（高清版）WST 834-2024 剛地弓形蟲試驗(yàn)臨床應(yīng)用

WSWS/T834—2024ClinicalapplicationoftestsforToxoplasmaWS/T834—2024I——將安全預(yù)防措施更改為生物安全（見4，2013年版的6年版的4.1），在直接鏡檢中增加了概述（見6.2.1.1）、體液標(biāo)本（見6.2.1.2）、組織活檢標(biāo)本印片（見6.2.1.3）、組織活檢標(biāo)本切片（見6檢測(cè)指標(biāo)（見6.3.2）和抗體檢測(cè)方法（見6.3.3），刪除了剛地弓形蟲IgG抗體檢測(cè)2013年版的4.2.4）和剛地弓形蟲IgE抗體方法的選擇中增加概述（見6.4.1）、初篩實(shí)驗(yàn)室（見6.4.2）和確證實(shí)驗(yàn)室7.2)、實(shí)驗(yàn)室內(nèi)結(jié)果可比性（見7.3）和實(shí)驗(yàn)室加了概述（見8.1），將確定抗體狀況更改為特殊人群發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估（見8.2，見2013將新生兒感染的診斷更改為先天性感染的診斷（見8.5，見2013年——在附錄A中新增檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證（見A.2），刪除了試驗(yàn)選擇（見2013年版的A.2）、假陽(yáng)性WS/T834—20241剛地弓形蟲試驗(yàn)臨床應(yīng)用GB/T38576人類血液樣本采集GB/T38735人類尿液樣本采集WS/T573感染性疾病免疫測(cè)定程序及結(jié)果報(bào)告WS/T661靜脈血液標(biāo)本采集指南CNAS-CL02-A001醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則的應(yīng)用CNAS-GL037臨床化學(xué)定量檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)CNAS-GL038臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)3.1剛地弓形蟲Toxoplasmagondii3.2身有核細(xì)胞內(nèi),形成包囊后可長(zhǎng)期寄生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或橫紋肌內(nèi),免疫功能正常情況下可不出現(xiàn)明顯WS/T834—202423.3免疫功能低下者或缺陷者易發(fā)病，為機(jī)會(huì)性人4生物安全險(xiǎn)較高的直接鏡檢和組織培養(yǎng)等操作過(guò)程中，存在感染相關(guān)人員的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)嚴(yán)格按照《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室安通?？稍?20℃以下冷凍保存180天。凍存標(biāo)本如需多次使用，能分裝的應(yīng)分裝，避免多次凍融。不同類型和不同檢驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)本，均應(yīng)避免細(xì)菌污染，按照要求常溫或冷鏈和組織活檢標(biāo)本（腦組織、淋巴結(jié)、肺組織、骨髓、肝臟組織、脾臟組織等）。骨髓標(biāo)本應(yīng)使用EDTA檢標(biāo)本，常溫3天內(nèi)送檢。若是多種標(biāo)本需要同一天平行檢測(cè)，在5.4核酸檢測(cè)標(biāo)本W(wǎng)S/T834—20243組織、淋巴結(jié)、肺組織、骨髓、肝臟組織、脾臟組織等）。血液和骨髓標(biāo)本應(yīng)使用EDT5.5血清學(xué)檢測(cè)標(biāo)本項(xiàng)目，可將實(shí)驗(yàn)室分為弓形蟲病初篩實(shí)驗(yàn)室和6.2病原學(xué)檢查用10％甲醛溶液固定，水沖洗，依次經(jīng)70％、8將染液覆蓋涂片、印片或是切片表面，染色1min～3min，滴加等量的磷酸鹽緩沖液至玻片上，輕WS/T834—20244脊液、支氣管肺泡灌洗液或羊水離心沉淀，用培養(yǎng)基將沉淀物重懸后與組織細(xì)胞（血清或體液中的循環(huán)抗原比特異性抗體出現(xiàn)早，是篩查病原體存在的重要依據(jù)，可使用ELISA雙抗附錄A。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)通過(guò)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)的弓形蟲抗原檢測(cè)試劑盒。如果實(shí)驗(yàn)室自行研制檢為確定是否感染，可應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)如聚合靈敏度起著至關(guān)重要的作用。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)通過(guò)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局注冊(cè)的弓形蟲PCR試劑盒為靶基因，引物和探針相結(jié)合使用不僅可提高檢測(cè)的特異性和靈敏度，而且無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物序列為靶基因，并提供靶基因序列、擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件來(lái)介紹實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)弓形蟲核6.3抗體檢測(cè)WS/T834—20245血清學(xué)檢測(cè)弓形蟲抗體是目前臨床實(shí)驗(yàn)室診斷弓形蟲感染的主要方法。IgM、IgG、IgA、IgE和IgG親和力檢測(cè)均有助于弓形蟲感染和弓形蟲病的診斷，檢測(cè)方法主要包括ELISA、化學(xué)發(fā)光免疫分析及免IgM：感染后第1周即可在血清中檢測(cè)到，被認(rèn)為是急性弓形蟲病早期敏感的診斷指標(biāo)IgG：感染后1周～2周可在血清中檢測(cè)到，通常在1個(gè)月～2個(gè)月內(nèi)達(dá)到高峰個(gè)體下降速度不同，往往可終身持續(xù)陽(yáng)性。定性的IgG抗體被認(rèn)為是感染過(guò)的指標(biāo)，無(wú)法區(qū)分既往和近期感染。定量IgG抗體4倍以上滴度或濃度增高可提示近期活動(dòng)IgG親和力：在急性感染期IgG與抗原結(jié)合力較弱，在慢性感染期抗體與抗原結(jié)親和力檢測(cè)是區(qū)分既往和近期感染的另一指標(biāo)。高IgG親和力提示感染至少發(fā)生在3個(gè)月～5個(gè)月之前，為判斷慢性感染最有用的指標(biāo)，可排除急性感染。但I(xiàn)gG低親和力并不一定提示近期感染，因低親和力或是單次檢測(cè)IgM陽(yáng)性，IgG陰性或陽(yáng)性。上述幾種情況一般可以作為弓形蟲近期感染用間接法，IgM檢測(cè)可使用間接法或捕獲法。間接法是將可溶性抗原包被于固相載體；患者血清與抗原取吸光度值。不同廠商的產(chǎn)品操作步驟不盡相同，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。弓形蟲IgG抗體有抗體。計(jì)算尿素處理標(biāo)本與未處理標(biāo)本的終點(diǎn)滴度比值，以百分?jǐn)?shù)CLIA是目前弓形蟲IgG和IgM抗體測(cè)定的主流方法，其精密度、靈敏度和特異性均高于ELISA，可以做IgG、IgM定量檢測(cè)，但需要使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，其中IgG檢測(cè)最常使用間接法或是雙抗原夾心法，IgM檢測(cè)常使用捕獲法。不同廠商的產(chǎn)品檢測(cè)原理和操作步驟不盡相同，應(yīng)按照產(chǎn)品說(shuō)明書要求進(jìn)WS/T834—20246ICT可定性檢測(cè)弓形蟲IgG和IgM抗體。將特異性抗原固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)6.4檢驗(yàn)方法的選擇移植供者、器官移植受者移植前后、HIV陽(yáng)性者、疑似感染者等常規(guī)篩查。有條件的初篩實(shí)驗(yàn)室宜開展弓形蟲IgG親和力檢測(cè)，在弓形蟲IgG檢測(cè)陽(yáng)性后，進(jìn)一步檢測(cè)IgG親和力，以區(qū)為弓形蟲病診斷較難，應(yīng)將IgG、IgM和IgG親和力檢測(cè)結(jié)果提示可能近期感染的患者標(biāo)本送至弓形蟲病目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)官方認(rèn)可的弓形蟲病確證實(shí)驗(yàn)室，此處確證實(shí)驗(yàn)室特指除開展弓形蟲抗體IgG、IgM和IgG親和力檢測(cè)外，還同時(shí)開展弓形蟲病原學(xué)檢查的實(shí)驗(yàn)室。該類實(shí)驗(yàn)室通常至少應(yīng)開展弓形蟲血清行聯(lián)合檢測(cè)，具體可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室自身?xiàng)l件進(jìn)行選擇，但至少應(yīng)包括血清學(xué)篩查試驗(yàn)和1項(xiàng)確證試驗(yàn)，確樣品可以獲取，因此本部分主要規(guī)定弓形蟲7.2室內(nèi)質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室應(yīng)常規(guī)開展弓形蟲檢測(cè)項(xiàng)目的室內(nèi)質(zhì)控。每檢測(cè)日或分析批使用陰性、弱陽(yáng)性和/或陽(yáng)性外部質(zhì)控品進(jìn)行質(zhì)控。陽(yáng)性質(zhì)控品濃度宜在2～4倍臨界值，陰性質(zhì)控品濃度宜在0.5倍臨界值左右。使用7.3實(shí)驗(yàn)室內(nèi)結(jié)果可比性7包括人員（手工）和不同方法/檢測(cè)系統(tǒng)間的比對(duì)，至少選擇2份陰性標(biāo)本（至少1份其它標(biāo)志物陽(yáng)性的原因，并采取必要的糾正指施，及評(píng)估糾正指施的有效性，保留相應(yīng)的結(jié)果不一致時(shí)應(yīng)分析不一致的原因，必要時(shí)，采取有效的糾正措施。應(yīng)保留參加能力驗(yàn)證/室間質(zhì)評(píng)的代方案并提供客觀證據(jù)，確定檢驗(yàn)結(jié)果的可8.2特殊人群發(fā)生感染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估篩查血清中的弓形蟲IgG抗體，選擇ELISA或CLIA等靈敏度高的試驗(yàn)即可。IgG抗體陰性一般提示未獲得感染，陽(yáng)性提示可能感染弓形蟲。以下情況應(yīng)篩查血清中是否存在弓形蟲I——育齡婦女妊娠前：免疫力正常的婦女弓形蟲IgG抗體陽(yáng)性提示有免疫力，將感染垂直傳播給胎——首次HIV陽(yáng)性確診后：弓形蟲IgG抗體陽(yáng)性且CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)＜100/μL,提示存在需要治療——器官移植供者捐贈(zèng)前：供者弓形蟲IgG抗體陽(yáng)性提示受者存在器官移植發(fā)生弓8.3急性獲得性感染的診斷力檢測(cè)結(jié)果能夠提供額外的證據(jù)支持或否定近期感染。IgM陰性基本上可排除近期感染。IgM和IgG均陽(yáng)性可提示近期感染；但是，一些患者初始感染后血清IgWS/T834—20248---±不確定：重新采集標(biāo)本檢測(cè)IgM；如果結(jié)果仍是±,應(yīng)3周內(nèi)重新采集標(biāo)本檢測(cè)。-+±-不確定：重新采集標(biāo)本檢測(cè)IgG；如果結(jié)果仍是±,應(yīng)3周內(nèi)重新采集標(biāo)本檢測(cè)?！馈馈?+-+±不確定：重新采集標(biāo)本檢測(cè)IgM；如果結(jié)果仍是±,應(yīng)3周內(nèi)重新采集標(biāo)本檢測(cè)。++注陽(yáng)性陰性；±,可疑陽(yáng)性。8.4妊娠及孕前感染診斷所有孕婦應(yīng)盡早（妊娠前3個(gè)月最為理想）進(jìn)行弓形體抗體IgG和IgM的篩查試驗(yàn)。妊娠期感染診斷和采取及時(shí)的治療十分重要。疑似母體感染孕婦應(yīng)轉(zhuǎn)至有胎兒醫(yī)學(xué)的產(chǎn)前診斷機(jī)構(gòu)進(jìn)行診治。妊娠后第1次檢測(cè)弓形體抗體IgG和IgM，如果在妊娠的較早階段（4周～12周）IgG抗體陽(yáng)性、IgM感染，IgG親和力高提示慢性感染4個(gè)月基本如果采集胎兒血液標(biāo)本，應(yīng)進(jìn)行病原體形態(tài)學(xué)檢查、弓形蟲IgG、IgM和IgA檢測(cè)。結(jié)合非特異性感WS/T834—20249可做出先天性感染的診斷。新生兒血清弓形蟲IgM或IgA抗體陽(yáng)性，2～4天后復(fù)測(cè)弓形蟲IgM仍為陽(yáng)性，或10天后復(fù)測(cè)弓形蟲IgA仍為陽(yáng)性，提示先天性弓形蟲感染?？梢芍袠猩窠?jīng)系統(tǒng)感染時(shí)，采集腦脊液進(jìn)之外的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。當(dāng)疑似疾病處于活動(dòng)期時(shí)，血清弓形蟲IgG抗體陽(yáng)性支持眼部弓形蟲病的診斷，但呈升高趨勢(shì)，因此弓形蟲IgM抗體陰性不能排除眼部弓組織、胎盤等部位中的蟲體進(jìn)行直接鏡檢、分離培養(yǎng)或核酸檢測(cè)來(lái)確陽(yáng)性供者的移植，有發(fā)生弓形蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)；IgG抗體陽(yáng)性有潛伏感染再激活的風(fēng)險(xiǎn)，宜連續(xù)監(jiān)測(cè)外周所有艾滋病病毒感染者確診后應(yīng)立即檢測(cè)弓形蟲IgG抗體以發(fā)現(xiàn)潛伏感染。大多數(shù)弓形蟲腦炎的艾WS/T834—2024A.1試劑盒目前屬于體外診斷試劑第三類產(chǎn)品的弓形蟲抗體IgG、IgM和IgG親和力測(cè)定試劑盒通過(guò)國(guó)家藥品監(jiān)督管A.2檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證WS/T834—2024B.1.1B1基因序列（基因序列號(hào)AF1gaattcgttcgacagaaagggagcaagagttgggactaaatcgaagctgagatgctcaaagtcgaccgcgagatagaagggctgactcgaaccagatgtgctaaaggcgtcattgctgttctgtcctatcgcaacggagttcttcccagacgtggatggttccgcctccttcgtccgtcgtaatatcaggccttctgttctgttcgctgtctgtctagggcacccttactgcaagagagaggtcatatcgtcccatgaagtcgaccacctgtttcctctcttcactgtcacgtacgacatcgcattcaagggaagagatctctcgttcgtgtattcgagacaagagaggtccgcccccacaagacggctgaagaatgcaacattcttgtgctgcctcctctcatgccagaagaagggtacgtgttgcatcataacaagagctgtatttcccgctggcaaatacaggtgaaatgtacctccagaactagtatcgtgcggcaatgtgccacctcgcctcttgggagaaaaagaggaagagacgctgccgctgttttgcaaatgaaaagtttcgcagtacaccaggagttggattttgtagagcgtctctcttcaagcagcgtattgtcgagtagatcagaaaggaactgccatgagtataagaaaaaaatgtgggaatgaaagagacgctaatgtgtttgcataggttgcagtcactgacgagctcccctctaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcctgcaatcgatagttgaccacgaacgcaacaggagaagaagatcgtgaaagaatacgagaagaggtacacagagatagaagtcgctgcggagacagcgaagactgcggaactcccgtcgcaccagcagcagaggagtgccgggcaagaaaatgagatgcctagaggagacacagcgtgttatgaacaaatcgtttcgcgaagaggagggaacatattatatacagaagaagaacaagagacgtgccgcatgtcgctaagccatcggaagggataaatggcacagtatcacattacagttccgttgattcgtctgatggtgacgaaaggggaagaatagttgtcgcaccaaaactggttattttgaagaagacgagagatggagtgaaccaccaaaaatcggagaaaatcgatggtgtcacgttttttgtcagacttcttccagcaacttctgcctttgttcttttagcctcaatagcaggatgacgcctccctcctatctttcagccaacccagcaaacaactctctgtagagtaacaaagagaaggcaaaacgcgccatcacgaacactcgcagagatgatacagagacgtgtcatcaggtggtcgcttaattttctgtatatagcatttttagaatgcacctttcggacctcaacaaccgtgcaaaaggatcgccacctggtcaagcgtcaaaacgaactatctgtatatctctcaaggaggactggcaacctggtgtcgacaacagaacagctgcagtccggaagccatgaggcactccaacgggcgagtagcacctgaggagatacaaactgctaaacggtccgggtgaaacaatagagagtagtcgccgctactgcccagttgtcatgccatcgacgtagacccagaaatgaggcgagaaattaatattgttagtaaagcattctccggtcgagaggctaaaccacaaaagtgcaaaccatgcgcagccatcagcttaacaaaagcagttggtgatggttgcctcgtctgaaaatggattacttcatcaacgagcccaccacgcagaatcatgctttcccagtgctaaagcgtttctaaagtagccgcggaatgctaaggggatcgcctacgtagcacatgttgtgcctcaccccccagctcgtgcgctcattctcctttcgtgcgcg探針序列5'-CAACAACTGCTCTAGCG-3'（5'端標(biāo)記熒光發(fā)光基團(tuán)如6-carboxyfluorescein，3'端標(biāo)記熒光PCRmaster混合物（含dNTPs、Taq酶、MgCl2等）、100nM探針、900nM(正向和反向)引物，以及模板WS/T834—2024ctgcagggaggaagacgaaagttgtttttttatttttttttctttttgtttttctgatttttgttttttttgatgcgtctgtcgggatgagaccgcggagccgaagtgcgt