高三一輪復(fù)習(xí)生物基因工程及其應(yīng)用課件

微專題三基因工程及其應(yīng)用一

基因表達(dá)載體的構(gòu)建要點解讀1.構(gòu)建基因表達(dá)載體不可缺少的工具酶是限制酶和DNA連接酶。2.選擇限制酶時要考慮目的基因兩端的限制酶切割位點、質(zhì)粒上的限制酶切割位點及是否破壞目的基因和標(biāo)記基因,從而確定限制酶的種類。限制酶切割載體的切割位點并不是任意的,切點所處位置必須在所需要的載體基因片段之外,避免載體因目的基因的插入而失活或影響鑒定和篩選。必須保證載體上至少有一個完整的標(biāo)記基因,以便于檢測。(1)根據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點確定限制酶的種類。

①不能選擇切割位點位于目的基因內(nèi)部的限制酶,如上圖不能選擇SmaⅠ。②應(yīng)選擇切割位點位于目的基因兩端的限制酶,如上圖可選擇PstⅠ或PstⅠ和EcoRⅠ。③為避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接,應(yīng)使用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒,如上圖選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶,但要確保質(zhì)粒上也有這兩種酶的切割位點,且切割位點不在標(biāo)記基因內(nèi)部。(2)根據(jù)質(zhì)粒的特點確定限制酶的種類。①所選限制酶要與切割目的基因的限制酶一致,以確保具有相同的末端。②質(zhì)粒作為載體必須具備標(biāo)記基因等,因此所選擇的限制酶不能破壞質(zhì)粒上的所有標(biāo)記基因,即至少要保留一個標(biāo)記基因,用于重組DNA的鑒定和篩選,如上圖中限制酶SmaⅠ會破壞標(biāo)記基因,不能選用。3.E.coliDNA連接酶只能連接雙鏈DNA的黏性末端,而T4DNA連接酶既可連接雙鏈DNA的黏性末端,又可連接平末端。因此,在構(gòu)建基因表達(dá)載體時要根據(jù)限制酶切割的結(jié)果來加以選擇。4.若用同一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因,會形成四個相同的黏性末端,則可能出現(xiàn)多種連接方式。例如,①質(zhì)粒和質(zhì)粒連接;②目的基因和目的基因連接;③質(zhì)粒的自身環(huán)化、目的基因的自身連接;④質(zhì)粒和目的基因的連接。質(zhì)粒與目的基因的連接又會出現(xiàn)正向連接和反向連接兩種。目的基因與質(zhì)粒的反向連接會導(dǎo)致密碼子的順序發(fā)生改變,進(jìn)而使起始密碼子和終止密碼子位置改變,最終導(dǎo)致翻譯不能正常進(jìn)行而無法得到正常的表達(dá)產(chǎn)物。典例剖析【例1】圖甲、圖乙中的箭頭表示三種限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點,AmpR表示氨芐青霉素抗性基因,NeoR表示新霉素抗性基因。B下列敘述錯誤的是(

)A.圖甲中的質(zhì)粒用BamHⅠ切割后,含有2個游離的磷酸基團(tuán)B.在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,可用PstⅠ和BamHⅠ切割質(zhì)粒和外源DNAC.導(dǎo)入目的基因的大腸桿菌可在含新霉素的培養(yǎng)基中生長D.用PstⅠ酶切,無法避免目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化答案:B解析:在構(gòu)建重組質(zhì)粒時,不能用BamHⅠ切割質(zhì)粒和外源DNA,會破壞目的基因。二

新型冠狀病毒的檢測要點解讀1.抗體檢測。新型冠狀病毒IgM抗體檢測試劑盒采用間接法檢測人體中的新型冠狀病毒IgM抗體,最快可在15min內(nèi)通過肉眼觀察獲得檢測結(jié)果。其實質(zhì)是抗原—抗體雜交技術(shù),但是,目前抗體檢測還不能完全替代核酸檢測。2.核酸檢測。(1)新型冠狀病毒是一種RNA病毒,病毒中特異性的RNA序列是區(qū)分該病毒與其他病原體的標(biāo)志物。(2)檢測原理:新型冠狀病毒的核酸檢測采用“實時熒光定量PCR”技術(shù),利用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析。因PCR反應(yīng)模板僅為DNA,因此在進(jìn)行PCR反應(yīng)前,應(yīng)將新型冠狀病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在PCR反應(yīng)體系中,包含一對特異性引物以及一個Taqman探針,該探針為一段特異性寡核苷酸序列,兩端分別標(biāo)記了報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時,報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;若反應(yīng)體系存在靶序列,PCR反應(yīng)時探針與模板結(jié)合,DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針降解,報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離,發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個熒光分子產(chǎn)生。實時熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān),病毒核酸濃度越高,Ct值越小。典例剖析【例2】新型冠狀病毒是一種單鏈RNA病毒,新型冠狀病毒的核酸檢測采用“實時熒光定量PCR”技術(shù),通常在1~2h內(nèi)即可得到檢測結(jié)果。此方法是PCR和熒光檢測技術(shù)的結(jié)合,利用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測分析。步驟如下,請回答下列問題。(1)利用樣本中提取的RNA獲得cDNA,過程①使用

酶。需要將樣本中的RNA經(jīng)過過程①形成cDNA后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增的原因是

。

(2)一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán),每次循環(huán)一般可以分為變性、復(fù)性和延伸三步,每一步都要控制好相應(yīng)的溫度,延伸的溫度

(填“大于”“小于”或“等于”)復(fù)性的溫度,而

(填“大于”“小于”或“等于”)變性的溫度。

(3)過程②中對cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增,需設(shè)計2種引物。下圖為cDNA的部分序列,2種引物的結(jié)合位置是

。

(4)在檢測過程中,隨著PCR的進(jìn)行,反應(yīng)產(chǎn)物不斷累積,“雜交雙鏈”熒光信號的強度也等比例增加,為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,一般要達(dá)到或超過閾值時才能判斷為陽性,最終確診。雖然“實時熒光定量PCR”技術(shù)是當(dāng)前被廣泛認(rèn)可的檢測手段之一,但仍然存在有“假陰性”現(xiàn)象,結(jié)合上述內(nèi)容,分析可能產(chǎn)生“假陰性”的因素有

(填字母)。

A.取樣不規(guī)范導(dǎo)致所獲樣本量不足B.樣本運輸中出現(xiàn)了損壞C.檢測樣本被污染D.病毒相應(yīng)關(guān)鍵序列發(fā)生了改變答案:(1)逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增必須以DNA為模板,RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板(2)大于小于(3)Ⅱ和Ⅲ(4)ABCD解析:(1)利用樣本中提取的RNA獲得cDNA屬于逆轉(zhuǎn)錄的過程,故需要逆轉(zhuǎn)錄酶的催化。PCR擴(kuò)增必須以DNA為模板,RNA不能作為PCR擴(kuò)增的模板,所以需要將樣本中的RNA經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程合成cDNA。(2)延伸的溫度為72

℃左右,復(fù)性的溫度為50

℃左右,變性的溫度一般為90

℃以上,所以延伸的溫度大于復(fù)性的溫度,小于變性的溫度。(3)在引物作用下,DNA聚合酶從引物3'端開始延伸DNA鏈,所以引物的結(jié)合部位是DNA鏈的3'端,即Ⅱ和Ⅲ。(4)取樣不規(guī)范導(dǎo)致所獲樣本量不足,會使得熒光信號的強度達(dá)不到閾值;樣本運輸中出現(xiàn)了損壞,也會影響PCR過程中DNA的擴(kuò)增,使熒光信號的強度達(dá)不到閾值;檢測樣本被污染,會導(dǎo)致熒光信號的強度比例受影響;病毒相應(yīng)關(guān)鍵序列發(fā)生改變,會影響引物與cDNA的結(jié)合,從而影響熒光信號的強度比例。1.S基因與作物甜度相關(guān),可用于培育轉(zhuǎn)S基因作物新品系。如下圖所示,為使S基因按正確方向與質(zhì)粒連接,選用的限制酶組合是(

)A.XbaⅠ和SalⅠB.EcoRⅠ和HindⅢC.BamHⅠ和HindⅢD.XbaⅠ和HindⅢ答案:DS基因Ti質(zhì)粒2.圖1為限制性內(nèi)切核酸酶SalⅠ和XhoⅠ的識別序列與切割位點示意圖。用SalⅠ切割目的基因兩側(cè),用XhoⅠ切割載體質(zhì)粒,再用DNA連接酶處理可形成重組質(zhì)粒。研究人員用2種酶單獨切割或同時切割普通質(zhì)粒和重組質(zhì)粒,再將產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離,其結(jié)果見圖2。圖1圖2下列敘述正確的是(

)A.SalⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端與XhoⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端不同B.根據(jù)重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果可知有2個目的基因插入重組質(zhì)粒中C.重組質(zhì)粒上有1個限制酶SalⅠ和1個限制酶XhoⅠ的識別序列D.2種酶切割產(chǎn)生的2kb產(chǎn)物可作為探針篩選含目的基因的受體細(xì)胞C解析:SalⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端與XhoⅠ切割產(chǎn)生的黏性末端都是3'-AGCT-5',A項錯誤。普通質(zhì)粒長度都是5

kb,用1種酶切割重組質(zhì)粒得到的結(jié)果都是7

kb,用2種酶切割重組質(zhì)粒得到的結(jié)果為5

kb和2

kb,說明有1個目的基因插入重組質(zhì)粒中,重組質(zhì)粒上有1個限制酶SalⅠ和1個限制酶XhoⅠ的切割位點,B項錯誤,C項正確。2種酶切割產(chǎn)生的2

kb產(chǎn)物需要經(jīng)過熒光標(biāo)記,然后解鏈成為單鏈DNA分子才可以作為探針篩選含目的基因的受體細(xì)胞,D項錯誤。3.新型冠狀病毒是一種RNA病毒,臨床檢測最初采用核酸檢測的方法,該方法首先要進(jìn)行DNA的擴(kuò)增,其一般過程是先通過一定的方法從患者體內(nèi)獲得該病毒的RNA,然后通過相應(yīng)的酶合成cDNA(互補DNA),最后在特異性引物的幫助下擴(kuò)增DNA。下列相關(guān)說法錯誤的是(

)A.此過程用到了逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶和DNA連接酶等B.所設(shè)計的引物應(yīng)該能與cDNA特異性結(jié)合C.從患者體內(nèi)獲得的RNA中可能包含患者自身基因轉(zhuǎn)錄的RNAD.核酸檢測擴(kuò)增DNA時用到了PCR技術(shù)A解析:以病毒RNA為模板合成cDNA的過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶,以cDNA為模板擴(kuò)增DNA的過程需要Taq

DNA聚合酶,不需要DNA連接酶。4.甜蛋白是一種高甜度的特殊蛋白質(zhì),為了改善黃瓜的品質(zhì),科學(xué)家利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將一種甜蛋白基因成功導(dǎo)入黃瓜細(xì)胞,得到了轉(zhuǎn)基因植株。圖1、圖2分別為甜蛋白基因編碼鏈(僅示部分堿基)和Ti質(zhì)粒的示意圖,其中①~⑤表示不同位點。請回答下列問題。圖1圖2(1)基因表達(dá)載體包括啟動子、

等。其中啟動子的功能是

。

(2)下表為不同限制酶的識別序列和切割位點,在構(gòu)建甜蛋白基因表達(dá)載體時,應(yīng)選用的限制酶是

。

(3)科研人員對載體Ti質(zhì)粒進(jìn)行改造時,需要插入多個限制酶單一切點,應(yīng)選擇在圖2中的位點

(填序號)處插入。T-DNA