分子生物學(xué)技術(shù)在臨床檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用

2/2分子生物學(xué)技術(shù)在臨床檢驗(yàn)診斷中的應(yīng)用日期:2010-06-0413:52:56

來源:中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)網(wǎng)

現(xiàn)代分子生物學(xué)是研究生物大分子--核酸及其表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能、遺傳、調(diào)控、相互關(guān)系和相互作用，從分子水平上探討生命現(xiàn)象的科學(xué)，其主要研究對象是核酸（DNA和RNA）和蛋白質(zhì)。自從1953年Watson和Crick發(fā)現(xiàn)DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)以來，分子生物學(xué)在短短五十年時間里以超乎想象的速度飛速發(fā)展，滲透到醫(yī)學(xué)每一個領(lǐng)域?？梢院敛豢鋸埖恼f，如果沒有分子生物學(xué)的應(yīng)用，人類探索生命活動的行為將會寸步難行。

將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用到臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)，使疾病診斷深入到基因水平，稱為基因診斷?；蛟\斷技術(shù)主要包括核酸分子雜交技術(shù)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、基因多態(tài)性分析技術(shù)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）分析技術(shù)、熒光原位雜交染色體分析（FISH）技術(shù)、波譜核型分析（SKY）技術(shù)、DNA測序技術(shù)、基因芯片技術(shù)以及蛋白質(zhì)組技術(shù)等，一些先進(jìn)的分離和檢測技術(shù)大大促進(jìn)了上述技術(shù)的完善和發(fā)展，如毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC/MS/MS）、變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）、非熒光遺傳標(biāo)記分析技術(shù)等?；蛟\斷在感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤性疾病等的診斷中發(fā)揮越來越重要的作用。下面，我們就臨床檢驗(yàn)診斷中涉及的主要分子生物學(xué)技術(shù)作一簡要介紹。

1．核酸分子雜交技術(shù)即基因探針技術(shù)。利用核酸的變性、復(fù)性和堿基互補(bǔ)配對的原理，用已知的探針序列檢測樣本中是否含有與之配對的核苷酸序列的技術(shù)。是臨床應(yīng)用最早的，也是最基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)，是印跡雜交、基因芯片等技術(shù)的基礎(chǔ)。不少探針已經(jīng)商品化。

2．PCR技術(shù)

PCR技術(shù)是一種特異擴(kuò)增DNA的體外酶促反應(yīng)，可以短時間擴(kuò)增出兩段已知序列之間的DNA，用于診斷、鑒定、制備探針及基因工程產(chǎn)品開發(fā)等，是一項(xiàng)及其有效和實(shí)用的技術(shù)。由于PCR試驗(yàn)存在一定的假陽性和假陰性問題，導(dǎo)致PCR技術(shù)在我國臨床診斷中的應(yīng)用曾一度被叫停，近年來由于改進(jìn)的PCR技術(shù)如巢式PCR（nestedPCR）、多重PCR(multiplexPCR)

、熒光PCR技術(shù)等在較大程度上增加了該技術(shù)的敏感性和特異性，加上衛(wèi)生部于

2002-01頒發(fā)了有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)臨床應(yīng)用的法規(guī)性文件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)試驗(yàn)室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)〔2002〕10號

)，要求從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的技術(shù)人員必須經(jīng)過衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心或授權(quán)的省級培訓(xùn)機(jī)構(gòu)的上崗培訓(xùn)，持證上崗，使PCR技術(shù)在臨床檢驗(yàn)診斷中重新發(fā)揮其不可替代的作用，PCR已廣泛用于核酸的科學(xué)研究以及臨床疾病的診斷和治療監(jiān)測，尤其在感染性疾病診斷方面更有應(yīng)用價值。

3．基因多態(tài)性分析技術(shù)

在人群中，各個體基因的核苷酸序列會存在一定差異，稱為基因多態(tài)性。基因多態(tài)性位點(diǎn)普遍存在于人的基因組中，并按孟德爾遺傳方式遺傳。如果在某個家庭中，某一致病基因與特定的多態(tài)性片段緊密連鎖，就可以用這一多態(tài)性片段作為一種“遺傳標(biāo)記”來判斷家庭成員或胎兒是否攜帶有致病基因。目前認(rèn)為基因多態(tài)性是個體的“身份證”；有的雖然不表現(xiàn)疾病，但也許會影響對藥物的反應(yīng)和用藥效果。因此，基因多態(tài)性分析技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)研究、疾病連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析、疾病遺傳機(jī)制研究、腫瘤易感性研究、個性化用藥等諸多方面。遺傳學(xué)上把基因多態(tài)性片段稱為遺傳標(biāo)記。遺傳標(biāo)記分析經(jīng)歷第一代限制性酶切片段多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)、第二代微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)，現(xiàn)已發(fā)展到第三代單核苷酸多態(tài)性分析(singlenucleotidepolymorphism,SNP)。下面分別介紹如下：

3.1限制性酶切片段多態(tài)性(RFLP)分析技術(shù)

RFLP是利用限制性內(nèi)切酶在特定的核苷酸序列切割雙鏈DNA后凝膠電泳分離開不同大小片段，由于不同個體存在核苷酸序列差異導(dǎo)致限制性酶切位點(diǎn)變化從而使酶切片段呈現(xiàn)多態(tài)現(xiàn)象。傳統(tǒng)的RFLP方法是指基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，電泳分離后再結(jié)合Southern

印跡雜交，構(gòu)建出DNA指紋圖，這種方法特異性和敏感性均較高，但操作繁雜。目前結(jié)合PCR技術(shù)產(chǎn)生PCR-RFLP方法，是檢測與特定的酶切位點(diǎn)有關(guān)的突變的簡便方法。RFLP方法在遺傳性疾病診斷、微生物種屬分型、腫瘤發(fā)病及診斷研究等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。

3.2

微衛(wèi)星DNA分析技術(shù)

微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)，又稱為短小串聯(lián)重復(fù)(Shorttandemrepeats,STR)或簡單重復(fù)序列

(Simplerepeatsequence,SRS或SSR)

，廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中，常見的有二、三、四核苷酸重復(fù)序列，約占真核生物基因組的

5%，其基本構(gòu)成單元

(核心序列

)為

1–6bp。其中最為常見的是雙核苷酸重復(fù)即

(CA)n和

(TG)n，人類基因組約有5×104～1×105個

(CA)ｎ重復(fù)序列，占

10%。每個微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同，重復(fù)單位數(shù)目約為

10～60次，其長度一般不超過

300bp，多位于基因非編碼區(qū)、內(nèi)含子或非翻譯區(qū)，可存在于Ａlu序列中或衛(wèi)星序列中，但在編碼序列及外顯子中也可找到。微衛(wèi)星DNA的高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。關(guān)于微衛(wèi)星DNA多態(tài)性產(chǎn)生的機(jī)制，目前普遍認(rèn)為是DNA復(fù)制過程中滑動或DNA復(fù)制和修復(fù)時鏈滑動與互補(bǔ)鏈堿基錯配，導(dǎo)致一個或幾個重復(fù)單位的缺失或插入。

微衛(wèi)星DNA是近年來飛速發(fā)展起來的一種新型的DNA高度多態(tài)性遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，具有種類多分布廣泛、高度多態(tài)性、雜合性高、重組率低的特點(diǎn)，在群體中變異范圍大，構(gòu)成了豐富的長度多態(tài)性，有高度的個體特異性，并遵循孟德爾共顯性遺傳規(guī)律，提供了眾多有高度遺傳信息的新的多態(tài)性標(biāo)記。這種多態(tài)性標(biāo)記已廣泛用于構(gòu)建人類遺傳圖譜、法醫(yī)學(xué)親子鑒定、遺傳疾病和腫瘤發(fā)生機(jī)制的研究、疾病相關(guān)基因、疾病連鎖基因和易感基因的研究、以及疾病診斷等等。

3.3單核苷酸多態(tài)性分析(SNP)技術(shù)

隨著基因組測序工作的進(jìn)展，日益發(fā)現(xiàn)基因組中存在著數(shù)量龐大的

SNP。SNP是一種最常見的可遺傳變異，在人類DNA多態(tài)性中，SNP約占

90%。

SNP是指在基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少一種在群體中的頻率不小于1%。

SNP分為兩種形式，一是基因編碼區(qū)的

SNP，稱為

cSNP；二是遍布于基因組的大量單堿基變異。SNP作為一種堿基的替換，大多數(shù)為轉(zhuǎn)換，即一種嘌呤換為另一種嘌呤或一種嘧啶換為另一種嘧啶，轉(zhuǎn)換與顛換之比為

2∶1。研究發(fā)現(xiàn)，SNP在人類基因組

CpG序列上出現(xiàn)最頻繁，約占全部SNP的25%，而且多為

C→T，原因在于CpG中胞嘧啶殘基

(C)是甲基化的，能夠自發(fā)地脫氨基產(chǎn)生胸腺嘧啶

(T)。因此，SNP與

RFLP和

STR等

DNA標(biāo)記的主要不同在于：它不再以“長度”的差異作為檢測手段，而是直接以序列的差異作為標(biāo)記。但

SNP單個基因座的多態(tài)性很差，只有二態(tài)，為此采用多個SNP基因座進(jìn)行“單倍型”

分析尤顯重要。與第

1、2代遺傳標(biāo)記相比，SNP分析具有以下特點(diǎn)：(1)SNP數(shù)量大，分布密集，平均每

1000bp就有1個

SNP。在

PKD基因內(nèi)部或附近可能會找到許多

SNP，聯(lián)合用于ADPKD的單倍型診斷；(2)SNP比STR擴(kuò)增更可靠，不會產(chǎn)生假帶；(3)由于

SNP是二態(tài)的，易于自動化批量檢測，易于計(jì)算機(jī)分析結(jié)果。

SNP的研究已受到廣泛的重視，它已成為實(shí)驗(yàn)室和公司爭奪的對象，也是人類基因組計(jì)劃中的一個重要補(bǔ)充和研究熱點(diǎn)。用于

RFLP、STR的技術(shù)方法，理論上均可用于

SNP的識別和檢出。但印跡分析和

PCR方法，如

SSCP、DGGE等，大都需要標(biāo)記和電泳，費(fèi)時費(fèi)力，難于自動化。近年來，采用了微陣列

DNA芯片、飛行質(zhì)譜分析和變性高效液相層析法等非電泳分型技術(shù)，大大加快了SNP檢測效率。

SNP檢測已廣泛地應(yīng)用于疾病的連鎖分析及關(guān)聯(lián)分析、腫瘤的雜合性缺失研究、疾病遺傳機(jī)制研究、個性化用藥研究等諸多領(lǐng)域。盡管沒有人懷疑SNP在搜尋疾病基因方面的價值，但事實(shí)卻比人們想象的要難得多。首先基因中存在著的重組破壞了SNP和增加疾病風(fēng)險性的變異之間的聯(lián)系，使得相關(guān)分析變得困難。有研究指出關(guān)聯(lián)分析比典型的家系分析需要的樣本要多得多，以便篩除錯誤的信號。因此只有高速率分析數(shù)千個DNA樣本的新技術(shù)的出現(xiàn)才會使SNP分析變得真正有價值；其次，雖然關(guān)聯(lián)分析對于只有一個基因位點(diǎn)上的缺陷等位基因的鑒定有實(shí)用意義，但這種情況又不常見，大約

90%疾病易感基因有

10個以上相關(guān)突變存在，而癌癥及其它一些疾病則常涉及多個基因。另外，最普遍的SNP也是最古老的，他們可以同時存在于正常人或患者中，這就意味著SNP和基因的關(guān)鍵突變之間的特定聯(lián)系可能不存在一個特殊的模式，人們很容易錯失一個很重要的聯(lián)系，或者作出一個錯誤的聯(lián)系。樣本數(shù)量也是SNP應(yīng)用的一個障礙。盡管大部分SNP出現(xiàn)在各種群體中，但是某一種SNP可能只出現(xiàn)在一個亞群中，一些有意義的cSNP也以相當(dāng)高的比例出現(xiàn)在某一亞群中。所以要搜尋SNP就要盡可能地采用多種多樣的大樣本。專利問題也限制著SNP技術(shù)應(yīng)用。由于SNP具有的新穎性、實(shí)用性和不明確性等特征，使得許多商業(yè)公司搶先獲得SNP后能夠?qū)ζ渖暾垖＠?，限制了許多研究者對它們的使用。

4．單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)技術(shù)

SSCP是一種簡便快速的檢測DNA或cDNA突變的技術(shù)。其技術(shù)原理和過程是：將PCR擴(kuò)增到的待測DNA或cDNA片段變性，成為單鏈DNA，在一定條件下，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將單鏈DNA變性。由于單鏈DNA的空間構(gòu)象與分子內(nèi)堿基組成密切相關(guān)，一個堿基的差異即可形成不同的構(gòu)象，不同構(gòu)象的DNA在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的泳動速率不同，形成的帶型則不同，故能反映出單鏈DNA片段的多態(tài)性。

5．DNA測序技術(shù)

將待測DNA片段轉(zhuǎn)變成一系列放射性核素標(biāo)記的單鏈寡核苷酸，并使其一端為一固定的末端。另一端由于長度不同，成為一系列相差一個堿基的連續(xù)末端。在分別含有4種脫氧核酸的反應(yīng)體系中，寡核苷酸分別終止于不同位置的A、T、G或C堿基。將4種反應(yīng)體系的寡核苷酸產(chǎn)物，在變性聚丙烯酰胺凝膠電泳中上樣于相鄰的加樣孔進(jìn)行電泳分離。由于全部可能產(chǎn)生的不同大小寡聚核苷酸都存在于4種反應(yīng)產(chǎn)物中，從放射自顯影后的4種末端寡聚核苷酸梯子形圖譜中，就可以直接讀出DNA序列。DNA測序技術(shù)使直接檢測核苷酸突變成為可能，而不僅僅是基因片段的多態(tài)性分析，使臨床基因診斷更加精確。常用于探針設(shè)計(jì)、特異引物合成、基因結(jié)構(gòu)分析等，在遺傳病診斷、微生物種屬鑒定、腫瘤診斷等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，人類基因組計(jì)劃就是由于大規(guī)模自動化測序技術(shù)的發(fā)展而順利完成的。但由于DNA測序方法復(fù)雜，一般臨床實(shí)驗(yàn)室無法進(jìn)行，有必要時可委托有條件的公司或研究機(jī)構(gòu)進(jìn)行。

6．DNA芯片技術(shù)

DNA芯片技術(shù)，實(shí)際上就是一種大規(guī)模集成的固相雜交，是指在固相支持物上原位合成(insitusynthesis)寡核苷酸或者直接將大量預(yù)先制備的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交。通過對雜交信號的檢測分析，得出樣品的遺傳信息(基因序列及表達(dá)的信息)。由于常用計(jì)算機(jī)硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。根據(jù)芯片的制備方式可以將其分為兩大類：原位合成芯片和DNA微集陣列(DNAmicroarray)。芯片上固定的探針除了DNA，也可以是cDNA、寡核苷酸或來自基因組的基因片段，且這些探針固化于芯片上形成基因探針陣列。因此，DNA芯片又被稱為基因芯片、

cDNA芯片、寡核苷酸陣列等。

作為新一代基因診斷技術(shù)，DNA芯片的突出特點(diǎn)在于快速、高效、敏感、經(jīng)濟(jì)，平行化、自動化等，與傳統(tǒng)基因診斷技術(shù)相比，DNA芯片技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢：①基因診斷的速度顯著加快，一般可于30min內(nèi)完成。若采用控制電場的方式，雜交時間可縮至1min甚至數(shù)秒鐘。②檢測效率高，每次可同時檢測成百上千個基因序列，使檢測過程平行化。③基因診斷的成本降低。④芯片的自動化程度顯著提高，通過顯微加工技術(shù)，將核酸樣品的分離、擴(kuò)增、標(biāo)記及雜交檢測等過程顯微安排在同一塊芯片內(nèi)部，構(gòu)建成縮微芯片實(shí)驗(yàn)室。⑤因?yàn)槭侨忾]，避免了交叉感染；且通過控制分子雜交的嚴(yán)謹(jǐn)度，使基因診斷的假陽性率、假陰性率顯著降低。

DNA芯片技術(shù)在腫瘤基因表達(dá)譜差異研究、基因突變、基因測序、基因多態(tài)性分析、微生物篩選鑒定、遺傳病產(chǎn)前診斷等方面應(yīng)用廣泛。如感染性疾病是由于病原微生物(病毒、細(xì)菌、寄生蟲等)侵入機(jī)體而引起。目前已經(jīng)獲得一些生物的全部基因序列，包括141種病毒，幾種細(xì)菌(流感嗜血桿菌、產(chǎn)甲烷球菌、支原體M.genitalium及實(shí)驗(yàn)室常用的大腸桿菌等)和一種真核生物(釀酒酵母)，且數(shù)量還在增長。因此，將一種或幾種病原微生物的全部或部分特異的保守序列集成在一塊芯片上，可快速、簡便地檢測出病原體，從而對疾病作出診斷及鑒別診斷。用DNA芯片技術(shù)可以快速、簡便地搜尋和分析DNA多態(tài)性，極大地推動法醫(yī)生物學(xué)的發(fā)展。比如將個體SNPs設(shè)計(jì)在一塊DNA芯片上，與樣品DNA雜交，即可鑒定基因的差異。人的體型、長相約與500多個基因相關(guān)，應(yīng)用DNA芯片原則上可以揭示人的外貌特征、臉型、長相等，這比一般意義的DNA指紋譜又進(jìn)了一步。

應(yīng)用DNA芯片還可以在胚胎早期對胎兒進(jìn)行遺傳病相關(guān)基因的監(jiān)測及產(chǎn)前診斷，為人口優(yōu)生提供有力保證；而且可以全面監(jiān)測200多個與環(huán)境影響相關(guān)的基因，這對生態(tài)、環(huán)境控制及人口健康有著重要意義。

7．蛋白質(zhì)組及分析技術(shù)

隨著大量生物體全基因組序列的獲得，特別是人類基因組序列草圖的完成，基因組學(xué)研究重點(diǎn)不可避免地從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)轉(zhuǎn)向功能基因組學(xué)，而蛋白質(zhì)組學(xué)（proteom）正是作為功能基因組研究的重要支柱在上世紀(jì)90年代中期應(yīng)運(yùn)而生。蛋白質(zhì)組是指一個基因，一個細(xì)胞或組織所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)成分。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的是在不同時間和空間發(fā)揮功能的特定蛋白質(zhì)群體，從而揭示和說明生命活動的基本規(guī)律。蛋白質(zhì)組學(xué)可以分為三個領(lǐng)域：①蛋白質(zhì)的大規(guī)模的分離與鑒定，以及它們的表達(dá)后修飾；②蛋白水平的差異顯示在疾病中的運(yùn)用；③運(yùn)用當(dāng)前的一切手段研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互關(guān)系。與基因組相比蛋白質(zhì)組具有多樣性和可變性。對一個機(jī)體而言，基因的數(shù)目是恒定的，而蛋白質(zhì)的種類和數(shù)目在同一個機(jī)體的不同細(xì)胞中各不相同，即使同一細(xì)胞在不同的時期，不同條件下，其蛋白質(zhì)表達(dá)也不同。雖然可以通過cDNA芯片等方法顯示生物體的基因啟動狀況，但mRNA水平

(包括mRNA的種類和含量

)并不能完全反映出蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外從研究手段方面來說，蛋白質(zhì)研究技術(shù)比基因技術(shù)相對要復(fù)雜和困難，不僅氨基酸殘基數(shù)量多于核甘酸殘基，而且在蛋白質(zhì)組研究中沒有一種方法象PCR那樣能迅速擴(kuò)增目的片段，這樣對于豐度低但功能重要的蛋白質(zhì)很難進(jìn)行大規(guī)模的研究。

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)包括：雙向（二維）聚丙烯酰胺凝膠電泳（結(jié)合等電聚焦和IEJK）分離蛋白質(zhì)，在固相載體上形成蛋白質(zhì)-多肽圖譜，用敏感的方法染色（如銀染）并用圖像分析電子計(jì)算機(jī)進(jìn)行鑒定；將蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，用酶消化，進(jìn)一步用氨基酸分析、質(zhì)譜分析等進(jìn)行鑒定；或結(jié)合蛋白質(zhì)的毛細(xì)管電泳，高效液相色譜技術(shù)（HPLC）以至蛋白質(zhì)芯片進(jìn)行鑒定。

蛋白質(zhì)芯片

(proteinarray)是近年來蛋白質(zhì)組學(xué)研究中興起的一種新的方法，它類似于基因芯片，是將蛋白質(zhì)點(diǎn)到固相物質(zhì)上，然后與要檢測的組織或細(xì)胞等進(jìn)行“雜交”，再通過自動化儀器分析得出結(jié)果。這里所指的“雜交”是指蛋白與蛋白之間如

(抗體與抗原

)在空間構(gòu)象上能特異性的相互識別。此方法與傳統(tǒng)的研究方法相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：①蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的研究方法，能在一次實(shí)驗(yàn)中提供相當(dāng)大的信息量，使我們能夠全面、準(zhǔn)確的研究蛋白表達(dá)譜，這是傳統(tǒng)的蛋白研究方法無法做到的。②蛋白質(zhì)組芯片的靈敏度高，它可以檢測出蛋白樣品中微量蛋白的存在，檢測水平已達(dá)ng級。美國科學(xué)家Haab等運(yùn)用綠色熒光

(greenfluorescence)標(biāo)記抗體微陣列，用紅色熒光

(redfluorecence)標(biāo)記蛋白混和物，并運(yùn)用計(jì)算機(jī)識別

(R/G)的信號強(qiáng)弱，來進(jìn)行檢測，檢測水平可達(dá)到

1ng/ml。③蛋白質(zhì)芯片具有高度的準(zhǔn)確性。

蛋白質(zhì)組芯片可用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的各個領(lǐng)域，具體來說大致可分為三個方面：研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，篩選新的蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)芯片能夠用于現(xiàn)在其它方法不能檢測到的，如蛋白質(zhì)-藥物、蛋白質(zhì)-脂質(zhì)之間的相互作用；蛋白質(zhì)組芯片還可用于檢測蛋白與小分子物質(zhì)的作用。例如蛋白質(zhì)與DNA

，RNA分子等。蛋白質(zhì)芯片的制作是決定其運(yùn)用的關(guān)鍵因素之一，蛋白質(zhì)組芯片的制作比當(dāng)前流行DNA芯片制作要復(fù)雜，特別是涉及大量不同種類的蛋白的高效表達(dá)與純化。因此，蛋白質(zhì)芯片制作存在費(fèi)時、費(fèi)力且成本較高等不足，限制了其在臨床的應(yīng)用。

8．熒光原位雜交染色體分析技術(shù)（FISH）

FISH是上世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來并直到現(xiàn)在仍在不斷改進(jìn)、完善的技術(shù)。其基本過程是：首先制成染色體標(biāo)本，和與所感興趣的目的基因（或染色體片段）互補(bǔ)的探針，并在探針上標(biāo)記熒光色素，當(dāng)探針與染色體標(biāo)本上的靶序列雜交后，利用熒光顯微鏡觀察熒光信號從而獲得染色體核型的信息。此技術(shù)具有靈敏度強(qiáng)、背景低、快速等優(yōu)點(diǎn)，避免了使用穩(wěn)定性差、暴光時間長、易污染環(huán)境的放射性核素，成為細(xì)胞遺傳學(xué)與分子生物學(xué)之間溝通的橋梁。這項(xiàng)實(shí)用技術(shù)不僅可用于基因在染色體上的定位研究，而且可直接用于實(shí)驗(yàn)室診斷。例如，應(yīng)用bcr-abl基因探針進(jìn)行FISH染色體分析診斷慢性髓系白血病。近年來FISH技術(shù)不斷發(fā)展，產(chǎn)生了染色體原位抑制（CISS）技術(shù)、間期核FISH、引物原位標(biāo)記或DNA合成（PRINS）技術(shù)等，并且發(fā)展出多色FISH和多重FISH技術(shù)廣泛應(yīng)用于染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)畸變及斷裂點(diǎn)檢測，標(biāo)志染色體的識別，多個不同基因的染色體定位，物理圖譜的制作，基因缺失和擴(kuò)增的檢測等，在腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)分析中發(fā)揮了重要作用。

9．波譜核型分析技術(shù)（Spectralkaryotyping,SKY）

傳統(tǒng)FISH技術(shù)采用的熒光顯微術(shù)基于熒光色素特異性的光學(xué)濾鏡進(jìn)行單強(qiáng)度的熒光檢測，因此很難同時獲得多個信號用于分析。1996年，Schrock等將傅立葉光譜學(xué)、CCD成像技術(shù)和光學(xué)顯微術(shù)結(jié)合起來，建立了SKY技術(shù)，可以在可見光和近紅外區(qū)的所有位置同時檢測樣品的發(fā)射光譜，從而可利用發(fā)射光譜內(nèi)所有信息進(jìn)行分析。目前SKY技術(shù)可以補(bǔ)充染色體常規(guī)顯帶分析的不足，清楚地說明G顯帶不能解釋的復(fù)雜染色體畸變，主要用于腫瘤細(xì)胞的遺傳學(xué)分析，檢測復(fù)雜的細(xì)胞遺傳學(xué)異常，也可用于比較細(xì)胞遺傳學(xué)的種間進(jìn)化差異性研究等方面。

10．分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的發(fā)展及作用

10.1

毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillaryelectrophoresis,CE）

CE是一項(xiàng)迅速發(fā)展的分離技術(shù)，主要用于生物大分子的分離，如DNA和被十二烷基磺酸鈉

(SDS)飽和的蛋白質(zhì)，是在一根內(nèi)徑25～100μm毛細(xì)管內(nèi)進(jìn)行的，毛細(xì)管中充入交聯(lián)聚合物，聚合物起到了分子篩的作用，使質(zhì)量電荷比相同的物質(zhì)能夠按照分子由小到大的順序流出，從而實(shí)現(xiàn)了分離。分辨率高于高效液相色譜，進(jìn)樣量只需

1～50nl，在毛細(xì)管上開一檢測窗口，直接進(jìn)行柱上檢測，靈敏度較高，而且樣品前處理非常簡便，適用于大量臨床樣品的分析。CE有多種分離模式，其中毛細(xì)管凝膠電泳已越來越廣泛地用于基因診斷、基因治療等臨床分子生物學(xué)領(lǐng)域。

毛細(xì)管凝膠電泳與傳統(tǒng)的板式或管式凝膠電泳相比，具有以下特點(diǎn)：(1)分辨率高，因?yàn)槊?xì)管電泳可以施加比板式電泳高

10～100倍的場強(qiáng)，毛細(xì)管本身已經(jīng)具有抗對流作用，不必再使用具有抗對流性的凝膠：(2)分析速度快；(3)定量更加準(zhǔn)確，避免了電泳染色時因時間、溫度、染色劑濃度和放置時間不同而產(chǎn)生的誤差；(4)靈敏度更高，毛細(xì)管電泳為柱上檢測，如使用激光誘導(dǎo)熒光檢測器，檢測限可以提高到10-18到10–21mol/L；(5)實(shí)現(xiàn)自動化操作。能夠進(jìn)行制備性分離是板式凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)，目前毛細(xì)管電泳使用大孔徑毛細(xì)管和低場強(qiáng)，只可以進(jìn)行少量制備，這項(xiàng)技術(shù)更適合于臨床實(shí)驗(yàn)室高靈敏度快速分析的要求。

應(yīng)用CE對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析可以克服常規(guī)瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳等方法分析速度慢、操作繁瑣、定量結(jié)果誤差大、自動化程度低的缺點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于病原體、腫瘤和遺傳病的基因診斷，如病原體特異基因檢測、基因突變檢測、DNA序列分析等。

10.2

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC/MS/MS）

在分析儀器行業(yè)中，質(zhì)譜儀（massspectrometer,MS）是靈敏度最高，對未知化合物的結(jié)構(gòu)分析及定性最準(zhǔn)確，要求相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品或?qū)y定化合物的了解最少的定性手段。而高效液相色譜（HPLC）則是分離化合物范圍最廣、準(zhǔn)確度高、對化合物破壞性小的快速分離方法，特別適用于生物提取物的分離。隨著電噴霧界面核大氣壓化學(xué)電離界面這兩個技術(shù)成熟后，HPLC和MS/MS技術(shù)才實(shí)現(xiàn)成功聯(lián)用，LC/MS/MS才實(shí)現(xiàn)飛速發(fā)展，成為科研和臨床分析的有力工具。

將LC/MS/MS應(yīng)用于基因遺傳性代謝紊亂疾病的診斷，可在2分鐘內(nèi)通過檢測血液中氨基酸或?；鈮A水平異?？煽焖俸Y選出近30種基因遺傳性代謝紊亂疾病，如各種氨基酸代謝失常血癥包括胱氨酸尿癥、瓜氨酸血癥、酪氨酸血癥、超苯丙氨酸血癥、精氨酸缺乏癥、精氨琥珀酸尿癥和各種超甲硫氨酸血癥；短鏈核長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥、異戊酸血癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、戊二酸血癥和其他各種有機(jī)酸代謝失常疾病等。另外，LC/MS/MS在多肽、激素、寡核苷酸以及藥物成分分析等方面應(yīng)用廣泛。

10.3

變性高效液相色譜技術(shù)（DHPLC）

變性高效液相色譜

(denaturinghighperformanceliquidchromatography,DHPLC)是一項(xiàng)在單鏈構(gòu)象多態(tài)性

(SSCP)和變性梯度凝膠電泳

(DGGE)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù)，可自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失。DHPLC檢測變異的基本原理：將工作溫度

(柱溫

)升高使DNA片段開始變性，部分變性的DNA可被較低濃度的乙腈洗脫下來。由于異源雙鏈

(錯配的

)DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特征不同，在相同的部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的