免疫學(xué)技術(shù)概論

關(guān)于免疫學(xué)技術(shù)概論[目的與要求]1、了解最新的免疫學(xué)診斷技術(shù)以及細胞免疫技術(shù)的種類與用途；

2、掌握常用的免疫血清學(xué)技術(shù)及其實驗原理、影響因素；

3、掌握生物技術(shù)公司常用的免疫制備技術(shù)；

4、了解免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展趨向。[難點與重點]

重點：常用的免疫血清學(xué)技術(shù)及其實驗原理、影響因素；生物技術(shù)公司常用的免疫制備技術(shù)。難點：常用的免疫血清學(xué)技術(shù)及其實驗原理、影響因素。第2頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

免疫學(xué)技術(shù)是指利用免疫反應(yīng)的特異性原理，建立各種檢測與分析技術(shù)以及建立這些技術(shù)的各種制備方法，包括：①用于抗原或抗體檢測的體外免疫反應(yīng)技術(shù)，或稱免疫檢測技術(shù)，這類技術(shù)一般都需要血清進行試驗，故又稱為免疫血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)；②用于研究機體細胞免疫功能與狀態(tài)的細胞免疫技術(shù)；③用于建立免疫檢測方法的免疫制備技術(shù)，如抗體或抗原的純化技術(shù)、抗體的標(biāo)記技術(shù)。第3頁,共50頁，2024年2月25日，星期天E-玫瑰花環(huán)實驗正常人外周血中T細胞在體外能直接和綿羊紅細胞(SRBC)結(jié)合形成玫瑰花樣細胞團。這是因為人的T細胞膜上具有能和SRBC膜上的糖蛋白相結(jié)合的受體，稱為E受體。已證實E受體是人T細胞所特有的表面標(biāo)志，因此本試驗可作為人外周血T細胞的鑒定和計數(shù)，同時作為人細胞免疫功能狀態(tài)的一個檢測指標(biāo)，也是分離T細胞的常用方法之一。免疫標(biāo)記技術(shù)第4頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第1節(jié)免疫血清學(xué)技術(shù)概述

抗原與相應(yīng)抗體在體內(nèi)和體外均能發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，因抗體主要來自血清，因此在體外進行的抗原抗體反應(yīng)稱為血清學(xué)反應(yīng)或免疫血清學(xué)技術(shù)，是建立在抗原抗體特異性反應(yīng)基礎(chǔ)上的檢測技術(shù)。免疫血清學(xué)技術(shù)自19世紀(jì)建立了最早和最簡單的凝集試驗開始，不斷發(fā)展，尤其是近20余年來，各種新方法、新技術(shù)層出不窮，應(yīng)用面也日益擴大，已深入到生物學(xué)科的各個研究領(lǐng)域。第5頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

免疫血清學(xué)技術(shù)按抗原抗體反應(yīng)性質(zhì)不同可分為凝聚性反應(yīng)(包括凝集試驗和沉淀試驗)、標(biāo)記抗體技術(shù)(包括熒光抗體、酶標(biāo)抗體、放射性同位素標(biāo)記抗體、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記抗體技術(shù)等)、有補體參與的反應(yīng)(補體結(jié)合試驗、免疫黏附血凝試驗等)、中和反應(yīng)(病毒中和試驗等)等已普遍應(yīng)用的技術(shù)，以及免疫復(fù)合物散射反應(yīng)(激光散射免疫測定)、電免疫反應(yīng)(免疫傳感器技術(shù))、免疫轉(zhuǎn)印(westernb1otting)以及建立在抗原抗體反應(yīng)基礎(chǔ)上的免疫蛋白芯片技術(shù)等新技術(shù)。一、免疫血清學(xué)技術(shù)的類型第6頁,共50頁，2024年2月25日，星期天凝集試驗（血球凝集）凝集試驗（細菌凝集）補體結(jié)合試驗抗原-抗體反應(yīng)模式圖第7頁,共50頁，2024年2月25日，星期天凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)對流免疫電泳火箭免疫電泳第8頁,共50頁，2024年2月25日，星期天二、免疫血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(一)特異性與交叉性血清學(xué)反應(yīng)具有高度特異性。這是血清學(xué)試驗用于分析各種抗原和進行疾病診斷的基礎(chǔ)。一般血緣越近，交叉反應(yīng)的程度也越高。除相互交叉反應(yīng)外，也有表現(xiàn)為單向交叉的，單向交叉在選擇疫苗用菌(毒)株時有重要意義。天花牛痘第9頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(二)抗原與抗體結(jié)合機理

抗原和抗體的結(jié)合為弱能量的非共價鍵結(jié)合，其結(jié)合力決定于抗體的抗原結(jié)合位點與抗原表位之間形成的非共價鍵的數(shù)量、性質(zhì)和距離，由此可分為高親和力、中親和力和低親和力抗體。

第10頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(二)抗原與抗體結(jié)合機理

抗原與抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合，這一過程受物理、化學(xué)、熱力學(xué)的法則所制約，結(jié)合的溫度應(yīng)在0～40℃，pH在4～9。如溫度超過60℃或pH降到3以下時，則抗原抗體復(fù)合物又可重新解離。利用抗原抗體既能特異性地結(jié)合，又能在一定條件下重新分離這一特性，可進行免疫親和層析，以制備免疫純的抗原或抗體。第11頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

抗原與抗體在適宜的條件下就能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。但對于常規(guī)的血清學(xué)反應(yīng)，如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補體結(jié)合反應(yīng)等，只有在抗原與抗體呈適當(dāng)比例時，結(jié)合反應(yīng)才出現(xiàn)凝集、沉淀等可見反應(yīng)結(jié)果，在最適比例時，反應(yīng)最明顯。這種因抗原過多或抗體過多而出現(xiàn)抑制可見反應(yīng)的現(xiàn)象，稱為帶(zone)現(xiàn)象。

(二)抗原與抗體結(jié)合機理

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為了克服帶現(xiàn)象，在進行血清學(xué)反應(yīng)時，需將抗原和抗體作適當(dāng)稀釋，通常是固定一種成分而稀釋另一種成分。為了選擇抗原和抗體的最適用量，也可同時遞進稀釋抗原和抗體，用綜合變量法進行方陣測定。(二)抗原與抗體結(jié)合機理

第13頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第14頁,共50頁，2024年2月25日，星期天(三)免疫血清學(xué)反應(yīng)的影響因素影響免疫血清學(xué)反應(yīng)的因素主要有電解質(zhì)、溫度、pH值等。1、電解質(zhì)特異性的抗原和抗體具有對應(yīng)的極性基(羧基、氨基等)，它們互相吸附后，其電荷和極性被中和因而失去親水性，變?yōu)樵魉到y(tǒng)。此時易受電解質(zhì)的作用失去電荷而互相凝聚、發(fā)生凝集或沉淀反應(yīng)。因此，需在適當(dāng)濃度的電解質(zhì)參與下，才出現(xiàn)可見反應(yīng)。故血清學(xué)反應(yīng)一般用生理鹽水作稀釋液，標(biāo)記抗體技術(shù)中，用磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)作稀釋液。第15頁,共50頁，2024年2月25日，星期天2、溫度在一定溫度下，將抗原抗體保溫一定時間，可促使兩個階段的反應(yīng)。較高的溫度可以增加抗原和抗體接觸的機會，從而加速反應(yīng)的出現(xiàn)。將抗原、抗體反應(yīng)通常在37℃(培養(yǎng)箱或水浴)，也可在室溫下進行；亦可用56℃水浴反應(yīng)更快。有的抗原或抗體系統(tǒng)在低溫長時間結(jié)合反應(yīng)更充分，如有的補體結(jié)合反應(yīng)在冰箱低溫結(jié)合效果更好。(三)免疫血清學(xué)反應(yīng)的影響因素影響免疫血清學(xué)反應(yīng)的因素主要有電解質(zhì)、溫度、pH值等。第16頁,共50頁，2024年2月25日，星期天3、酸堿度血清學(xué)反應(yīng)常用pH為6～8，過高或過低的pH值可使抗原抗體復(fù)合物重新離解。如pH值降至抗原或抗體的等電點時，可引起非特異性的酸凝集，造成假象，出現(xiàn)假陽性。(三)免疫血清學(xué)反應(yīng)的影響因素影響免疫血清學(xué)反應(yīng)的因素主要有電解質(zhì)、溫度、pH值等。第17頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第2節(jié)細胞免疫技術(shù)的種類與用途細胞免疫技術(shù)是指與細胞免疫有關(guān)的各種檢測技術(shù)，包括對其免疫細胞、細胞因子的檢測及功能分析。由于人們越來越認識到細胞免疫在腫瘤、胞內(nèi)菌感染、病毒感染等疾病免疫中的重要性，使近幾年來細胞免疫技術(shù)在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)研究與臨床中應(yīng)用越來越廣。

第18頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第19頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第2節(jié)細胞免疫技術(shù)的種類與用途

根據(jù)被檢測的物質(zhì)性質(zhì)不同，可將細胞免疫技術(shù)分為淋巴細胞計數(shù)及分類技術(shù)、淋巴細胞功能測定技術(shù)和細胞因子檢測技術(shù)以及體內(nèi)細胞免疫試驗等4大類。CIK是(cytokineinducedkiller)的縮寫，最初是指在正常人體外周血中只占1～5%的cd3+cd56+的T淋巴細胞?目前國內(nèi)外制備的用于過繼免疫治療的cik細胞，實際上是體外擴增出的以cd3+cd56+?cd3+cd8+為主的異質(zhì)性細胞群。該細胞群是在多種細胞因子如IL-2?IFN-γ及某些單克隆抗體(anti-cd3mcab)的刺激下，由從外周血?骨髓或臍血中分離出來的單個核細胞在體外培養(yǎng)擴增而成，具有廣泛的非MHC限制的極強的溶瘤活性?第20頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第2節(jié)細胞免疫技術(shù)的種類與用途

根據(jù)被檢測的物質(zhì)性質(zhì)不同，可將細胞免疫技術(shù)分為淋巴細胞計數(shù)及分類技術(shù)、淋巴細胞功能測定技術(shù)和細胞因子檢測技術(shù)以及體內(nèi)細胞免疫試驗等4大類。生物治療技術(shù)是一種“自身免疫細胞療法”，它用“人體自身的免疫細胞殺死自己體內(nèi)的腫瘤細胞”的原理來治療腫瘤，是最具優(yōu)勢、最有前景的腫瘤治療技術(shù)之一。通過提取患者自身外周血中的單個核細胞，在GMP超潔凈實驗室中進行誘導(dǎo)，激活和數(shù)量擴增成樹突狀細胞（DC）和細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞（CIK），然后再回輸給病人。這兩種細胞對腫瘤細胞有特異性識別作用，能夠廣泛識別各種腫瘤細胞。當(dāng)DC與CIK細胞聯(lián)合作用將殘留惡性腫瘤細胞完全殺滅或降低并穩(wěn)定在一定水平時，即可達到腫瘤的臨床治療或控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。第21頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

該技術(shù)有效修復(fù)、增強了人體的免疫系統(tǒng)，減少了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的幾率，無痛苦，無副作用，對于手術(shù)結(jié)束后或放療緩解期患者尤為適合。對于部分乙肝患者也可采用該方法治療

生物免疫治療大致分為五個主要步驟，首先是前期檢查，第二是采集外周血中的單個核細胞，第三步就是細胞在實驗室的激活、誘導(dǎo)與質(zhì)控，第四步是回輸?shù)?2頁,共50頁，2024年2月25日，星期天CIK細胞的特點1、增殖能力強，主要效用細胞CD3+CD56+可增殖1000倍；2、殺傷活力強，遠優(yōu)于傳統(tǒng)的LAK細胞和細胞因子γ干擾素、白細胞介素2等；3、殺瘤譜廣，不受MHC限制，具有廣譜殺腫瘤和病毒的作用，對多重耐藥腫瘤細胞仍敏感，殺瘤活性不受環(huán)孢素A（CsA）和FK506等免疫抑制劑的影響，能抵抗腫瘤細胞引發(fā)的效應(yīng)細胞Fas-FasL凋亡。4、毒副作用小，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。不過長度超過30bp的dsRNA會由于干擾素α應(yīng)答引發(fā)非特異性基因抑制。第23頁,共50頁，2024年2月25日，星期天CIK細胞治療技術(shù)的優(yōu)勢1、可有清除手術(shù)、放化療后殘余的癌細胞及微小病灶，預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；2、可與放、化療聯(lián)合使用，能降低放化療的毒副作用的感染率，提高放化療的療效；3、可用于放、化療無效的患者，或?qū)熕幬锂a(chǎn)生耐藥性的患者的治療；第24頁,共50頁，2024年2月25日，星期天CIK細胞治療技術(shù)的優(yōu)勢4、對于失去手術(shù)機會或已復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的晚期腫瘤患者，能迅速緩解其臨床癥狀，延長生存期；大部分患者出現(xiàn)瘤體減小甚至消失或長期帶瘤生存的治療效果；5、由于CIK細胞具有免疫調(diào)節(jié)和體細胞修復(fù)作用，在治療腫瘤的同時，大部分患者尤其是放化療后的患者，可出現(xiàn)消化道癥狀減輕或消失，皮膚有光澤，黑斑淡化，靜脈曲張消失，脫發(fā)停止甚至頭發(fā)生長或白發(fā)變黑等“年輕化”表現(xiàn)，及精神狀態(tài)或體力明顯恢復(fù)等現(xiàn)象，從而提高腫瘤患者的生存質(zhì)量，延長生存期。第25頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第26頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第27頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第28頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第29頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第30頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第31頁,共50頁，2024年2月25日，星期天激光共聚焦顯微鏡第32頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第33頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第34頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共50頁，2024年2月25日，星期天

細胞免疫技術(shù)的特點：（1）方法復(fù)雜，根據(jù)不同檢測對象需采用不同的方法，這也是細胞免疫技術(shù)發(fā)展不快的原因；（2）目前逐漸發(fā)展用血清學(xué)方法檢測細胞免疫，如用單克隆抗體檢測CD抗原進行T細胞亞群分析，血清學(xué)反應(yīng)測定白細胞介素和干擾素等，即細胞免疫技術(shù)與血清學(xué)技術(shù)融為一體。

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細胞免疫技術(shù)的特點：此外，近年來各種先進的檢測儀器應(yīng)用于細胞免疫技術(shù)，如流式細胞儀(flowcytometer)、激光共聚焦顯微鏡等，使免疫細胞表面分子的檢測、定位及其功能的研究有了較大的發(fā)展。第37頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第3節(jié)免疫制備技術(shù)的種類

免疫制備技術(shù)是指制備與免疫檢測有關(guān)制劑的各種技術(shù)，包括抗原制備、抗體制備、抗體純化及抗體標(biāo)記等技術(shù)。第38頁,共50頁，2024年2月25日，星期天第4節(jié)免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用一、動物疫病診斷用免疫血清學(xué)方法對動物傳染病、寄生蟲病等進行診斷，是免疫學(xué)技術(shù)最突出的應(yīng)用。應(yīng)用免疫血清學(xué)技術(shù)可以檢測病原微生物抗原或抗體，其中酶標(biāo)抗體技術(shù)，已成為動物多種傳染病的常規(guī)診斷方法，其簡便、快速，又具有高度的敏感性、特異性和可重復(fù)性，已有許多商品化的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)診斷試劑盒。第39頁,共50頁，2024年2月25日，星期天二、動植物生理活動研究動物、植物體中存在一些活性物質(zhì)，如激素、維生素等，它們在體內(nèi)含量極微少，但在調(diào)節(jié)機體的生理活動中起重要作用，因此可通過分析測定這些生物活性物質(zhì)的含量及變化來研究機體的各種生理功能(如生長、生殖等)。由于這些物質(zhì)含量極低，用常規(guī)檢測方法不能準(zhǔn)確測出。第40頁,共50頁，2024年2月25日，星期天二、動植物生理活動研究目前放射免疫測定和酶免疫技術(shù)已能精確測出ng(10-9g)及pg(10-12g)級水平的物質(zhì)，它們已成為測定動物、植物、以及昆蟲體內(nèi)微量激素及其他活性物質(zhì)、植物生理和生物防治的重要技術(shù)手段。第41頁,共50頁，2024年2月25日，星期天三、物種及微生物鑒定各種生物之間的差異都可表現(xiàn)在抗原性的不同，物種種源越遠，抗原性差異越大，因此可用區(qū)分抗原性的血清學(xué)反應(yīng)進行物種鑒定與物種的分類等工作。血清學(xué)反應(yīng)在細菌、病毒等微生物鑒定和血清型及亞型的分析方面已得到廣泛應(yīng)用。但在動物種源、植物和昆蟲分類方面還是一個新領(lǐng)域。第42頁,共50頁，2024年2月25日，星期天四、動植物性狀的免疫標(biāo)記通過分析動物、植物一些優(yōu)良性狀(如高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性等)的特異性抗原，然后用血清學(xué)方法進行標(biāo)記選擇育種，是一個很有前途的方向，它比分子遺傳標(biāo)記選擇育種簡便。第43頁,共50頁，2024年2月25日，星期天五、生物制品研究生物制品(如疫苗、診斷制品、免疫增強劑等)的研究與開發(fā)，免疫學(xué)技術(shù)是必不可少的支撐技術(shù)。疫苗研究中需用血清學(xué)技術(shù)和細胞免疫技術(shù)作為免疫效力的評價手段。在研究一些免疫增強藥物，尤其研究抗腫瘤藥物時，需用細胞免疫技術(shù)分析測定它們對機體細胞免疫功能的增強作用。第44頁,共50頁，2024年2月25日，星期天六、動物疫病致病機理研究動物傳染病的病原從機體特定部位感染，并在特定組織細胞內(nèi)增殖，引起致病。采用免疫熒光抗體染色或免疫酶組化染色技術(shù)，可在細胞水平上確定病毒等病原微生物的感染細胞，還可用免疫電鏡技術(shù)等，在亞細胞水平上進行抗原的定位。免疫學(xué)技術(shù)還可用于研究自身免疫病和變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)病機理。第45頁,共50頁，2024年2月25日，星期天七、分子生物學(xué)研究在基因工程研究中，目的基因的分離