感染性疾病病原體快速診斷

感染性疾病病原體快速診斷感染性疾病病原體快速診斷第1頁WenenLIU2概述感染性疾?。河赡撤N病原體所致，經(jīng)過不一樣方式引發(fā)人體發(fā)生感染并出現(xiàn)臨床癥狀疾病,主要表現(xiàn)為發(fā)燒。病原體：細菌（含TB）、支原體、衣原體

病毒真菌原蟲等感染性疾病病原體快速診斷第2頁WenenLIU3感染診療依據(jù)臨床表現(xiàn)：感染全身中毒癥狀：畏寒、發(fā)燒、皮疹等試驗室常規(guī)檢驗：血常規(guī)：WBC、DC影像學(xué)檢驗：X-RAY、B超病原學(xué)檢驗：染色、培養(yǎng)血清學(xué)檢驗：抗原或抗體檢測危重病人：臨床表現(xiàn)、WBC+DC不經(jīng)典感染性疾病病原體快速診斷第3頁WenenLIU4感染分類按病原學(xué)分類細菌感染（包含結(jié)核）真菌感染病毒感染支原體、衣原體按部位分類局部感染全身感染感染性疾病病原體快速診斷第4頁WenenLIU5臨床希望第一時間知道信息感染或非感染細菌感染或非細菌感染是結(jié)核感染或普通細菌感染酵母樣真菌感染或絲狀真菌感染白色假絲酵母或其它念珠菌感染曲菌感染或毛霉菌感染因為上述感染治療方法不一樣感染性疾病病原體快速診斷第5頁WenenLIU6感染標(biāo)志物細菌感染標(biāo)志物白細胞計數(shù)與分類血沉C-反應(yīng)蛋白（CRP）白介素-6降鈣素元內(nèi)毒素真菌感染標(biāo)志物:G試驗、GM試驗結(jié)核感染證據(jù)：夾層杯、T-SPOT感染性疾病病原體快速診斷第6頁WenenLIU7內(nèi)容提要臨床常見細菌感染快速診療技術(shù)結(jié)核分枝桿菌快速診療技術(shù)123臨床常見真菌快速診療技術(shù)感染性疾病病原體快速診斷第7頁WenenLIU8臨床常見細菌感染快速診療技術(shù)降鈣素原檢測內(nèi)毒素檢測分子診療感染性疾病病原體快速診斷第8頁WenenLIU9降鈣素原(ProcalcitoninPCT)降鈣素原是正常人血清中存在含116個氨基酸組成糖蛋白，最初由甲狀腺細胞產(chǎn)生，血清水平很低。在非感染或病毒性感染疾病時保持非常低血清水平，在細菌性感染時含量升高，并與感染程度和預(yù)后呈正相關(guān)。PCT含量改變穩(wěn)定，并出現(xiàn)在疾病早期（3-4h）。短半衰期(24h)國外把PCT作為最敏感感染標(biāo)志。正常血清水平:100-150pg/ml感染性疾病病原體快速診斷第9頁WenenLIU10降鈣素原PCT

:分子結(jié)構(gòu)血清降鈣素(CT)前肽物質(zhì)分子量：14.5kDa由116個氨基酸組成糖蛋白質(zhì)無激素活性11號染色體上單拷貝基因轉(zhuǎn)錄甲狀腺濾泡細胞降鈣素原前體內(nèi)源多肽酶降鈣素原PCT分解細胞內(nèi)特殊蛋白酶正常情況下降鈣素感染性疾病病原體快速診斷第10頁WenenLIU11LinscheidP,etalCritCareMed04;32:1715-21

Endocrinology03;144:5578-84&05;146:2699-708在病毒感染時，大量產(chǎn)生IFN-

，將會抑制PCT激活及產(chǎn)生.所以，病毒感染時，PCT濃度將會保持在較低水平BacterialInfection

(e.g.Endotoxin)IL-6IL-6感染性疾病病原體快速診斷第11頁WenenLIU12細菌感染后PCT快速升高

Kineticsofprocalcitonininiatrogenicsepsis

BrunkhorstF.Metal,IntensCareMed1998,24:888-892感染性疾病病原體快速診斷第12頁WenenLIU13PCT起源LeftLane:正常組,在不存在感染情況下，甲狀腺外CALCI表示被抑制，而主要局限于甲狀腺和肺神經(jīng)內(nèi)分泌細胞有一定程度表示RightLane:膿毒癥組,在細菌感染時可誘導(dǎo)全身各種組織各種類型細胞CALCI表示和PCT連續(xù)性釋放感染性疾病病原體快速診斷第13頁WenenLIU14PCT動力學(xué)2-3h開始增加；

6-8h快速升高；12h-48抵達峰值；

2-3d正常血漿濃度在＜0.05ng/ml-1000ng/ml半衰為15-20h左右,且不受腎功效影響感染性疾病病原體快速診斷第14頁WenenLIU15PCT檢測方法快速半定量法（PCT-Q）全自動快速定量法（VIDAS)感染性疾病病原體快速診斷第15頁WenenLIU16快速半定量法（PCT-Q）樣本：200μl血清/血漿結(jié)果：30min同膠體金免疫層析法，即在標(biāo)準(zhǔn)品上結(jié)合有膠體金小鼠單克隆抗降鈣素抗體和綿羊多克隆抗降鈣素抗體，待檢標(biāo)本加上后，示蹤元素即與標(biāo)本中PCT結(jié)合，形成一個“三明治式”復(fù)合物，然后經(jīng)過發(fā)光比色判斷PCT濃度當(dāng)PCT濃度≥0.5μg/ml時，夾心復(fù)合物呈紅色帶，顏色深淺與樣品中PCT濃度成正百分比，未結(jié)合示蹤物擴散到對照區(qū)，結(jié)合并產(chǎn)生了紅色對照帶。感染性疾病病原體快速診斷第16頁WenenLIU17全自動快速定量法儀器：法國梅里埃企業(yè)VIDAS全自動酶聯(lián)熒光分析儀及配套試劑標(biāo)本要求：靜脈抗凝血注意無菌操作，使用新鮮標(biāo)本，假如4小時內(nèi)不使用，應(yīng)將標(biāo)本放置-20℃保留。血漿中PCT非常穩(wěn)定，搜集標(biāo)本24h后，PCT濃度在室溫下大約下降12％，在4℃大約下降6％感染性疾病病原體快速診斷第17頁WenenLIU18PCT用于細菌感染和膿毒癥診療是一個非常有價值標(biāo)志物

細菌感染/膿毒癥診療及嚴重程度判斷膿毒癥治療效果監(jiān)測及預(yù)后評定抗生素有效管理感染性疾病病原體快速診斷第18頁WenenLIU19細菌感染診療及嚴重程度判斷膿毒性休克嚴重膿毒癥系統(tǒng)性感染(膿毒癥)局部感染正常值

PCT濃度隨感染擴散和感染嚴重程度加重而升高感染性疾病病原體快速診斷第19頁WenenLIU20膿毒癥患者治療效果及預(yù)后監(jiān)測(n=109)F.Stüber,UniversityBonn,LectureatISICEM,Brussels經(jīng)過PCT不停在體內(nèi)衰減，反應(yīng)出抗生素治療策略成功伴隨患者反抗生素治療響應(yīng)，引發(fā)了PCT血中濃度水平經(jīng)典改變過程AB-antibiotics感染性疾病病原體快速診斷第20頁WenenLIU21抗生素有效管理PCT濃度（ng/ml）臨床意義＜0.05無細菌感染0.05-0.1非細菌感染0.1-0.25可能是局部細菌感染，不提議使用抗生素，6-二十四小時內(nèi)復(fù)查0.25-0.5局部細菌感染，提議使用抗生素0.5-2.0嚴重細菌感染、膿毒癥2.0-10.0重癥膿毒癥＞10.0 重度膿毒癥、膿毒性休克或MODS感染性疾病病原體快速診斷第21頁WenenLIU22PCT臨床應(yīng)用急診住院病房外科手術(shù)血液科內(nèi)科ICU外科ICU兒科急診兒科病房兒科ICU新生兒科嚴重細菌感染或膿毒癥檢測（判別診療）疾病或治療反應(yīng)監(jiān)測局部與全身性感染膿毒癥診療和監(jiān)測新生兒膿毒癥檢測感染性疾病病原體快速診斷第22頁WenenLIU23<48hr新生兒

->生理性一過性峰值創(chuàng)傷后炎癥綜合癥:多發(fā)性創(chuàng)傷,大面積燒傷,大手術(shù)后(心臟,移植,腹部)使用致炎細胞因子治療后(OKT3,注射TNFα,IL-2,抗淋巴細胞球蛋白)一些腫瘤(甲狀腺髓樣細胞癌,肺小細胞癌和支氣管癌)長時間循環(huán)衰竭(心源性休克,出血性休克,熱休克)PCT水平增加但沒有系統(tǒng)細菌感染幾個情況感染性疾病病原體快速診斷第23頁WenenLIU24感染早期(->6-12小時后重復(fù)檢測!)亞急性心內(nèi)膜炎局部感染細菌感染而PCT不升高情況感染性疾病病原體快速診斷第24頁WenenLIU25對PCT檢測影響受以下原因影響

*

甲狀腺功效

是功效性甲狀腺髓樣癌腫瘤標(biāo)志物*

腎功效

嚴重腎功效受損者中水平較高不受以下原因影響*

類固醇藥品*本身免疫性疾病*

年紀、性別*免疫功效低下狀態(tài):肝硬化、HIV感染感染性疾病病原體快速診斷第25頁WenenLIU26細菌內(nèi)毒素革蘭氏陰性菌細胞壁上一個脂多糖（LPS）和蛋白復(fù)合物，細菌死亡或自溶后釋放進入機體將會出現(xiàn)發(fā)燒、血壓降低、寒顫、引發(fā)DIC、內(nèi)毒素敗血癥等一系列臨床反應(yīng)。感染性疾病病原體快速診斷第26頁WenenLIU27感染性疾病病原體快速診斷第27頁WenenLIU28細菌內(nèi)毒素檢測原理：儀器檢測試管內(nèi)反應(yīng)物光密度OD值，取當(dāng)OD上升到0.02點時間作為反應(yīng)時間，該點在反應(yīng)曲線上位置為濁度開始快速改變時期，該取值能夠快速、穩(wěn)定取得反應(yīng)時間，從而判斷內(nèi)毒素含量動態(tài)濁度法感染性疾病病原體快速診斷第28頁WenenLIU29儀器和試劑BET-24A細菌內(nèi)毒素分析儀

MB-80微生物快速動態(tài)監(jiān)測系統(tǒng)感染性疾病病原體快速診斷第29頁WenenLIU30標(biāo)本要求患者早上還未進行藥品靜脈治療時:MB-80：“無熱源真空采血管”,靜脈抗凝血，采血量2-4ml，30min內(nèi)送檢BET-24A：抽取1mL靜脈抗凝血，配1mL1號處理液其它體液如腦脊液﹑胸腹水與血標(biāo)本要求相同。注意無菌操作感染性疾病病原體快速診斷第30頁WenenLIU31內(nèi)毒素活性定量檢測意義G-所致膿毒癥早期判別診療指導(dǎo)抗生素正確使用判定抗感染治療效果幫助判斷患者預(yù)后感染性疾病病原體快速診斷第31頁WenenLIU32內(nèi)毒素定量檢測適應(yīng)癥各種急、慢性病理性發(fā)燒患者各種類型“中重度感染、肝病、休克、腸道疾病、臟器功效衰竭、大手術(shù)術(shù)后”患者慢性疾病長久臥床、免疫力低下患者急診及ICU病房收治生命體征不穩(wěn)定患者感染性疾病病原體快速診斷第32頁WenenLIU33分子診療技術(shù)檢測致病菌PCR技術(shù)擴增16srRNA基因判定常見致病菌革蘭陽性球菌革蘭陰性桿菌mecA基因VanA/VanB基因PBP2b基因PCR擴增耐藥基因特異性基因ESBLs基因AmpC基因碳青霉烯酶基因mecA：耐甲氧西林葡萄球菌屬（MRS）特異性基因VanAVanB

：耐萬古霉素腸球菌（VRA）特異性基因PBP2b

：青霉素不敏感肺炎鏈球菌（pNSSp）特異性基因ESBLs基因：主要包含TEM、SHV、CTX-M、OXAAmpC基因包含質(zhì)粒介導(dǎo)型和染色體誘導(dǎo)型。其中前者主要包含MOX、CMY、DHA、ACC、ACT、FOX等亞型，后者主要包含：ADC。碳青霉烯酶基因：A類酶，以KPC為代表；金屬酶，以IMP、VIM、NDM為代表；D類酶，以O(shè)XA-23、OXA-24、OXA-51和OXA-48為主。感染性疾病病原體快速診斷第33頁WenenLIU3416SrRNA含有多拷貝多信息特點感染性疾病病原體快速診斷第34頁WenenLIU35結(jié)核分枝桿菌快速診療是引發(fā)結(jié)核病病原菌。它可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為主要傳染病。預(yù)計世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。結(jié)核分枝桿菌生長遲緩，普通需2-4周長成肉眼可見落菌。抗酸染色法是檢測TB傳統(tǒng)方法，但存在假陽性所以，快速診療對TB至關(guān)主要。感染性疾病病原體快速診斷第35頁WenenLIU36結(jié)核感染現(xiàn)實狀況全球范圍內(nèi)結(jié)核病疫情急劇惡化結(jié)核病與艾滋病同時流行結(jié)核菌耐藥現(xiàn)象益發(fā)嚴重人口大規(guī)模流動我國是世界上僅低于印度第二結(jié)核病大國結(jié)核菌感染率44.5%新發(fā)活動性結(jié)核患者130萬/年死亡13萬/年早期快速診療與治療成為制約結(jié)核病控制關(guān)鍵常規(guī)試驗室診療結(jié)核病方法陽性率不到60%感染性疾病病原體快速診斷第36頁WenenLIU37全球結(jié)核疫情感染性疾病病原體快速診斷第37頁WenenLIU38結(jié)核檢測方法一、現(xiàn)有試驗室常規(guī)檢測技術(shù)細菌學(xué)診療─涂片、培養(yǎng)免疫學(xué)診療─抗原、抗體膠體金分子生物學(xué)診療─PCR二、其它檢測技術(shù)PPD（TST）試驗影像學(xué)檢驗感染性疾病病原體快速診斷第38頁WenenLIU39

結(jié)核夾層杯技術(shù)結(jié)核感染T細胞檢測技術(shù)分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)核分枝桿菌快速診療感染性疾病病原體快速診斷第39頁WenenLIU40結(jié)核夾層杯技術(shù)原理：經(jīng)過專用消化滅活液消化組織細胞和粘蛋白等，將結(jié)核桿菌裸露出來，并結(jié)合高速震蕩，使痰標(biāo)本充分液化而有利于其中抗酸桿菌沉淀于特制彭氏杯底部菌膜上，在夾層杯中直接抗酸染色、干燥，并用取片針頂出內(nèi)底，經(jīng)封片等步驟后，鏡下檢測抗酸桿菌。感染性疾病病原體快速診斷第40頁WenenLIU41檢測流程示意圖感染性疾病病原體快速診斷第41頁WenenLIU42鏡下比較圖2.夾層杯法（新方法）：

菌量多，背景清楚，易于觀察圖1.直接涂片法（傳統(tǒng)方法）：菌量少，背景不清楚感染性疾病病原體快速診斷第42頁WenenLIU43夾層杯診療技術(shù)優(yōu)點陽性率高背景清楚，易于觀察易于標(biāo)準(zhǔn)化檢測速度快生物安全性好夾層杯診療技術(shù)優(yōu)點感染性疾病病原體快速診斷第43頁WenenLIU44結(jié)核夾層杯技術(shù)標(biāo)本要求：（1）痰液要求新鮮，留取清晨深咳出第一口痰液，留痰時，患者以清水漱口３次，然后用力咳出氣管深處痰（2）用氫氧化鈉處理完全。臨床應(yīng)用：用于結(jié)核分枝桿菌初篩感染性疾病病原體快速診斷第44頁WenenLIU45結(jié)核感染T細胞檢測技術(shù)是以ELISPOT技術(shù)

檢測結(jié)核感染新方法

，ELISPOT是近20年發(fā)展起來檢測抗原特異性T細胞技術(shù)，是當(dāng)前最敏感檢測抗原特異性T細胞方法之一。感染性疾病病原體快速診斷第45頁WenenLIU46原理結(jié)核感染免疫應(yīng)答反應(yīng)以細胞免疫為主，作為免疫應(yīng)答一個別，T細胞受結(jié)核抗原刺激致敏，形成活化效應(yīng)T細胞，包含CD4和CD8。結(jié)核桿菌感染者外周血單核細胞中存在結(jié)核特異活化T淋巴細胞，這些淋巴細胞在體外再次受到結(jié)核桿菌特異抗原刺激后分泌γ-干擾素，經(jīng)過檢測體外分泌IFN-γ來診療是否存在結(jié)核感染。感染性疾病病原體快速診斷第46頁WenenLIU47活動性結(jié)核與潛伏感染接觸活動性結(jié)核病患者暴露程度不足，結(jié)核桿菌被機體免疫力去除沒有癥狀,結(jié)核桿菌依舊存在而不能被發(fā)覺

X-光/CT掃描顯示正常沒有抗體應(yīng)答診療困難傳統(tǒng)結(jié)核感染檢測只有TST（PPD）機體被感染受機體免疫力抑制沒有臨床癥狀終生處于感染狀態(tài)潛伏感染有臨床癥狀含有傳染性結(jié)核桿菌能夠經(jīng)過涂片、培養(yǎng)檢測出胸部X-光或CT掃描顯示異常

肺外結(jié)核難以診療(尤其是兒童)活動性結(jié)核5%5%再次激活感染性疾病病原體快速診斷第47頁WenenLIU48活動性結(jié)核與潛伏感染新發(fā)TB病例來自潛伏性結(jié)核感染人群潛伏性結(jié)核感染（hiddenepidemic）人群數(shù)量巨大

——“定時炸彈”若想控制活動性TB，必須先控制潛伏性結(jié)核感染判別高危人群預(yù)防性治療免疫接種活動性TB–

每年900萬新發(fā)病例僅為冰山一角LatentTB-“hiddenepidemic”-2billionpeopleinfected感染性疾病病原體快速診斷第48頁WenenLIU49結(jié)核感染T細胞檢測感染性疾病病原體快速診斷第49頁WenenLIU50γ-干擾素釋放試驗（IGRA，interferon-gammareleaseassay）酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT，Enzyme-LinkedImmunoSpotassay）結(jié)核桿菌特異抗原早期抗原靶6（ESAT-6）

earlysecretedantigenictarget6

培養(yǎng)濾液蛋白10（CFP10）

culturefiltrateprotein10）技術(shù)背景感染性疾病病原體快速診斷第50頁WenenLIU51結(jié)核感染者體內(nèi)存在特異效應(yīng)T淋巴細胞，效應(yīng)T淋巴細胞再次受到結(jié)核抗原刺激時會分泌各種細胞因子（IFN-γ）。所以，檢測效應(yīng)T淋巴細胞可用于結(jié)核病或結(jié)核潛伏感染者診療。因為效應(yīng)T細胞存活時間很短，而且含有特異性，所以能夠作為機體是否正處于被感染指標(biāo)，不論是否有臨床癥狀?；贗GRA原理檢測項目當(dāng)前已被美國、加拿大、英國、德國、意大利、瑞士、法國、荷蘭、日本等二十余個國家寫入本國結(jié)核診療指南中γ-干擾素釋放試驗（IGRA）感染性疾病病原體快速診斷第51頁WenenLIU52酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）感染性疾病病原體快速診斷第52頁WenenLIU53酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）近二十多年來，伴隨技術(shù)改良，ELISPOT分析技術(shù)已經(jīng)是當(dāng)世公認最靈敏抗原特定T細胞體外檢測技術(shù)結(jié)合了細胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（即ELISA技術(shù)），能夠在單細胞水平檢測細胞因子分泌情況，靈敏度高。其技術(shù)原理，可一句話概括為：用抗體捕捉培養(yǎng)中細胞所分泌細胞因子，并以酶聯(lián)斑點顯色方式將其表現(xiàn)出來（SedgwickJD）。感染性疾病病原體快速診斷第53頁WenenLIU54結(jié)核桿菌特異抗原ESAT-6與CFP10抗原由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同操縱子編碼蛋白全部卡介苗（BCG）均丟失該基因序列絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌也不存在RD1區(qū)感染性疾病病原體快速診斷第54頁WenenLIU55操作步驟①②感染性疾病病原體快速診斷第55頁WenenLIU56操作步驟⑤⑥④③孵育1小時感染性疾病病原體快速診斷第56頁WenenLIU57實際效果圖陰性結(jié)果陽性結(jié)果空白對照抗原AESAT-6抗原BCFP10陽性對照（PHA）感染性疾病病原體快速診斷第57頁WenenLIU58T-SPOT.TB特點特異性好，不受卡介苗（BCG）接種和環(huán)境分枝桿菌影響靈敏度高，在免疫力低下/受抑制人群中有很高檢出率快速，24小時匯報結(jié)果感染性疾病病原體快速診斷第58頁WenenLIU59寫入診療指南國家（Guidelines）美國（CDC和兒科學(xué)會）；加拿大（加拿大結(jié)核病委員會）；巴西（衛(wèi)生部）英國（國家衛(wèi)生和臨床協(xié)會）；法國（國家衛(wèi)生局）；西班牙（西班牙肺病和胸部手術(shù)協(xié)會）；德國（德國抗結(jié)核病中央委員會）；意大利；瑞士（瑞士肺科協(xié)會）；荷蘭（實用結(jié)核病控制委員會）；丹麥（丹麥肺部醫(yī)學(xué)會）；挪威（挪威公共衛(wèi)生協(xié)會）；芬蘭（國家衛(wèi)生和福利協(xié)會）；愛爾蘭（國家結(jié)核病咨詢委員會）；葡萄牙；捷克共和國；斯洛伐克；波蘭；保加利亞；克羅地亞澳大利亞（國家結(jié)核病咨詢委員會、傳染病協(xié)會和澳大利亞風(fēng)濕病協(xié)會）；沙特阿拉伯；南朝鮮；日本（日本結(jié)核病預(yù)防協(xié)會）

WHO和ECDC中國（教授組推薦）感染性疾病病原體快速診斷第59頁WenenLIU601、結(jié)核病輔助診療/療效評價“菌陰”結(jié)核病患者輔助診療肺外結(jié)核判別診療抗癆治療療效評價2、免疫力低下/受抑制患者結(jié)核診療/感染篩查使用生物制劑/免疫抑制劑患者結(jié)核感染篩查HIV感染者/腎透析患者/器官移植患者3、兒童結(jié)核病輔助診療4、結(jié)核親密接觸者/高危人群結(jié)核感染篩查結(jié)核病患者家眷/醫(yī)務(wù)工作者/監(jiān)獄囚犯5、接觸追蹤臨床應(yīng)用感染性疾病病原體快速診斷第60頁WenenLIU61結(jié)核相關(guān)疾病肺結(jié)核菌陽（痰涂片、痰培養(yǎng)）------結(jié)核?？漆t(yī)院菌陰------感染科、呼吸科、胸外科、結(jié)核科肺外結(jié)核淋巴結(jié)結(jié)核------外科、血液科、感染科結(jié)核性胸膜炎------感染科、呼吸科、結(jié)核科結(jié)核性腹膜炎------外科、消化科、感染科結(jié)核性腦膜炎------感染科、神經(jīng)科骨關(guān)節(jié)結(jié)核------骨科、風(fēng)濕科、感染科泌尿生殖系統(tǒng)結(jié)核------泌尿外科、腎臟科、感染科、性病科其它：如結(jié)核性心包炎、脾結(jié)核、胰腺結(jié)核等感染性疾病病原體快速診斷第61頁WenenLIU62評價不能夠提醒臨床患者病變部位不能夠依據(jù)斑點數(shù)量多少來判斷受試者是活動性結(jié)核病患者或是潛伏感染者兒童結(jié)核輔助診療，需要結(jié)合臨床感染性疾病病原體快速診斷第62頁WenenLIU63基因診療TB特異性位點：1.rRNA基因：高度保守，主要包含23S、16S及5S基因。其中最為常見是16SrRNA基因。2.插入序列：IS6110和IS1081。3.蛋白編碼基因：65KD熱休克蛋白基因(hsp65)、32KD蛋白基因、DnaJ蛋白基因、RNA聚合酶B(rpoB)和MPB64蛋白基因(mpb64）等?；蛟\療意義主要表現(xiàn)在：

a.區(qū)分TB與其它分枝桿菌；

b.檢測TB耐藥基因；

c.提升TB陽性檢出率。感染性疾病病原體快速診斷第63頁WenenLIU64TB分子分型技術(shù)IS6110-RFLP（插入序列6110限制性片段長度多態(tài)性分析）方法當(dāng)前依然被認為是結(jié)核分枝桿菌基因分型“金標(biāo)準(zhǔn)”。直接重復(fù)片段及寡核苷酸多態(tài)性分型可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列及MLVA分型單核苷酸多態(tài)性和MLST分型感染性疾病病原體快速診斷第64頁WenenLIU65多重耐藥結(jié)核分枝桿菌檢測結(jié)核桿菌產(chǎn)生耐藥性主要是由不合理用藥引發(fā)結(jié)核桿菌內(nèi)抗結(jié)核藥品作用靶基因突變所致。藥敏試驗周期長，所以檢測耐藥基因成為多年來研究熱點。耐藥檢測包含用PCR擴增基因組內(nèi)攜帶耐藥性區(qū)域，和進行擴增產(chǎn)物突變分析。結(jié)核分支桿菌耐藥性基因檢測技術(shù)分為雜交系統(tǒng)和放大系統(tǒng)兩大個別。多數(shù)放大系統(tǒng)基于雜交系統(tǒng)，其另一個別是PCR擴增技術(shù)。感染性疾病病原體快速診斷第65頁WenenLIU66臨床常見真菌快速診療G試驗GM試驗分子生物學(xué)技術(shù)感染性疾病病原體快速診斷第66頁WenenLIU671.1,3-β-D-葡聚糖-G試驗1，3-β-D-葡聚糖是酵母和絲狀真菌細胞壁多聚糖成份，以假絲酵母菌屬含量最高，而其它微生物動物及人細胞成份和細胞外液都不含這種成份。所以，血液及無菌體液中檢出1，3-β-D-葡聚糖在很大程度上能夠視為IFI標(biāo)志，如念珠菌、曲霉、鐮刀霉、酵母和絲孢酵母感染等。當(dāng)前檢測方法為G試驗，其原理是1，3-β-D-葡聚糖有特異性激活鱟變形細胞裂解物中G因子引起裂解物凝固，故稱為G試驗。我國已經(jīng)使用微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng)檢測。感染性疾病病原體快速診斷第67頁WenenLIU68標(biāo)本要求采樣過程要求無菌操作常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血取樣（血透患者透析前采血）標(biāo)本類型：抗凝靜脈血，使用無熱原真空采血管采血量：2-3ml，馬上混勻半小時內(nèi)送檢。試驗前未打開標(biāo)本在2-8℃可保留5天。打開后標(biāo)本需在48小時內(nèi)完成檢測。如需長時間儲存，存放溫度應(yīng)為-70℃。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測之前要充分混勻感染性疾病病原體快速診斷第68頁WenenLIU69G試驗臨床意義早期、快速診療侵襲性真菌感染可用于真菌感染早期篩查，適合用于念珠菌、曲霉、肺孢子菌、鐮刀菌、地霉、組織胞漿菌和毛孢子菌等，不能用于檢測隱球菌和接合菌感染。對真菌感染癥狀進行診療，陽性結(jié)果代表存在侵襲性真菌感染感染性疾病病原體快速診斷第69頁WenenLIU702.半乳甘露聚糖(GM)半乳甘露聚糖(GM)是一個對熱穩(wěn)定水溶性物質(zhì)，是廣泛存在于曲霉和青霉細胞壁中一類多糖。普通在曲霉感染者出現(xiàn)臨床癥狀和影像學(xué)檢驗異常前數(shù)天，其體內(nèi)循環(huán)中GM即可呈陽性表示，其靈敏度和特異度均可到達80%以上。原理：是一個微孔板雙抗體夾心法，采取小鼠單克隆抗體EBA-2，檢測人血清中曲霉菌半乳甘露聚糖。感染性疾病病原體快速診斷第70頁WenenLIU71標(biāo)本要求標(biāo)本采集：靜脈采血5ml（紅帽管）。檢測標(biāo)本：血清標(biāo)本，密封，無菌操作。試驗前未打開標(biāo)本在2-8℃可保留5天。打開后標(biāo)本需在48小時內(nèi)完成檢測。如需長時間儲存，存放溫度應(yīng)為-70℃。血清標(biāo)本最多可凍融四次。解凍標(biāo)本檢測之前要充分混勻20mg/L膽