外源基因在原核表達體系中的表達

2024/4/251外源基因在原核表達體系中的表達2024/4/252

前言

在分離到某一基因后，要對其編碼蛋白質(zhì)進行研究，最理所當(dāng)然的工作就是表達即：有目的地合成外源基因產(chǎn)物?；虮磉_技術(shù)是基因工程的核心。至今，人們已建立了許多基因表達系統(tǒng)，既有原核生物基因表達系統(tǒng)，也有真核生物基因表達系統(tǒng)。它們各有其特點，包括優(yōu)勢和不足。由于人們對不同系統(tǒng)的研究深度很不一樣，這就決定了它們的成熟程度和應(yīng)用范圍。第2頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/253

如何以大腸桿菌質(zhì)粒DNA為載體克隆一個編碼動物激素的基因，并使之在大腸桿菌中進行表達？簡要說明實驗中可能遇到的問題及可能的解決辦法。第3頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/254第4頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/255

現(xiàn)代生物技術(shù)發(fā)展史上的重要事件

年代事件

1917

KarlEreky首次使用“生物技術(shù)”這一名詞

1943

大規(guī)模生產(chǎn)青霉素

1944

Avery,Macleod和Mccarty通過實驗證明DNA是遺傳物質(zhì)

1953

Watson和Crick闡明了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)

1961《生物技術(shù)和生物工程》雜志創(chuàng)刊

1961–1966破譯遺傳密碼

1970

分離出第一個限制性內(nèi)切酶

1971

Khorana等人合成了完整的tRNA基因

1973

Boyer和Cohan建立了DNA重組技術(shù)

1975

Kohler和Milstein建立了單克隆抗體技術(shù)

1976

第一個DNA重組技術(shù)規(guī)則問世（Struhl,Vapnek,Changetal）

1977

DNA測序技術(shù)誕生

1978

Genentech公司在大腸桿菌中表達出胰島素

1980Guarante等在《科學(xué)》雜志上發(fā)表以質(zhì)粒、乳糖操縱子為基礎(chǔ)建立起來的大腸桿菌表達系統(tǒng)，這一發(fā)明構(gòu)成了大腸桿

菌表達系統(tǒng)的雛形。

美國最高法院對Diamond和Chakrabarty專利案作出裁定，認為經(jīng)基因工程操作的微生物可獲得專利

1981

第一臺商業(yè)化生產(chǎn)的DNA自動測序儀誕生

第一個單克隆抗體診斷試劑盒在美國被批準(zhǔn)

1982

用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的第一個動物疫苗在歐洲獲得批準(zhǔn)

1983

基因工程Ti質(zhì)粒用于植物轉(zhuǎn)化

1988

美國授予對腫瘤敏感的基因工程鼠以專利

PCR方法問世

1990

美國批準(zhǔn)第一個體細胞基因治療方案

1997

美國科學(xué)家培養(yǎng)出第一只克隆綿羊多莉

1998

美國批準(zhǔn)愛滋病疫苗可以進行人體實驗日本科學(xué)家培養(yǎng)出克隆牛，英美等國培養(yǎng)出克隆鼠

2000英國科學(xué)家培養(yǎng)出轉(zhuǎn)基因克隆豬

2001

人類基因組筐架圖公布

2002

水稻基因組筐架圖公布小鼠基因組筐架圖公布

2003

中國科學(xué)家研制的重組腺病毒-p53注射液獲得國家食品藥物監(jiān)督管理局首次批準(zhǔn)的新藥證書，成為世界上第一個獲得

正式批準(zhǔn)的基因治療藥物

2004

英國當(dāng)局（HumanFertilisationandEmbryologyAuthority,HFEA）首次批準(zhǔn)英國一科研單位進行人類細胞核移植治療

性克隆研究

2005

人類基因組“差異圖”公布

10月27日,全球科學(xué)家通過分析全球不同人群之間的遺傳基因信息,初步繪制出首張人類DNA序列中變異基因片段的遺

傳圖譜。該研究結(jié)果不但會進一步改變?nèi)藗儗ι飳W(xué)和人類進化的理解,而且將幫助科研人員更方便地找出與人類主

要疾病(如哮喘、糖尿病、心臟病和癌癥)密切相關(guān)的變異基因,從而改進對這些疾病的預(yù)防、診斷和治療技術(shù)。

(Nature,

2005，437:

1299)

2006

Piwi-干擾RNA

2007在涉及胚胎干細胞和DNA重組方面的一系列突破性發(fā)現(xiàn)第5頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/256基因工程技術(shù)

是將一種生物細胞的基因分離出來，在體外進行酶切和連接并插入載體分子構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，引入另一種宿主細胞后使目的基因得以復(fù)制和表達的技術(shù)。其特點是打破物種界限，賦予生物新的遺傳性；目的是使外源基因在受體細胞內(nèi)按人們期望的方式進行表達。讓任何一種生物接受另一種生物的遺傳物質(zhì)并在其細胞內(nèi)表達功能和穩(wěn)定遺傳在試管內(nèi)直接操作遺傳物質(zhì)改變基因功能,調(diào)節(jié)基因表達方式第6頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/257基因工程的主要研究內(nèi)容1．

獲得具有遺傳信息的目的基因2．

選擇基因載體獲得重組DNA3．

將重組DNA分子導(dǎo)入宿主細胞4．

鑒定帶有目的基因的克隆；目的基因的擴增及獲得目的產(chǎn)物

第7頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/258

基因工程藥物指利用基因工程技術(shù)研制和生產(chǎn)的藥物，主要包括重組蛋白多肽藥物、反義核酸藥物、DNA藥物、siRNA藥物和基因工程抗體等。

第8頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/259基因工程制藥的特點

和傳統(tǒng)制藥業(yè)相比，基因工程制藥有如下突出優(yōu)點?？梢垣@得天然來源難以得到的生理活性物質(zhì)，使之成為新藥。利用基因工程技術(shù)使得活性蛋白、多肽基因可以在微生物、真核細胞乃至動物反應(yīng)器、植物反應(yīng)器中獲得高效表達，使生理活性蛋白多肽可以批量生產(chǎn)，保障臨床治療需要。

提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)以對其結(jié)構(gòu)、功能、性質(zhì)進行深入研究，從而進一步擴大這些活性物質(zhì)的使用范圍。通過基因工程技術(shù)可以不斷發(fā)掘和開發(fā)更多的新型生理活性物質(zhì)。利用基因工程、蛋白工程技術(shù)可以改造內(nèi)源生理活性物質(zhì)，進一步提高其生物活性。采用基因工程技術(shù)可以獲得新型化合物，擴大藥物來源。第9頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2510研究重組表達技術(shù)的目的及意義研究蛋白質(zhì)的作用機理和功能；是研究蛋白質(zhì)的一大基礎(chǔ)技術(shù)，當(dāng)生化提取方法難以獲得足量的蛋白質(zhì)時；重組技術(shù)使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化，獲得各類異構(gòu)體。

第10頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2511

原核表達體系√大腸桿菌表達系統(tǒng)Escherichiacoli

枯草桿菌表達系統(tǒng)Bacillusanthracis

芽孢桿菌表達系統(tǒng)Bacillus

鏈霉菌表達系統(tǒng)Streptomyces第11頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2512

各表達系統(tǒng)的使用率（PubMed)第12頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2513

大腸桿菌表達體系

Escherichiacoli

內(nèi)容提要原核表達的基本知識提高外源基因表達水平的措施介紹幾種表達載體外源基因在大腸桿菌中表達的進展

第13頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2514大腸桿菌質(zhì)粒

一類獨立于染色體外自主復(fù)制的雙鏈、閉環(huán)DNA分子；結(jié)合轉(zhuǎn)移型非結(jié)合轉(zhuǎn)移型不在宿主間轉(zhuǎn)移,整合到染色體上的頻率低,具有遺傳學(xué)上的穩(wěn)定性和安全性.?第14頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2515理想的大腸桿菌表達載體必須具備的基本條件穩(wěn)定的遺傳復(fù)制、傳代能力抗菌素抗性基因（顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記）適用于外源基因插入的酶切位點或具有若干限制酶單一識別位的點較小的分子量和較高的拷貝數(shù)啟動子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控的，抑制時本底轉(zhuǎn)錄水平較低啟動子轉(zhuǎn)錄的mRNA能夠在適當(dāng)?shù)奈恢媒K止，轉(zhuǎn)錄過程不影響表達載體的復(fù)制第15頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2516表達載體的基本元件復(fù)制子篩選標(biāo)記啟動子終止子核糖體結(jié)合位點復(fù)制子：是一段包含復(fù)制起始點、反式因子作用區(qū)在內(nèi)的DNA片段，其功能是通過復(fù)制使質(zhì)粒能穩(wěn)定存在于大腸桿菌內(nèi)。在同一大腸桿菌細胞內(nèi)，同一復(fù)制子類型的不同質(zhì)粒不能存在于同一細胞中，不同復(fù)制子類型的不同質(zhì)?？梢源嬖谟谕患毎?，這就是同種不相容、異種相容現(xiàn)象。?第16頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2517

表達載體

將克隆的真核基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄—轉(zhuǎn)譯信號控制之下。這種按特殊設(shè)計構(gòu)建的，能使克隆在其中特定位點的外源基因的編碼序列，在大腸桿菌中正常轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體。它分為表達型質(zhì)粒載體和表達型噬菌體載體?？煽剞D(zhuǎn)錄啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。第17頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2518

基因表達

系指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及所有加工過程。外源基因在原細胞中的表達系指令克隆的外源基因在原核細胞中以發(fā)酵的方式快速、高效地合成基因產(chǎn)物第18頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2519

用途

克隆化基因?qū)氪竽c桿菌用于大量表達蛋白質(zhì)方法以融合蛋白的形式制備抗真核蛋白的多克隆或單克隆抗體大量產(chǎn)生完整的天然蛋白質(zhì)分子以研究其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生由病毒癌基因和細胞癌基因所編碼的蛋白質(zhì)，微注射到體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞中，以表明其生物學(xué)活性PULL-DOWN實驗，研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用第19頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2520在編碼目的蛋白的基因中引入突變并在細菌中大量生產(chǎn)蛋白突變體的方法，為蛋白質(zhì)工程的研究奠定基礎(chǔ)生產(chǎn)具有醫(yī)用價值的人體蛋白等第20頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2521原核生物與真核生物基因表達的比較第21頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2522

原核生基因表達的特點只有一種RNA聚合酶(真核細胞有三種)，識別原核細胞的啟動子，催化所有RNA的合成。表達是以操縱子為單位的。原核生物由于無核膜,所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是耦聯(lián)的，二者是連續(xù)進行的。特點是當(dāng)mRNA還在生長中時，即還在被DNA轉(zhuǎn)錄的時候，它就開始翻譯了。第22頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2523原核生基因表達的特點不含內(nèi)含子(intron)，原核細胞中缺乏真核細胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。因此外源基因要以cDNA克隆于載體上。其基因的表達控制主要是在轉(zhuǎn)錄水平。大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點上，有一保守順序即AGGAGGU，叫SD(Shine-Dalgarno)順序。與核糖體小亞基上的16SrRNA3'末端序列互補。第23頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2524

真核基因組的特點基因組存在于細胞核內(nèi)，一般是線狀DNA。存在大量的重復(fù)序列和很多不編碼的序列?；蛑谐Ｓ袃?nèi)含子，功能上相關(guān)的基因集中程度總的來講不如原核生物。第24頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2525原核細胞表達真核基因的障礙缺乏真核細胞轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)，成熟的mRNA不能形成。缺乏真核細胞翻譯后的加工系統(tǒng)。第25頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2526外源基因在原核細胞中

表達的重要調(diào)控元件

啟動子在轉(zhuǎn)錄過程中，首先與RNA聚合酶結(jié)合并準(zhǔn)確有效地起始轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列叫做啟動子。-50bp+起始點

+立即下游少數(shù)堿基。由于細菌RNA聚合酶不能識別真核基因的啟動子，因此原核表達載體所應(yīng)用的啟動必須是原核啟動子，將外源基因克隆在其下游，原核RNA聚合酶識別原核啟動子，并帶動真核基因在原核細胞中轉(zhuǎn)錄。與啟動子強度有關(guān)的結(jié)構(gòu)要素有：-35區(qū)順序、-10區(qū)順序、兩者的間隔。第26頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2527原核系統(tǒng)中通常使用的可調(diào)控

的強啟動子有如下幾種1.Lac啟動子操縱子:在原核生物中，共同完成某一生理功能的一些基因，編成一個結(jié)構(gòu)基因簇即構(gòu)成一個操縱子。Lac啟動子來自大腸桿菌的乳糖操縱子。2.LacUV是大腸桿菌經(jīng)紫外誘變，而產(chǎn)生的一個突變的乳糖啟動子對分解代謝抑制不敏感，即使在沒有CAP-cAMP的情況下，轉(zhuǎn)錄也能照常進行。它的-10區(qū)同感序列由TATGTTG突變?yōu)門ATAATG，這是此同感序列中最好的和出現(xiàn)最多的一個。第27頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2528第28頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2529第29頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2530trp啟動子來自于大腸桿菌的色氨酸操縱子。T7噬菌體RNA聚合酶/啟動子系統(tǒng)第30頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2531

表達宿主中的T7RNA

聚合酶可以通過兩種方式提供這是一類以BL21(DE3)為代表的宿主細胞，T7RNA聚合酶基因整合到宿主染色體上，此基因受LacUV5啟動子控制，用IPTG可以誘導(dǎo)LacUV5啟動子表達T7RNA聚合酶，從而表達目的蛋白。以HMSI74為代表的一類宿主細胞，它們不產(chǎn)生T7噬菌體T7RNA聚合酶，可以用帶有T7RNA聚合酶基因的CE6噬菌體感染含有表達質(zhì)粒的宿主細胞，以提供T7RNA聚合酶表達處源基因。第31頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2532T7噬菌體啟動子

10啟動子是T7DNA最強的啟動子，由相對于轉(zhuǎn)錄起始位點-17至+6位置的23個堿基組成，由

10起始的轉(zhuǎn)錄多數(shù)終止于T

10。第32頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2533第33頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25345.PL和PR啟動子

噬菌體的PL和PR啟動子，它們都是強啟動子，比Lac啟動子的活性高8-10倍。PL和PR啟動子受

噬菌體CI基因的的負調(diào)控。CI阻遏蛋白是溫度敏感蛋白。在28~32℃培養(yǎng)時，CI產(chǎn)生抑制作用，在溫度生高至42℃時，CI被可逆的破壞，這樣就解除了對啟動子的封閉，使PL和PR啟動子開始轉(zhuǎn)錄。因此有人稱CI是一個溫度敏感抑制因子。第34頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25356.Tac啟動子Tac啟動子是一組由lac和trp啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子，是非常強的啟動子，它比lacUV5啟動子強7倍。它受lac阻遏蛋白的負調(diào)節(jié)，并被IPTG誘導(dǎo)。第35頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2536

SD順序(Shine-Dalgarno)

這段序列是翻譯所必須的，它是mRNA能進入核糖體的關(guān)鍵。通過序列分析已發(fā)現(xiàn)，一般在翻譯起始密碼前10個左右的核苷酸處有一段序列恰與大腸桿菌中核蛋白體中的小亞單位16SrRNA羧端的序列有互補關(guān)系，這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16SrRNA3’末端的富含嘧啶的序列互補，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點。

UAAGAAGG和AAGGA是最常見的典型序列。第36頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2537

終止子(terminator)

在一個基因的3’末端或是一個操縱子的3’末端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為終止子，在構(gòu)建表達載體時，為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)，防止克隆的外源基因干擾載體的穩(wěn)定性，一般都在多克隆位點的下游插入一段很強的rrnB核糖體RNA操縱子的T1，T2串聯(lián)轉(zhuǎn)錄終止子。第37頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2538RBS（ribosomebindingsite）

指的是SD序列、起始密碼子以及兩者之間的序列。第38頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2539TIR（translationalinitiationregion）

指一切與翻譯起始有關(guān)的順式序列，不僅包括RBS，還包括另一些核糖體結(jié)合位點，以及其它參與二級結(jié)構(gòu)形成影響翻譯的序列。因而TIR的范圍涉及5

不翻譯區(qū)，甚至在多順反子中涉及到上游基因，在3

端涉及編碼序列。對于不同的基因，TIR范圍不盡相同。第39頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2540如何得到符合要求的目的基因鳥槍克隆法人工合成目的基因

酶促方法從真核細胞中分離mRNA，體外反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

化學(xué)合成法

體外合成。聚合酶鏈反應(yīng)設(shè)計并合成兩段引物，以cDNA為模板，進行PCR擴增。

第40頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2541化學(xué)合成基因

按照大腸桿菌慣用密碼子及設(shè)計要求將其編碼的氨基酸轉(zhuǎn)化成核苷酸序列，根據(jù)如下原則：①引物內(nèi)盡量避免二級結(jié)構(gòu)；②引物二二相互重疊的G+C%含量約50%，退火溫度約為56℃；③在合成基因的兩端及中間引入若干酶切位點便于基因操作；④盡量減少引物之間的錯配幾率。第41頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2542原核表達載體的類型

表達載體：是適合在受體細胞中表達處源基因的載體。外源基因可在啟動子的控制下轉(zhuǎn)錄成mRNA，并最終以蛋白質(zhì)的形式在宿主細胞中表達。表達載體分為原核表達載體和真核表達載體兩大類?？烧{(diào)控的強啟動子和有效的核糖體結(jié)合位點(RibosomeBindingSite,RBS)，是原核表達載體表達完整的天然蛋白所必不可少的二個要素。對本身帶有RBS的原核基因，只須提供啟動子即可；而對于真核基因，則必須同時提供啟動子和RBS。第42頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2543原核表達載體的類型

根據(jù)外源基因在原核細胞中產(chǎn)生的表達蛋白的形式的不同，可將其分為：融合型和非融合型表達載體。（1）融合蛋白：指蛋白質(zhì)的N未端由原核DNA序列或其它DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。優(yōu)點：避免細菌蛋白酶的破壞；純化方便；提高真核信號起始翻譯的效率。（2）非融合蛋白：不與細菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達蛋白。第43頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2544融合蛋白表達系統(tǒng)

目的基因被引入某個高表達蛋白序列（fusiontag）的3’末端，比如大腸桿菌的一段序列，或者任一可在大腸桿菌中高度表達的基因，它提供良好表達所必需的信號，而表達出的融合蛋白的N末端含有由fusiontag編碼的片段。Fusiontag所編碼的可能是整個功能蛋白或是其中的部分。比如6×Histag、

-半乳糖苷酶融合蛋白和trpE融合蛋白、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白、硫氧還蛋白（Trx）融合蛋白以及SUMO等。第44頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2545化學(xué)裂解：

溴化氰（CNBr）Met

-X

羥胺（NH4OH）Asn

-GlyBNPS-3-甲基吲哚Trp

-X

部分酸解Asp

-Pro酶解：Xa因子、凝血酶、腸激酶、凝乳酶、膠原酶

FactorXaLleGluGlyArgXThrombinLeuValProArg

GlySerEnterokinase(Asp)4Lys

X裂解融合蛋白以除掉其運載蛋白(fusiontag)第45頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2546

根據(jù)外源重組蛋白可能的命運，將其分為：胞內(nèi)胞外胞外培養(yǎng)基第46頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2547

原核表達載體的舉例

(1)pGEX表達系統(tǒng)(AmershamPharmaciaBiotech)(2)pET表達系統(tǒng)(Novagen)(3)IMPACT表達系統(tǒng)(BioLab)第47頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2548

IMPACT、IMPACT-CN、IMPACT-TWIN是融合表達系統(tǒng)新的重大突破。其優(yōu)點是表達的融合蛋白無需蛋白酶裂解即可以實現(xiàn)目的蛋白與fusiontag的精確切割。第48頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2549

利用pMXB10載體表達純化蛋白

第49頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2550

利用pMXB10載體表達純化蛋白

Maltosebindingprotein(MBP,43kDa)

Lane1:UninducedE.colicells

Lane2:Inducedcelllysate(觀察蛋白表達量)

Lane3:Clarifiedcelllysate(aftersonicationandcentrifugation)(觀察細胞破碎和蛋白可溶性)

Lane4:Lysateafterpassageofachitincolumn(觀察親和柱的蛋白結(jié)合效率)

Lane5:ElutedMBPafter16houron-columncleavagewithDTTat4degree(分析洗脫的目的蛋白)

Lane6:Chitinafterelutionindicatingefficientcleavage(觀察intein裂解效率及未洗脫的目的蛋白)第50頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2551

外源基因在E．coli中表達的研究進展

1.在胞內(nèi)直接表達重組蛋白問題：不溶性包含體的形成，包含體的純化比較容易，但把包含體重新折疊成正確的空間結(jié)構(gòu)以恢復(fù)其生物活性卻非常困難。目前，蛋白質(zhì)復(fù)性問題已成為大腸桿菌表達體系生產(chǎn)蛋白最大的障礙之一。煙臺麥克津（MedGENE）實驗室（ProteinRefoldingPlatform），這項技術(shù)平臺可以使蛋白質(zhì)復(fù)性達到高產(chǎn)量（公斤級水平）、高純度（>99%）、高回收率（>80%）羅永章/docsn/swx/falcuty/luoyongzhang.htm

第51頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2552

外源基因在E．coli中表達的研究進展

解決包含體問題的其它辦法：

（1）共表達分子伴侶GroES/GroEL、DnaK/DnaJ、DsbA、PPI.分子伴侶（molecularchaperone）：能幫助其他蛋白質(zhì)折疊的蛋白。大腸桿菌中的分子伴侶可分兩類：Hsp70伴侶，包括稱為Hsp70、Hsp40、GrpE的蛋白；分子伴素（chaperonin）主要形式為GroES/GroEL復(fù)合體。第52頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2553

外源基因在E．Coli.中表達的研究進展

（2）以融合形式表達重組蛋白谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST、麥芽糖結(jié)合蛋白MBP、金黃色葡萄球菌蛋白A、硫氧還蛋白TrxA融合表達系統(tǒng)。（3）寡聚蛋白的組裝第53頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2554

將包含體轉(zhuǎn)變成有生物

活性的蛋白需要經(jīng)過以下階段粗分離純化包含體；DNase，Lysozyme，低濃度的尿素以除去雜蛋白。溶解包含體得到變性蛋白；≥8Murea+reducingreagentor≥6MGmdcl+reducingreagent純化變性蛋白；Matrixrefoldingseparation將純化的變性蛋白復(fù)性并再純化。

第54頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2555對蛋白折疊的評價和分析

FPLC反相柱，一般復(fù)性的出峰快;SDS，將還原與氧化分開，氧化走的快;質(zhì)譜，熒光發(fā)射光譜，活性測定。第55頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2556

外源基因在E．Coli.中表達的研究進展

2．重組蛋白分泌到周質(zhì)分泌：蛋白質(zhì)跨過細菌的內(nèi)膜定位于周質(zhì)空間，穿過細菌外膜到達胞外的過程。（1）周質(zhì)蛋白跨細菌內(nèi)膜的轉(zhuǎn)運和折疊與分泌蛋白的跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白：Sec蛋白;分子伴侶，

GroES/GroE、DnaK/DnaJ、Ffh/Ffs;DsbA、DsbB、DsbC.第56頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2557（2）周質(zhì)分泌表達的影響因素啟動子、信號肽、蛋白酶缺陷型宿主、蛋白質(zhì)本身、生長條件。（3）共表達分子伴侶或折疊酶第57頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2558

外源基因在E．Coli.中表達的研究進展3．重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中

細菌素釋放蛋白（bacteriocinreleaseproteinBRP)系統(tǒng)

-溶血素（heamolysinA,HLyA)系統(tǒng)第58頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2559提高外源基因表達水平的措施表達質(zhì)粒的優(yōu)化設(shè)計共表達大腸桿菌稀有密碼子tRNA基因提高目標(biāo)基因mRNA和目標(biāo)基因產(chǎn)物的穩(wěn)定性高密度發(fā)酵和工程化宿主細胞第59頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2560具體措施

1.提高翻譯水平利用計算機輔助設(shè)計調(diào)整SD序列與AUG間的距離密碼子的偏性，用點突變的方法改變某些堿基

5’端重建，增加A+T的含量，降低二級結(jié)構(gòu)增加mRNA的穩(wěn)定性終止子的存在第60頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25612．減輕細胞的代謝負荷誘導(dǎo)表達，使細菌的生長與外源基因的表達分開表達載體的誘導(dǎo)復(fù)制表達分泌蛋白第61頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25623．提高表達蛋白的穩(wěn)定性，防止其降解克隆一段原核序列，表達融合蛋白或給基因加入一些氨基酸的密碼子來延長表達蛋白的半壽期（如在N端加入一個氨基酸）改變蛋白內(nèi)部的PEST序列采用某種突變菌種，保護表達蛋白質(zhì)不被降解表達分泌蛋白。第62頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2563外源蛋白質(zhì)在E.coli中的穩(wěn)定性受那些因素的影響？蛋白質(zhì)的酶解作用結(jié)構(gòu)決定因子（structuredeterminants)表達部位分子伴侶第63頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2564結(jié)構(gòu)決定因子（structuredeterminants)N-端法則（N-endrule):在生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的新陳代謝的半壽期，主要是取決于N-氨基酸的特性高穩(wěn)定的氨基酸（t1/2>20h)固有的不穩(wěn)定的氨基酸(t

1/2=2~30min)AlaCysGlyMetProSerThrValArgHisIleLeuLysPheTrpTyr內(nèi)部的PEST序列：真核蛋白質(zhì)的氨基酸序列所存在的富含Pro,Glu,Ser,Thr的區(qū)段。這種序列兩側(cè)經(jīng)常被一些帶正電荷的氨基酸簇所包圍。第64頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2565提高細胞內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)表達的方法

通過基因誘變抑制包涵體形成促進折疊增加表達產(chǎn)物可溶性分子內(nèi)伴侶：前導(dǎo)肽，枯草桿菌的絲氨酸蛋白酶，NGF，融合伴侶等目的蛋白與分子伴侶同時表達將復(fù)合蛋白的不同亞基同時表達分泌性表達改變大腸桿菌的生長溫度改變發(fā)酵條件。由于作為結(jié)構(gòu)或催化反應(yīng)的輔基多為含金屬的蛋白質(zhì)實用低拷貝數(shù)質(zhì)粒，改變表達速率第65頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2566重組蛋白質(zhì)純化技術(shù)對于重組蛋白的純化要依其表達形式的不同，采用不同的純化工藝。1．

AKTA系統(tǒng)（AmershamPharmaciaBiotech）多種可供選擇的載體：Source系列,Mono系列,Mini系列,Superdex系列,STREAMLINE系列等。2．

擴張柱床吸附技術(shù)3．

徑向膜層析技術(shù)4．

灌注層析技術(shù)5．

液相萃取技術(shù)6．

置換層析技術(shù)7．

金屬螯合親合層析第66頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2567

怎樣使不穩(wěn)定蛋白在分離純化

中保持其穩(wěn)定性和活性控制影響蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的因素溫度，蛋白酶，緩沖液組成，搖動和剪切，高壓等。利用分離純化的新技術(shù)保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性在線透析，擴張床吸附，親合層析，灌注層析，色譜復(fù)興及同時純化。

第67頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2568

以大腸桿菌為代表的體系具有工藝簡便、成本低、表達量高、周期短的特點。誘導(dǎo)表達方式多種，包括溫度誘導(dǎo)、IPTG誘導(dǎo)表達形式齊全，有胞間質(zhì)可溶型、包含體型、融合表達型。該體系的多樣性有利于產(chǎn)品表達工藝的快速選擇、優(yōu)化。采用大腸桿菌表達外源蛋白水平一般能達到500-1000mg/L。

第68頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2569

酵母表達體系，如畢赤酵母。近年來越來越多的大分子蛋白在該表達體系中得到高效、穩(wěn)定表達。畢赤酵母蛋白產(chǎn)物糖基化簡單，產(chǎn)物直接以可溶性，天然性形式分泌到胞外。該系統(tǒng)具有高表達、高穩(wěn)定、高分泌的特點，非常適合于基因工程高密度的發(fā)酵培養(yǎng)。采用畢赤酵母表達外源蛋白水平一般能達到500-4000mg/L。除畢赤之外酵母之外，用漢遜酵母表達外源蛋白也有較滿意的結(jié)果。第69頁,共90頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2570

哺乳動物細胞表達體系：如CHO細胞