汗腺細(xì)胞在人體皮膚創(chuàng)傷及修復(fù)中的研究進(jìn)展

第第頁汗腺細(xì)胞在人體皮膚創(chuàng)傷及修復(fù)中的研究進(jìn)展[摘要]汗腺作為人體最大的器官-皮膚重要的附屬器，在人體中具有重要的作用。大面積重度燒創(chuàng)傷患者因其皮膚均為增生性瘢痕修復(fù)，大部分汗腺結(jié)構(gòu)被破壞且無法再生，失去了通過汗液蒸發(fā)來調(diào)控體溫這一基本功能，嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。組織工程技術(shù)的發(fā)展為大面積皮膚缺損修復(fù)提供了新的方法，并獲得了一定療效。文章首先借助于前言文獻(xiàn)研究，介紹汗腺細(xì)胞的基本形態(tài)，功能等；其次，探究相關(guān)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞的分化進(jìn)展研究，詳細(xì)地介紹了表皮干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞及毛囊干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞的分化，以及其分化的通路MAPK，ERK等介紹；然后對汗腺細(xì)胞體外培養(yǎng)現(xiàn)狀進(jìn)行了闡述；最后研究分析了再生汗腺細(xì)胞用于皮膚創(chuàng)傷與修復(fù)。

[關(guān)鍵詞]汗腺；汗腺細(xì)胞；表皮干細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；皮膚創(chuàng)傷；修復(fù)

[中圖分類號]R641[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號]1008-6455（2015）19-0073-04

Researchprogressofhumansweatglandcellsintraumaandrepair

CHENFu-huan，SONGHui-feng，WANGTong-ming，HEXiu-ye，YUEXiao-tong

（DepartmentofBurnandPlasticSurgery，TheFirstAffiliatedHospitalofPLAGeneralHospital，ChinesePLAMedicalSchool，Beijing100048，China）

Abstract：Sweatgland，asthebody'slargestorgan-theskinimportantappendages，playsanimportantroleinthehumanbody.Alargeareaofseverelyburnedortraumapatients，becauseoftheinabilityofevaporatingthroughsweatgland，affectsthequalityoflifeofpatients.Developmentoftissueengineeringtechnologyforlargeareaofskinhasprovidedanewmethodforskindefects，andgotsomecertaineffect.Thispaper，firstlywiththehelpofliteratureresearch，introducesthebasicformandfunctionofSweatglandcells，Secondlytoexploretherelevantoriginalcelldifferentiationintosweatglandcells；introducedindetailepidermalstemcells（ESCs）andhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells（MSCs）todifferentiateintosweatglandcells，anditsdifferentiationpathwayssuchasMAPK、ERKandsoon.thentheexpoundsonthestatusquoofsweatglandcellsinvitro；Finallyanalyzestheregenerationofsweatglandcellsforskintraumaandrepair.

Keywords：sweatglands；sweatglandcells；epidermalstemcells；mesenchymalstemcells；skininjury；repair

汗腺作為皮膚的重要附屬器官，在物質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)體溫以及維持體液平衡等方面都具有重要作用。對于人體而言，當(dāng)外界環(huán)境溫度高于30℃時(shí)，傳導(dǎo)、對流以及輻射等散熱方式停止作用，通過汗腺細(xì)胞分泌汗液成為人體唯一的散熱途徑[5]。汗腺分為外泌汗腺和頂漿汗腺，即俗稱的大汗腺和小汗腺。外泌汗腺可達(dá)數(shù)百萬個，分布于人體除嘴唇、外耳道、陰蒂和陰唇的全身各處，以手掌和腳底處的皮膚最多[6-8]。有關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，新生的汗腺細(xì)胞（SweatGlandCells，SGCs）在形態(tài)上多呈現(xiàn)圓形、錐體形、橢圓形或短柱狀，當(dāng)細(xì)胞生長密集時(shí)則多呈扁平的不規(guī)則多角形，并且中間會出現(xiàn)圓形核。各組織塊長出的汗腺細(xì)胞匯合時(shí)，可觀察到“鋪路石”般的外觀，局部可以觀察到“穹窿”或“拉網(wǎng)”狀等汗腺細(xì)胞生長的特征現(xiàn)象。而隨著生長周期的延長，傳代汗腺細(xì)胞在貼壁時(shí)呈現(xiàn)圓形，然后細(xì)胞逐步伸展，并且透明度增高，細(xì)胞形態(tài)也以橢圓形或短柱狀為主[9]。

嚴(yán)重?zé)齽?chuàng)傷患者殘余的汗腺導(dǎo)管或者分泌部的細(xì)胞是皮膚創(chuàng)面自然愈合的修復(fù)細(xì)胞之一，這種作用也已經(jīng)達(dá)到一種共識。在汗腺中分離出來的多能或者單能干細(xì)胞可以促進(jìn)皮膚創(chuàng)面愈合，其作用主要還是形成汗腺[10]；在深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面，汗腺分泌部的單層上皮細(xì)胞可以逆分化為表皮干細(xì)胞[11]；為比網(wǎng)狀層深處的創(chuàng)口提供修復(fù)細(xì)胞（毛囊隆突部已經(jīng)受損）。這個過程很緩慢，正因?yàn)檫@一點(diǎn)導(dǎo)致肉芽組織和瘢痕的形成。

1汗腺細(xì)胞的體外培養(yǎng)研究

有關(guān)細(xì)胞和組織的傳統(tǒng)研究方法主要采用二維培養(yǎng)模式獲得細(xì)胞[12]，但是二維培養(yǎng)的細(xì)胞難以很好地模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境，也難以保持在體細(xì)胞的分化功能，而三維培養(yǎng)模式則能夠彌補(bǔ)這些不足。近年來，隨著細(xì)胞外基質(zhì)的發(fā)展，使得進(jìn)行體外三維重建外泌汗腺結(jié)構(gòu)成為可能[13]。Shenyou等[14]使用經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化分離的人體外泌汗腺組織，進(jìn)行體外三維培養(yǎng)，并對構(gòu)建的三維組織進(jìn)行了形態(tài)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過倒置相差顯微鏡觀察經(jīng)Ⅱ型膠原酶消化后的大量汗腺組織游離，其在貼壁后3～5d長出汗腺細(xì)胞，細(xì)胞持續(xù)分裂達(dá)2～3周，并形成圍繞汗腺組織塊的環(huán)狀單層，3～4周后出現(xiàn)細(xì)胞衰老。再將汗腺細(xì)胞接種于Matrigel基底膜基質(zhì)中，2～3周后細(xì)胞開始分裂，然后相繼形成小細(xì)胞團(tuán)、管狀以及類球狀結(jié)構(gòu)；混合培養(yǎng)物在約2周時(shí)開始液化，培養(yǎng)隨之終止。HE染色顯示部分細(xì)胞形成中空管狀結(jié)構(gòu)，管壁由1～2層細(xì)胞組成，這種管狀結(jié)構(gòu)類似于體內(nèi)汗腺的分泌部和導(dǎo)管部。通過免疫組織化學(xué)染色可見，所培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞CK7和CK19表達(dá)均呈陽性。結(jié)果表明，經(jīng)三維培養(yǎng)的人體外泌汗腺細(xì)胞，接種于Matrigel基底膜基質(zhì)所形成的組織結(jié)構(gòu)模擬了在體汗腺的組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

TanZhijun等[15]研究了汗腺細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、純化和表型鑒定。首先將取自人體腹部皮膚的組織樣本采用Ⅱ型膠原酶消化處理，實(shí)驗(yàn)過程中通過倒置相差顯微鏡觀察可見培養(yǎng)皿中有大量游離的汗腺腺體組織，被從組織樣本中分離出來。分離得到的汗腺腺體組織經(jīng)一段時(shí)間的培養(yǎng)后，可以觀察到新生的汗腺細(xì)胞從汗腺腺體中間呈輻射狀，向腺體周圍生長，并且呈現(xiàn)出不規(guī)則的多角形和扁平狀的形態(tài)特征。在新生的汗腺細(xì)胞外圍有少量呈長梭形的成纖維細(xì)胞，對此在實(shí)驗(yàn)中使用胰酶-EDTA消化處理后，結(jié)果顯示可以將汗腺細(xì)胞周圍95%以上的成纖維細(xì)胞去除。最后對純化的汗腺細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示成纖維細(xì)胞特異性蛋白和細(xì)胞波形蛋白均為陰性，而汗腺細(xì)胞標(biāo)志物CEA、CK8則為陽性，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為汗腺細(xì)胞，成纖維細(xì)胞則在胰酶-EDTA消化處理中被有效去除。

2干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化的研究

隨著組織工程皮膚的發(fā)展，對于汗腺再生的研究越來越受廣大學(xué)者的關(guān)注。如：利用胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞進(jìn)行汗腺再生；李海紅等[16]證實(shí)的利用骨髓間質(zhì)充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行汗腺再生，劉愛軍等[17]用ESP源性表皮干細(xì)胞修復(fù)小鼠創(chuàng)傷皮膚的實(shí)驗(yàn)，Suaudcan[18]證實(shí)了iPS細(xì)胞代替ESP進(jìn)行汗腺再生的可能。筆者將介紹眾多原始細(xì)胞中的表皮干細(xì)胞和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞的分化。

2.1表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化

表皮干細(xì)胞（EpidermalStemCells，ESCs）作為皮膚組織的特異性干細(xì)胞，是皮膚組織發(fā)生、創(chuàng)面修復(fù)及改建的關(guān)鍵性細(xì)胞[19]。因此，可通過誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞定向分化汗腺細(xì)胞，這是汗腺再生的重要途徑之一。

根據(jù)研究，首先通過降低β1整合素的表達(dá)和MAPK活性，從而使得表皮干細(xì)胞退出干細(xì)胞群落，進(jìn)而參與汗腺的發(fā)生與汗腺細(xì)胞的定向分化。然后控制ECM改建酶-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），調(diào)節(jié)ECM、MMPs與生長因子的相互作用[20-21]，通過誘導(dǎo)表皮干細(xì)胞分泌LN、FN來影響其合成與分泌MMP-2與MMP-7，從而影響汗腺原基細(xì)胞的出現(xiàn)，在通過MMPs對ECM的作用，定向引導(dǎo)了汗腺原基細(xì)胞向汗腺胚芽細(xì)胞并突破基底膜區(qū)向真皮區(qū)切入，從而向成熟的汗腺細(xì)胞分化；并且宋志芳等[22]通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以誘導(dǎo)人表皮干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞的一個分化，可能一直通過p63來完成之一轉(zhuǎn)化。

2.2間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymestemcells，MSCs）以其具有組織再生和功能重建的巨大潛能激勵著研究者們不斷探索MSCs的應(yīng)用價(jià)值。周崗等[18]研究了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)中的基因表達(dá)方式，通過分離純化并體外擴(kuò)增MSCs，對參照組和不同誘導(dǎo)組進(jìn)行觀測細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，以及采用RT-PCR、流式細(xì)胞儀等方法檢測融合細(xì)胞基因和蛋白的表達(dá)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同條件培養(yǎng)液中人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)均能存活，并且當(dāng)培養(yǎng)達(dá)到一定時(shí)間后，其細(xì)胞形態(tài)會由間充質(zhì)干細(xì)胞的長梭狀開始向SGCs的扁平狀轉(zhuǎn)變。隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長，與汗腺發(fā)生形成密切的基因EGF和EGFR出現(xiàn)高度表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了在不同介質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)下，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以在形態(tài)學(xué)和分子水平上，表現(xiàn)出向SGCs橫向分化的潛能。蔡颯等[23]通過人體外分別分離培養(yǎng)MSCs和SGCs，再經(jīng)原代培養(yǎng)SGCs融合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也展示出在沒有完整汗腺細(xì)胞存在的情況下，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外可以誘導(dǎo)分化為人汗腺細(xì)胞。

AiLi等[24]通過體外分別分離培養(yǎng)、擴(kuò)增，并鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和汗腺細(xì)胞，建立汗腺細(xì)胞體外熱休克模型。通過對比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，以及應(yīng)用免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞儀法檢測對比，結(jié)果顯示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠被成功誘導(dǎo)向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化，獲得汗腺細(xì)胞表型。建立適當(dāng)?shù)捏w外汗腺誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，中胚層骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過跨胚層分化途徑能夠轉(zhuǎn)變?yōu)楹瓜偌?xì)胞。郝文杰[25]研究了人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并分析了表皮細(xì)胞生長因子對轉(zhuǎn)化的影響，以及細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號通路在轉(zhuǎn)化過程中的作用。采用組織塊法培養(yǎng)獲得了純化的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，通過膠原酶消化法獲得了純化的汗腺細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)顯示臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與熱損傷的SGCs經(jīng)Transwell板間接共同培養(yǎng)后，部分臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原CK7、CK19、CEA表達(dá)陽性，說明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)具有SGCs的表型，顯示體外SGCs損傷的微環(huán)境具有促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向＼SGCs分化的作用。研究中還發(fā)現(xiàn)EGF能夠明顯促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化。并且在采用共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向SGCs轉(zhuǎn)化，以及在EGF促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中，ERK通路具有重要作用。

2.3毛囊干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞分化

在王瑤[26]的研究中，分別采用“酶消化-毛囊剝離-酶消化”和“酶消化-毛囊剝離-直接種植法”兩種方法，進(jìn)行體外分離毛囊干細(xì)胞（HairFollicleStemCells，HFSCs），實(shí)驗(yàn)顯示HFSCs在適宜的微環(huán)境中，可以被誘導(dǎo)分化為SGCs。通過建立的共培養(yǎng)誘導(dǎo)體系將HFSCs定向誘導(dǎo)分化得到SGCs。并且試驗(yàn)還顯示誘導(dǎo)分化而來的汗腺細(xì)胞是有功能的，能夠參與皮膚創(chuàng)面中的汗腺再生。

3汗腺細(xì)胞的臨床應(yīng)用研究

近年來，隨著皮膚組織工程的不斷發(fā)展，汗腺再生的研究廣泛應(yīng)用于皮膚創(chuàng)傷和修復(fù)手術(shù)當(dāng)中，這為提高大面積燒傷患者存活后的生活質(zhì)量帶來了希望。如通過干細(xì)胞移植誘導(dǎo)汗腺再生，并驗(yàn)證再生的汗腺具有發(fā)汗功能，對實(shí)現(xiàn)創(chuàng)傷的修復(fù)給出了希望。

盛志勇院士等[27]通過成體干細(xì)胞誘導(dǎo)出汗腺細(xì)胞，并成功將汗腺細(xì)胞分別種植于裸鼠損傷汗腺皮膚及成人瘢痕皮膚處，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：裸鼠治療側(cè)腳掌足墊處可見大片汗腺腺體組織，有發(fā)達(dá)且盤曲的分泌部；免疫組化檢測證實(shí)汗腺組織結(jié)構(gòu)完整，包含完整的分泌部和導(dǎo)管部；CK14在其所在處皮膚基底層和汗腺導(dǎo)管部連續(xù)分布，CEA染色顯示有完整發(fā)達(dá)的汗腺組織，創(chuàng)面汗腺結(jié)構(gòu)也就可見CK8和BrdU雙染色性細(xì)胞；相對裸鼠而言，人體試驗(yàn)結(jié)果顯示2例患者的治療區(qū)發(fā)汗試驗(yàn)均陽性，治療區(qū)創(chuàng)面愈合部位真皮淺層有大量CEA陽性細(xì)胞，并且較為集中，形態(tài)和汗腺組織極為相似。裸鼠及成人的對照組均未有上述實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)。雖然人體試驗(yàn)的病例數(shù)相對而言較少，且種植面積的局限性，但為人們進(jìn)一步尋找外分泌汗腺再生修復(fù)途徑提供了新的思路及方法。

目前，對原發(fā)性手汗癥（PrimaryPalmarHyperhidrosis，PPH）發(fā)病機(jī)制的研究尚無明確結(jié)論，現(xiàn)有研究多認(rèn)為PPH發(fā)病機(jī)制與交感神經(jīng)的過度興奮有關(guān)，因此，相關(guān)研究多關(guān)注對交感神經(jīng)本身及其相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)等的研究[28]。但基于汗液的主要成分分析，其成分主要經(jīng)由汗腺細(xì)胞膜上相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)而實(shí)現(xiàn)汗液的分泌過程，水通道蛋白在其中的作用十分重要。水通道廣泛存在于動植物以及微生物細(xì)胞膜上，它是具有特異性轉(zhuǎn)運(yùn)水分子功能的通道，由一系列水通道蛋白組成，其中水通道蛋白5是促使水分子加快轉(zhuǎn)運(yùn)的跨膜蛋白，水通道蛋白5與體內(nèi)液體的運(yùn)轉(zhuǎn)以及大多數(shù)腺體的分泌有著密切關(guān)系。杜泉[29]使用胸腔鏡下胸交感神經(jīng)干切斷術(shù)（EndoscopicThoracicSympathectomy，ETS），于人體腋窩自然褶皺處取得皮膚標(biāo)本，通過體外汗腺細(xì)胞培養(yǎng)檢測多汗癥患者腋窩汗腺水通道蛋白5（Aquaporin5，AQP5）的表達(dá)與定位，并通過建立人體汗腺細(xì)胞體外模型的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)汗腺AQP5蛋白表達(dá)增強(qiáng)可能與神經(jīng)體液機(jī)制有關(guān)。

4展望

瘢痕作為一個全球性的難題，一直以來深受整形外科醫(yī)生的重視，減少瘢痕的產(chǎn)生、加快瘢痕的愈合速度向來都是創(chuàng)面愈合研究的方向。皮膚附屬器作為附屬器再生或者瘢痕修復(fù)的主要細(xì)胞來源，起著舉足輕重的作用。缺乏汗腺的瘢痕愈合部位因?yàn)榛颊邿o法排汗來調(diào)節(jié)體溫，大大降低了其生活質(zhì)量，因此汗腺細(xì)胞的研究也顯得十分迫切。

近幾年，利用干細(xì)胞技術(shù)誘導(dǎo)和移植技術(shù)來促進(jìn)大面積燒創(chuàng)傷患者汗腺的修復(fù)和再生已取得了一定程度的進(jìn)展，通過對干細(xì)胞和熱休克的汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)，促進(jìn)干細(xì)胞的分化體系已經(jīng)非常成熟，對于汗腺的再生有著很大幫助。但是汗腺作為一個人體的小器官，其分離培養(yǎng)以及可以使用的傳代數(shù)可利用率比較低，這也是限制汗腺細(xì)胞研究發(fā)展的主要方面，本文主要是總結(jié)前人的經(jīng)驗(yàn)，希望可以為以后汗腺細(xì)胞的發(fā)展提供一定的幫助，進(jìn)而造福因燒創(chuàng)傷后汗腺缺失導(dǎo)致生活質(zhì)量下降的患者。

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