程目標(biāo)

依據(jù)大家對(duì)蛋白質(zhì)功效特定需求，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子設(shè)計(jì)。2、天然蛋白質(zhì)合成過程DNA（基因）轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯蛋白質(zhì)基因→表示（轉(zhuǎn)錄和翻譯）→形成氨基酸序列多肽鏈→形成含有高級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)→行使生物功效蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第13頁中心法則

（centraldogma）生物遺傳信息從DNA傳遞給mRNA過程稱為轉(zhuǎn)錄。依據(jù)mRNA鏈上遺傳信息合成蛋白質(zhì)過程，被稱為翻譯和表示。1958年Crick將生物遺傳信息這種傳遞方式稱為中心法則。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第14頁

復(fù)制：是親代雙鏈DNA按堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確形成兩個(gè)相同核苷酸序列子代DNA分子過程。兩條DNA鏈都可作為復(fù)制模板。

轉(zhuǎn)錄：是以一條DNA鏈為模板，將DNA鏈上儲(chǔ)存遺傳信息按堿基配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)準(zhǔn)確轉(zhuǎn)換成互補(bǔ)mRNA過程。

翻譯：是以mRNA為模板，將mRNA上遺傳信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)氨基酸序列過程。

中心法則：遺傳信息由DNAmRNA蛋白質(zhì)流動(dòng)路徑。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第15頁蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA中心法則：遺傳信息由DNAmRNA蛋白質(zhì)流動(dòng)路徑。補(bǔ)充和完善之處：A：RNA作為遺傳物質(zhì)能自我復(fù)制，并作為mRNA指導(dǎo)PRO合成。

B：RNA能以逆轉(zhuǎn)錄方式將遺傳信息傳遞給DNA分子。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第16頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第17頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第18頁３、蛋白質(zhì)工程基礎(chǔ)路徑預(yù)期蛋白質(zhì)功效設(shè)計(jì)預(yù)期蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)推測(cè)應(yīng)有氨基酸序列找到相對(duì)應(yīng)脫氧核苷酸序列（基因）蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第19頁討論：某多肽鏈一段氨基酸序列是：…—丙氨酸—色氨酸—賴氨酸—甲硫氨酸—苯丙氨酸—…（1）怎樣得出決定這一段肽鏈脫氧核苷酸序列？請(qǐng)把對(duì)應(yīng)堿基序列寫出來。首先應(yīng)該依據(jù)三聯(lián)密碼子推出mRNA序列，每種氨基酸都有對(duì)應(yīng)三聯(lián)密碼子，只要查一下遺傳密碼子表，就能夠?qū)⑸鲜霭被嵝蛄芯幋a序列查出來。再依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律推出脫氧核苷酸序列。不過因?yàn)樯鲜霭被嵝蛄兄杏袔讉€(gè)氨基酸是由多個(gè)三聯(lián)密碼子編碼，所以其堿基排列組合起來就比較復(fù)雜，最少能夠排列出16種。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第20頁密碼子：UCAUGAUUAmRNA密碼子密碼子密碼子mRNA上決定一個(gè)氨基酸三個(gè)相鄰堿基密碼子總數(shù)：43=64種(其中61種密碼子是對(duì)應(yīng)氨基酸

和起始；另有3個(gè)不對(duì)應(yīng)氨基酸，只對(duì)應(yīng)終止)1種密碼子只對(duì)應(yīng)1種氨基酸；

1種氨基酸能夠?qū)?yīng)各種密碼子。

密碼子在生物界基礎(chǔ)是是通用。這也是生物彼此間存在親緣關(guān)系證據(jù)之一。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第21頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第22頁GCU（或C或A或G）UGGAAA（或G）AUGUUU（或C）mRNA序列脫氧核苷酸序列GCT(或C或A或G)TGGAAA(或G)ATGTTT(或C)CGA(或G或T或C)ACCTTT（或C)TACAAA(或G)（2）確定目標(biāo)基因堿基序列后，怎樣才能合成或改造目標(biāo)基因（DNA）？確定目標(biāo)基因堿基序列后，就能夠依據(jù)人類需要改造它，經(jīng)過人工合成方法或從基因庫中獲取。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第23頁蛋白質(zhì)工程就是以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功效為基礎(chǔ)，利用基因工程伎倆，按照人類本身需要，定向地改造天然蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新、自然界本不存在、含有優(yōu)良特征蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程概念1983年，美國生物學(xué)家額爾默首先提出了“蛋白質(zhì)工程”概念。蛋白質(zhì)工程實(shí)踐依據(jù)DNA指導(dǎo)合成蛋白質(zhì)，所以，大家能夠依據(jù)需要對(duì)負(fù)責(zé)編碼某種蛋白質(zhì)基因進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，使合成出來蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得符合大家要求。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第24頁

蛋白質(zhì)工程是指經(jīng)過生物技術(shù)伎倆對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)或者對(duì)編碼蛋白質(zhì)基因進(jìn)行改造，方便獲更適合人類需要蛋白質(zhì)產(chǎn)品技術(shù)。蛋白質(zhì)工程是指經(jīng)過蛋白質(zhì)化學(xué)、蛋白質(zhì)晶體學(xué)和動(dòng)力學(xué)研究，獲取相關(guān)蛋白質(zhì)物理和化學(xué)等各方面信息，在此基礎(chǔ)上利用生物技術(shù)伎倆對(duì)蛋白質(zhì)DNA編碼序列進(jìn)行有目標(biāo)改造并分離、純化蛋白質(zhì)，從而獲取自然界沒有、含有優(yōu)良性質(zhì)或適合用于工業(yè)生產(chǎn)條件全新蛋白質(zhì)過程。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第25頁5、蛋白質(zhì)工程與基因工程關(guān)系

蛋白質(zhì)工程是在基因工程基礎(chǔ)上，延伸出來第二代基因工程，是包含多學(xué)科綜合科技工程領(lǐng)域。

基因工程是經(jīng)過基因操作把外源基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)生物體內(nèi)，并在其中進(jìn)行表示，它產(chǎn)品是該基因編碼天然存在蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第26頁

蛋白質(zhì)工程就是依據(jù)蛋白質(zhì)精細(xì)結(jié)構(gòu)與功效之間關(guān)系，利用基因工程伎倆，按照人類本身需要，定向地改造天然蛋白質(zhì)，甚至創(chuàng)造新、自然界本不存在、含有優(yōu)良特征蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程自誕生之日起，就與基因工程密不可分。蛋白質(zhì)工程依據(jù)對(duì)分子預(yù)先設(shè)計(jì)方案，經(jīng)過對(duì)天然蛋白質(zhì)基因進(jìn)行改造，來實(shí)現(xiàn)對(duì)它所編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行改造。所以，它產(chǎn)品已不再是天然蛋白質(zhì)，而是經(jīng)過改造、含有了人類所需要優(yōu)點(diǎn)蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第27頁6、蛋白質(zhì)工程與酶工程關(guān)系

絕大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，酶工程與蛋白質(zhì)工程有什么區(qū)分？

酶工程就是指將酶所含有生物催化作用，借助工程學(xué)伎倆，應(yīng)用于生產(chǎn)、生活、醫(yī)療診療和環(huán)境保護(hù)等方面一門科學(xué)技術(shù)。概括地說，酶工程是由酶制劑生產(chǎn)和應(yīng)用兩方面組成。酶工程應(yīng)用主要集中于食品工業(yè)、輕工業(yè)以及醫(yī)藥工業(yè)中。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第28頁

通常所說酶工程是用工程菌生產(chǎn)酶制劑，而沒有經(jīng)過由酶功效來設(shè)計(jì)酶分子結(jié)構(gòu)，然后由酶分子結(jié)構(gòu)來確定對(duì)應(yīng)基因堿基序列等步驟。所以，酶工程重點(diǎn)在于對(duì)已存酶合理充分利用，而蛋白質(zhì)工程重點(diǎn)則在于對(duì)已存在蛋白質(zhì)分子改造。當(dāng)然，伴隨蛋白質(zhì)工程發(fā)展，其結(jié)果也會(huì)應(yīng)用到酶工程中，使酶工程成為蛋白質(zhì)工程一個(gè)別。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第29頁一、

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)分子生物功效，與蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)密不可分。決定蛋白質(zhì)這種特殊生物功效關(guān)鍵原因是它分子構(gòu)象。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第30頁基礎(chǔ)組成單位--氨基酸蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第31頁組成生物體蛋白質(zhì)20種氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸丙氨酸精氨酸天冬酰氨天冬氨酸半胱氨酸谷氨酰胺谷氨酸甘氨酸組氨酸異亮氨酸亮氨酸賴氨酸甲硫氨酸苯丙氨酸脯氨酸絲氨酸蘇氨酸色氨酸酪氨酸纈氨酸蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第32頁2.組成生物體蛋白質(zhì)20種氨基酸2氨基酸英文氨基酸英文賴組脯蘇絲色天冬精LysHisProThrSerTryAspArgLysineHistidineProlineThreonineSerineTryptophanAsparticacidArginine谷纈半胱丙亮酪甲硫(蛋)GluValCysAlaLeuTyrMetGlutamicacidValineCysteineAlanineLeucineTyrosineMethionine甘苯丙GlyPheGlycinePhenylalanine谷酰天冬酰異亮Gln

AsnIleGlutamineAsparagineIsoleucine蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第33頁

肽（肽鍵與肽2)

肽鍵就是由氨基酸α-羧基與相鄰氨基酸α-氨基脫水縮合而形成化學(xué)鍵蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第34頁肽（肽鍵與肽3)肽:氨基酸經(jīng)過肽鍵連結(jié)起來化合物二肽:兩個(gè)氨基酸形成肽三肽:三個(gè)氨基酸形成肽多肽:許多氨基酸形成肽蛋白質(zhì):大多為100個(gè)以上氨基酸組成多肽蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第35頁氨基酸殘基:多肽鏈中不完全氨基酸。氨基酸因?yàn)樾纬呻逆I而失去了一分子水，所以表現(xiàn)出其分子不完整。氨基末端：多肽鏈中含有自由α-氨基一端。簡(jiǎn)稱N-端羧基末端：多肽鏈中含有自由α-羧基一端。簡(jiǎn)稱C-端蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第36頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第37頁蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)是指氨基酸按一定次序經(jīng)過肽鍵相連而成多肽鏈，也是蛋白質(zhì)最基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。每一個(gè)蛋白質(zhì)分子都有自己特有氨基酸組成和排列次序即一級(jí)結(jié)構(gòu)，由這種氨基酸排列次序決定它特定空間結(jié)構(gòu)，也就是蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)等高級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第38頁蛋白質(zhì)分子一級(jí)結(jié)構(gòu)牛胰島素一級(jí)結(jié)構(gòu)1蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第39頁（1）氫鍵：氫原子與負(fù)電性強(qiáng)原子（如氧、氮等）間形成。對(duì)蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象維護(hù)很主要。（2）靜電引力：正負(fù)帶電基團(tuán)之間吸引力。對(duì)蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象穩(wěn)定貢獻(xiàn)不是很大，也稱為離子鍵或鹽鍵（3）范德華力：原子團(tuán)相互靠近時(shí)誘導(dǎo)所致。它改變多樣，對(duì)維持蛋白質(zhì)活性中心構(gòu)象影響很大維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)化學(xué)鍵蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第40頁（4）疏水相互作用：是非極性基團(tuán)為了避開水相而群集在一起作用力。疏水作用是維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)主要原因（5）二硫鍵：作用很強(qiáng)，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起主要作用氫鍵、離子鍵、疏水作用和范德華力等次級(jí)鍵是非共價(jià)鍵肽鍵、二硫鍵、酯鍵等被稱之為共價(jià)鍵蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第41頁蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)

二級(jí)結(jié)構(gòu)是指多肽鏈借助于氫鍵沿一維方向排列成含有周期性結(jié)構(gòu)構(gòu)象，是多肽鏈局部空間結(jié)構(gòu)（構(gòu)象）主要形式：α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲等蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第42頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第43頁β-轉(zhuǎn)角蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第44頁蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)

α螺旋β折疊片β轉(zhuǎn)角自由回轉(zhuǎn)蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第45頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第46頁三級(jí)結(jié)構(gòu)三級(jí)結(jié)構(gòu)是指整條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上深入盤曲而成特定格式三級(jí)結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)很多蛋白質(zhì)分子是由兩個(gè)或兩個(gè)以上獨(dú)立、含有三級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈組成。這些多肽鏈之間只是經(jīng)過疏水作用等次級(jí)鍵結(jié)合成為有序排列特定空間結(jié)構(gòu)，形成了四級(jí)結(jié)構(gòu)。在四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子中，每個(gè)含有三級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈單位稱為亞基，亞基多無生物學(xué)活性，含有完整四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子才有生物活性。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第47頁血紅蛋白中四亞基兩兩相同，分別稱為α1、α2、β1、β2蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第48頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第49頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第50頁蛋白質(zhì)工程主要包含4大類研究：第一，利用已知蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)信息開發(fā)應(yīng)用研究。第二，定量確定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功效關(guān)系。這是當(dāng)前蛋白質(zhì)工程研究主體，它包含蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型建立，酶催化性質(zhì)、蛋白質(zhì)折疊和穩(wěn)定性研究等.第三，從混雜變異體庫中篩選含有特定結(jié)構(gòu)-功效關(guān)系蛋白質(zhì)。第四，依據(jù)已知結(jié)構(gòu)-功效關(guān)系蛋白質(zhì)，用人工方法合成它及其變異體.蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第51頁第二節(jié)蛋白質(zhì)工程基礎(chǔ)步驟

與改造策略

一、

蛋白質(zhì)工程基礎(chǔ)步驟（1）分離純化目標(biāo)蛋白，使之結(jié)晶,進(jìn)行分析,得到其空間結(jié)構(gòu)盡可能多信息。（2）對(duì)目標(biāo)蛋白功效作詳盡研究，確定它功效域。（3）經(jīng)過對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)和功效之間相互關(guān)系分析，找出關(guān)鍵基團(tuán)和結(jié)構(gòu)。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第52頁(4)圍繞這些關(guān)鍵基團(tuán)和結(jié)構(gòu)提出對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造方案，并用基因工程方法去實(shí)施。

(5)對(duì)經(jīng)過改造蛋白質(zhì)進(jìn)行功效性測(cè)定.蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第53頁二、蛋白質(zhì)工程改造策略1、疏水氨基酸經(jīng)常出現(xiàn)在蛋白質(zhì)活動(dòng)中心區(qū)域；α螺旋和β折疊區(qū)通常不會(huì)是酶活性中心以及底物結(jié)合中心，而是作為結(jié)構(gòu)支架；環(huán)區(qū)、轉(zhuǎn)角區(qū)域和帶電荷區(qū)域通常位于蛋白質(zhì)表面。2、進(jìn)行定點(diǎn)突變時(shí)，應(yīng)注意保守氨基酸殘基。假如要改變酶活性、底物結(jié)合活性等高度特異性性質(zhì)，則應(yīng)盡可能保留保守殘基。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第54頁

3、應(yīng)注意保留潛在N糖基化位點(diǎn)(Asn-X-Ser／Thr-X-Pro)中Asn(天門冬酰胺)、Set(絲氨酸)或Thr(蘇氨酸)。

4、對(duì)于含有內(nèi)含子序列，能夠刪除某一外顯子或外顯子組合，因?yàn)閱蝹€(gè)外顯子通常編碼獨(dú)立折疊結(jié)構(gòu)域，刪去該結(jié)構(gòu)域后可能不會(huì)影響蛋白其余個(gè)別正確折疊。

5、構(gòu)建兩個(gè)同源蛋白嵌合體時(shí)，應(yīng)盡可能使其接合部位處于含有相同或相近功效氨基酸序列中；而當(dāng)兩個(gè)非同源蛋白組成嵌合體時(shí)，則應(yīng)使接合個(gè)別盡可能位于所預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)邊緣。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第55頁

6、假如對(duì)目標(biāo)蛋白三維結(jié)構(gòu)一無所知，那么能夠在目標(biāo)序列中隨機(jī)插入六聚體接頭以判定功效性結(jié)構(gòu)域。插入六聚體接頭后，在原蛋白質(zhì)序列中添加兩個(gè)氨基酸，比插入更多氨基酸對(duì)蛋白質(zhì)整體功效破壞要輕。7、進(jìn)行缺失突變時(shí)，應(yīng)防止直接利用天然存在限制性酶切位點(diǎn)進(jìn)行刪除。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第56頁第三節(jié)、蛋白質(zhì)改造方法

在基因水平上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，按改造規(guī)模和程度能夠分為：初級(jí)改造：個(gè)別氨基酸改變和一整段氨基酸序列刪除、置換或插入高級(jí)改造：蛋白質(zhì)分子剪裁，如結(jié)構(gòu)域拼接從頭設(shè)計(jì)合成新型蛋白質(zhì)

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第57頁一、

初級(jí)改造

經(jīng)過基因突變方法，以到達(dá)改變氨基酸進(jìn)而改造蛋白質(zhì)目標(biāo)。

當(dāng)前，主要采取基因突變方法：基因定位突變盒式突變。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第58頁基因定位突變依據(jù)三聯(lián)體密碼，編碼DNA（目標(biāo)基因）確實(shí)定位點(diǎn)，改變其組成核苷酸次序或種類，使基因發(fā)生定向變異，使其控制合成氨基酸種類、次序發(fā)生改變，合成出含有預(yù)期氨基酸序列修飾蛋白質(zhì)。這種經(jīng)過造成一個(gè)或幾個(gè)堿基定點(diǎn)突變，以到達(dá)修飾蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)目標(biāo)技術(shù)，稱為基因定點(diǎn)突變技術(shù)。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第59頁基因定位突變基礎(chǔ)過程：首先使目標(biāo)基因由環(huán)狀載體折成單鏈，再對(duì)指定位點(diǎn)用寡聚核苷酸誘導(dǎo)或置入合成寡聚核苷酸產(chǎn)生定位突變基因，最終將突變基因?qū)脒m宜表示系統(tǒng)(如大腸桿菌等)即可產(chǎn)生突變體蛋白質(zhì)。這是當(dāng)前定向改造蛋白質(zhì)基礎(chǔ)伎倆。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第60頁（一）M13-DNA寡聚核苷酸介導(dǎo)誘變技術(shù)

特點(diǎn)：能夠準(zhǔn)確按照大家意圖進(jìn)行DNA突變，即想改變哪一個(gè)堿基就只改變哪一個(gè)，其它不變基礎(chǔ)過程：將待研究基因插入載體M13，制得單鏈模板，人工合成一段寡核苷酸（其中含一個(gè)或幾個(gè)非配對(duì)堿基）作為引物，合成對(duì)應(yīng)互補(bǔ)鏈，用T4連接酶連接成閉環(huán)雙鏈分子。經(jīng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌，雙鏈分子在胞內(nèi)分別復(fù)制，所以就得到兩種類型噬菌斑，含錯(cuò)配堿基就為突變型。再轉(zhuǎn)入適當(dāng)表示系統(tǒng)合成突變型蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第61頁（二）

寡核苷酸介導(dǎo)PCR誘變技術(shù)

特點(diǎn)：利用PCR技術(shù)定點(diǎn)誘變，可使突變體大量擴(kuò)增，提升誘變率以研究基因?yàn)槟０?，用人工合成寡核苷酸（含有一個(gè)或幾個(gè)非互補(bǔ)堿基）為引物，直接進(jìn)行基因擴(kuò)增反應(yīng)，就會(huì)產(chǎn)生突變型基因。分離出突變型基因后，在適當(dāng)表示系統(tǒng)中合成突變型蛋白質(zhì)。這種方法直接、快速和高效。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第62頁過程：將目標(biāo)基因克隆到質(zhì)粒載體上，質(zhì)粒分置于兩管中，每管各加入兩個(gè)特定PCR引物，一個(gè)引物與基因內(nèi)部或其附近一段序列完全互補(bǔ)，另一引物和另一段序列互補(bǔ)，但有一個(gè)核苷酸發(fā)生了突變；兩管中，不完全配正確引物與兩條相反鏈結(jié)合，即兩個(gè)突變引物是互補(bǔ)。因?yàn)閮蓚€(gè)反應(yīng)中引物位置不一樣，所以PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物有不一樣末端。將兩管PCR產(chǎn)物混合、變性、復(fù)性，則每條鏈會(huì)與另一管中互補(bǔ)鏈退火，形成有兩個(gè)切口環(huán)狀DNA，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，這兩個(gè)切口均可被修復(fù)。若同一管子中兩條DNA鏈結(jié)合，會(huì)形成線性DNA分子，它不能在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，只有環(huán)狀DNA才能在大腸桿菌中穩(wěn)定存在，而絕大多數(shù)環(huán)狀分子都含有突變基因。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第63頁（三）隨機(jī)誘變技術(shù)

（四）盒式突變技術(shù)

常見方法：將基因克隆到質(zhì)粒上，旁邊有兩個(gè)緊密相連限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，雙酶解后產(chǎn)生一個(gè)3′凹陷末端和一個(gè)5′凹陷末端，與克隆基因想鄰末端是3′凹陷和5′凹陷。1985年Wells提出一個(gè)基因修飾技術(shù)，可經(jīng)過一次修飾，在一個(gè)位點(diǎn)上產(chǎn)生20種不一樣氨基酸突變體，從而能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)分子中一些氨基酸進(jìn)行“飽和性”分析。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第64頁利用定位突變?cè)跀M改造氨基酸密碼兩側(cè)造成兩個(gè)原載體和基因上沒有內(nèi)切酶切點(diǎn)，用該內(nèi)切酶消化基因，再用合成發(fā)生不一樣改變雙鏈DNA片段替換被消化個(gè)別。這么一次處理就能夠得到各種突變型基因。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第65頁二、蛋白質(zhì)分子高級(jí)改造（結(jié)構(gòu)域拼接）

研究證實(shí)，在二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)之間還有一個(gè)結(jié)構(gòu)層次，即結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)域由α螺旋、β折疊等二級(jí)結(jié)構(gòu)單位按一定拓?fù)鋵W(xué)規(guī)則組成三維結(jié)構(gòu)實(shí)體。結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)分子中一個(gè)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單位，結(jié)構(gòu)域拼接是經(jīng)過基因操作把位于兩種不一樣蛋白質(zhì)上幾個(gè)結(jié)構(gòu)域連接在一起，形成融合蛋白，它兼有原來兩種蛋白性質(zhì)。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第66頁蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第67頁三、全新蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)與構(gòu)建

上述兩種蛋白質(zhì)改造方法，通常是從一個(gè)已知次序、結(jié)構(gòu)和功效蛋白質(zhì)出發(fā)，依據(jù)一定目標(biāo)和設(shè)計(jì)方案，使用多肽合成或者基因工程方法，改變它結(jié)構(gòu)，以期到達(dá)改變其性質(zhì)目標(biāo)。假如要從頭設(shè)計(jì)和構(gòu)建一個(gè)自然界不存在蛋白質(zhì)，則需要借助多功效模板和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件組裝成某種含有特定功效人工蛋白質(zhì)分子。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第68頁蛋白質(zhì)工程在食品中應(yīng)用

蛋白質(zhì)工程自問世以來，短短十幾年時(shí)間，已取得了引人矚目標(biāo)進(jìn)展，在醫(yī)學(xué)和工業(yè)用酶方面也取得了良好應(yīng)用前景。提升蛋白穩(wěn)定性包含以下幾個(gè)方面：①延長酶半衰期；②提升酶熱穩(wěn)定性；③延長藥用蛋白保留期；④抵抗因?yàn)橹饕被嵫趸l(fā)活性喪失。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第69頁一、

消除酶被抑制特征

1985年，美國埃斯特爾借助寡核苷酸介導(dǎo)定位突變技術(shù)，用19種其它氨基酸分別替換枯草芽孢桿菌蛋白酶分子第222位殘基上易氧化Met，取得了一系列活性差異很大突變酶。發(fā)覺除了用Cys代替Met突變體以外，其它突變體酶活性都降低了。蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第70頁二、引入二硫鍵，改進(jìn)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性

溶菌酶分子：由一條肽鏈組成，并在空間上折疊形成二個(gè)相對(duì)獨(dú)立結(jié)構(gòu)域，酶活性中心位于二個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。該酶分子在第97位和54位殘基上是兩個(gè)未形成二硫鍵半胱氨酸因?yàn)槎蜴I是一個(gè)穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)主要共價(jià)化學(xué)鍵，有如建筑所用鋼筋一樣，因而能將分子中不一樣部位牢靠地聯(lián)結(jié)在一起。所以，提升酶熱穩(wěn)定性最常見方法是在分子中增加一對(duì)或數(shù)對(duì)二硫鍵。

蛋白質(zhì)工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用第71頁在高溫下Asn和Gln輕易脫氨形成Asp和Glu，而造成蛋白質(zhì)分子構(gòu)象改變，使蛋白質(zhì)失去活性。對(duì)釀酒酵母磷酸丙糖異構(gòu)酶進(jìn)行誘變改造。這種酶有兩個(gè)相同亞基，每個(gè)亞基含有2個(gè)Asn，因?yàn)樗鼈兌嘉挥趤喕g界面上，可能對(duì)酶熱穩(wěn)定性起決定性作用。經(jīng)過寡核苷酸介導(dǎo)定向誘變技術(shù)，將第14位和第78位上2個(gè)Asn分別轉(zhuǎn)變成Thr(蘇氨酸)和Ile(異亮氨酸)殘基，大幅度提升突變酶熱穩(wěn)定性。