牛海綿狀腦病診斷技術(shù)

牛海綿狀腦病診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了診斷牛海綿狀腦病(BSE)的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛海綿狀腦病的診斷；也可用于其他動(dòng)物的傳染性海綿狀腦病(TSE)的診斷。2臨床診斷BSE病牛臨床癥狀各種各樣，病程多為數(shù)月至一年，最終死亡。當(dāng)病牛出現(xiàn)以下全部或部分癥狀而又不能確定為其他疾病時(shí)，應(yīng)懷疑BSE的可能。a)行為異常：表現(xiàn)為不安、恐懼、異常震驚或沉郁；不自主運(yùn)動(dòng)，如磨牙、震顫；不愿接觸水泥地面或進(jìn)入畜欄等。b)感覺(jué)或反應(yīng)過(guò)敏：表現(xiàn)為觸、視、聽(tīng)三覺(jué)過(guò)敏。對(duì)頸部觸摸、光線的明暗變化以及外部聲響過(guò)度敏感，這是BSE病牛重要的臨床表現(xiàn)。c)運(yùn)動(dòng)異常：病牛步態(tài)呈“鵝步”狀，共濟(jì)失調(diào)，四肢伸展過(guò)度，有時(shí)倒地，難以站立。d)體重和體況下降。其他動(dòng)物的TSE臨床癥狀不盡相同，但確診須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。3實(shí)驗(yàn)室診斷發(fā)現(xiàn)可疑病例后，應(yīng)進(jìn)行采樣，送專門實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。3.1采樣將牛頭固定，用電鋸從前額兩牛角根部向枕骨大孔背側(cè)緣方向鋸開(kāi)，使腦部暴露。用剪刀剪開(kāi)腦膜并切斷所有與腦部相連的神經(jīng)和血管，取出整腦。大規(guī)模監(jiān)測(cè)時(shí)，可用專用工具從枕骨大孔處，取出延腦部分即可。將完整的腦組織浸入10倍體積的固定液(配方見(jiàn)附錄A)中固定。一周后更換固定液，再維持一周。3.3組織病理學(xué)診斷3.3.1病料處理3.3.1.1把固定好的腦組織取出，將大腦和小腦去除，橫切腦干選取厚度為3mm～5mm的腦閂部延髓、小腦后腳部延髓和前丘部中腦組織塊。3.3.1.2將選取好的組織塊放入新配的固定液中再固定一周，其間更換固定液三次，并在水平搖床上不斷搖蕩，以提高固定液的滲透力。3.3.1.3將固定好的組織塊放入流水中漂洗24b。3.3.1.4放入下列不同濃度的酒精中脫水：23.3.1.5放入下列香柏油和二甲苯中透明：a)香柏油中12h;3.3.1.6按下述方法浸蠟：a)軟蠟中40min;3.3.1.7將浸好蠟的組織塊放入包埋框中用硬蠟包埋，冷卻過(guò)夜。3.3.1.8將石蠟塊切成5μm厚的切片，用干凈的載玻片貼片。3.3.2蘇木素伊紅H-E染色3.3.2.1試劑配制：見(jiàn)附錄B。3.3.2.2操作步驟如下：a)二甲苯I中10min;b)二甲苯Ⅱ中10min;g)85%酒精中2min;h)75%酒精中2min;i)自來(lái)水洗2min;j)哈里斯酸性蘇木精12min;k)自來(lái)水漂洗2min;1)酸性酒精10min;m)自來(lái)水漂洗5min;n)飽和碳酸鋰藍(lán)染30min;o)自來(lái)水漂洗10min;p)75%酒精中2min;q)85%酒精中2min;r)95%酒精伊紅液中復(fù)染1min;s)95%酒精中2min;t)100%酒精中2min;u)100%酒精中2min;v)二甲苯I中2min;w)二甲苯Ⅱ中2min。用中性樹(shù)膠封片。3.3.4結(jié)果觀察在光學(xué)顯微鏡下(10×10,10×40)觀察切片，若被檢樣品腦干灰質(zhì)區(qū)特別是腦閂部位的孤束核、迷走神經(jīng)背核、三叉神經(jīng)脊束核等處的神經(jīng)元核周質(zhì)或神經(jīng)纖維網(wǎng)胞漿中出現(xiàn)雙側(cè)對(duì)稱性海綿狀空泡病變，且空泡呈規(guī)則的圓形或橢圓形，周邊整齊，則可判定為BSE感染。在正常情況下，動(dòng)眼神經(jīng)核和紅核處的核周質(zhì)也可能有少量空泡出現(xiàn)，但不呈雙側(cè)對(duì)稱，應(yīng)注意區(qū)別。3同3.3.1。3.4.2試劑配制見(jiàn)附錄C。3.4.3.2磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次5min。3.4.3.3將蛋白酶K緩沖液水浴至3蓋好盒蓋，在121℃(約103kPa)條件下高壓蒸汽處理20min,而后自然冷卻。3.4.3.5PBS洗3次，每次5min。3.4.3.6甲醇-過(guò)氧化氫中室溫處理5min。3.4.3.7PBS洗3次，每次5min。3.4.3.8洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加5%的正常豬血清，確保組3.4.3.9將切片放入1:800稀釋的兔抗牛PrP抗體溶液中，確保切片完全浸入，37℃作用4h。也可用1:1000的兔抗牛PrP抗體溶液37℃過(guò)夜處理。3.4.3.10PBS洗3次，每次5min。3.4.3.11洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加顯示系統(tǒng)(見(jiàn)第C.6章)中3.4.3.12PBS洗3次，每次5min。3.4.3.13洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加顯示系統(tǒng)中試劑B的溶3.4.3.14PBS洗3次，每次5min。3.4.3.15將切片在蒸餾水中放1min～2min。3.4.3.16洗完后用吸水紙吸干組織塊四周的液體，然后在組織切片上滴加顯示系統(tǒng)中試劑C的溶3.4.3.17將切片在蒸餾水中放1min～2min。4(規(guī)范性附錄)10%福爾馬林生理鹽水固定液的配制：蒸餾水40%福爾馬林混勻即可。g(規(guī)范性附錄)組織病理學(xué)診斷(H-E染色)的試劑配制B.1哈里斯酸性蘇木精染液蘇木精無(wú)水乙醇蒸餾水氧化汞冰乙酸鉀明礬先將蘇木精溶于無(wú)水乙醇，然后將鉀明礬和蒸餾水煮沸溶化，去火速加入蘇木精無(wú)水乙醇溶液中，再去火，立即加入氧化汞煮沸，迅速冷卻后加入冰乙酸，過(guò)濾使用。B.2酸性酒精在100mL的70%或80%酒精中加入0.5mL或1mL的濃鹽酸。B.3碳酸鋰飽和水溶液碳酸鋰2g加100mL蒸餾水，充分溶解。B.495%酒精伊紅液伊紅0.5g加入100mL95%酒精中配制。5(規(guī)范性附錄)免疫組織化學(xué)診斷的試劑配制C.1蛋白酶K緩沖溶液1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)(pH8.0)2.5mL0.1mol/L氯化鈣(CaCl?)0.75mL蒸餾水47mL先將Tris/HCl、CaCl?和蒸餾水混勻。用前在37℃水浴中加入蛋白酶K(17μL)。C.2甲醇-過(guò)氧化氫(使用前5min配)甲醇過(guò)氧化氫(H?O?)(30%)1.5mLC.30.1mol/LPB.氯化鈉(NaCl)氯化鉀(KCI)0.2g磷酸氫二鈉(Na?HPO?)1.44g磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.24g加水800mL溶解