臨床實(shí)驗(yàn)室中的質(zhì)譜分析和質(zhì)譜儀

臨床實(shí)驗(yàn)室中的質(zhì)譜分析和質(zhì)譜儀臨床實(shí)驗(yàn)室中的質(zhì)譜分析和質(zhì)譜儀

整整100年（1912）以前，英國(guó)科學(xué)家Thomson（JosephJohnThomson）憑借對(duì)不同質(zhì)量成分進(jìn)行分離的方法證明了氖氣是由兩種同位素構(gòu)成的，這是首次提出了質(zhì)譜（質(zhì)量譜）的概念，同時(shí)也是首次實(shí)驗(yàn)證明了穩(wěn)定同位素存在。在此后的100年中質(zhì)譜分析及執(zhí)行質(zhì)譜分析的質(zhì)譜儀有了劃時(shí)代的的發(fā)展，從一項(xiàng)只有在資深科學(xué)家實(shí)驗(yàn)室中才可能掌握的技術(shù)逐漸演變成了可以廣泛使用的分析技術(shù)。在100年的進(jìn)程中，項(xiàng)技術(shù)的重要性日益顯現(xiàn)，也因此有6位科學(xué)家先后由于對(duì)質(zhì)譜分析的突出貢獻(xiàn)而榮獲諾貝爾獎(jiǎng)。

色譜與質(zhì)譜的聯(lián)用在質(zhì)譜分析的發(fā)展中具有重要的意義。首先是從1968年開(kāi)始?xì)庀嗌V與質(zhì)譜的聯(lián)用（GC-MS）革命性地改變了對(duì)揮發(fā)性化合物的分析的水平，到了上世紀(jì)80年代高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的實(shí)現(xiàn)，又促成了對(duì)非揮發(fā)性化合物分析水平的重大進(jìn)步，從而實(shí)現(xiàn)了另一次飛躍。隨之而來(lái)的技術(shù)的發(fā)展也使早年主要用于小分子量化合物分析的質(zhì)譜演變成可對(duì)極大分子量的生物大分子進(jìn)行分析，本世紀(jì)初已有報(bào)道顯示了對(duì)完整病毒顆粒的質(zhì)譜分析（分子量約40.5MDa）。此外，在質(zhì)譜的分辨率、準(zhǔn)確度、靈敏度方面也完成了數(shù)個(gè)數(shù)量級(jí)的提高。

半個(gè)多世紀(jì)以前，質(zhì)譜開(kāi)始被應(yīng)用于有機(jī)化學(xué)，并逐漸成為有機(jī)分析中最重要的手段之一。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，最先用上質(zhì)譜的是與有機(jī)化學(xué)密切相關(guān)的藥物化學(xué)，成為在藥物分析、藥物代謝等方面的研究中必不可少的武器，但是這還并不是裝備在以直接服務(wù)于臨床、以常規(guī)分析為主的臨床實(shí)驗(yàn)室中。最早進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)譜儀是GC-MS，在上世紀(jì)80年代初GC-MS開(kāi)始被引入臨床實(shí)驗(yàn)室，主要用于分析尿液中的代謝物以監(jiān)測(cè)新生兒先天性代謝異常。大約20多年后，更為實(shí)用、高效、應(yīng)用更為廣泛的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）進(jìn)入了臨床實(shí)驗(yàn)室，成為臨床實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的潮流及日益重要的裝備。另外，電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）對(duì)體液中痕量元素的測(cè)定、最近發(fā)展起來(lái)的用于病原微生物檢定的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF）等也開(kāi)始愈來(lái)愈多的出現(xiàn)在臨床實(shí)驗(yàn)室。一、

質(zhì)譜分析的工作原理

質(zhì)譜的工作原理是令帶電的顆粒通過(guò)磁場(chǎng)，使得具有不同質(zhì)荷比（m/z）的成分得到分離，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)分子的測(cè)定。因此分析的第一步必然是需將待分析的化合物（M）轉(zhuǎn)變成氣相的離子，有多種方法可完成這一轉(zhuǎn)變，下面的反應(yīng)式是以電子電離的法為例：

M

+e?→M?++2e?

上式中M表示待分析的化合物，它在電子的作用下形成活化態(tài)的陽(yáng)離子（M?+），M?+也可以進(jìn)一步在化學(xué)鍵處斷裂形成碎片，隨后將這一系列轉(zhuǎn)變中形成的產(chǎn)物按照其質(zhì)荷比加以分離并將測(cè)定結(jié)果顯示出來(lái)，這就是質(zhì)譜圖，分析結(jié)果也可以用列表的形式表現(xiàn)。下圖及列表就以一個(gè)簡(jiǎn)單化合物--甲醇為例，說(shuō)明質(zhì)譜分析的原理。

圖一中（或表列中）顯示了一系列不同質(zhì)荷比的譜峰，這其中有兩個(gè)譜峰更為重要。一個(gè)是基礎(chǔ)峰（Basepeak），也即譜圖中最高的峰，在甲醇的例子中是m/z為31的峰，相應(yīng)為CH3O+的片段，因?yàn)榉甯叽砹嗣總€(gè)成分的的濃度，這個(gè)最高的譜峰就設(shè)定為100%，其他的峰都表示為與它相比的百分?jǐn)?shù)，如此就可以得到了各個(gè)成分的相對(duì)豐度。另一個(gè)重要的峰是分子離子峰（molecularionpeak），即甲醇分子電離后未被進(jìn)一步打碎的成分所形成的譜峰,在此圖中為m/z等于32的譜峰，相應(yīng)為[CH3OH-]?+。其它的譜峰代表了不同化學(xué)鍵斷裂的結(jié)果，如m/z為15的譜峰表示了CH3的存在。由于同位素的存在，在分析結(jié)果中還有m/z為33譜峰，它的出現(xiàn)是由于C13同位素的存在。二、

質(zhì)譜儀

進(jìn)行質(zhì)譜分析的儀器稱作質(zhì)譜儀。通過(guò)上述對(duì)質(zhì)譜分離原理的了解，可以知道質(zhì)譜儀雖然有許多不同的設(shè)計(jì)，但都是由實(shí)現(xiàn)如下基本功能的結(jié)構(gòu)組成：

1.

將樣品分子生成離子（離子源）；

2.

按照m/z的大小對(duì)離子進(jìn)行分離（質(zhì)量分析器）；

3.

對(duì)選定的離子進(jìn)行破碎并在下一個(gè)質(zhì)量分析器重再進(jìn)行分析（串聯(lián)質(zhì)譜具有的功能）；

4.

將分離后的離子轉(zhuǎn)變成電信號(hào)并測(cè)量其豐度（檢測(cè)器）；

5.

處理信號(hào)、顯示結(jié)果、控制儀器（電腦）。離子源：

多種離子化技術(shù)可被使用在質(zhì)譜儀中，針對(duì)被分析物的性質(zhì)和考慮到離子化過(guò)程中內(nèi)部能量的傳遞可選擇不同的離子化技術(shù)。例如電子電離、化學(xué)電離、場(chǎng)電離僅適用于易揮發(fā)、熱穩(wěn)定的化合物；對(duì)于熱不穩(wěn)定及不易揮發(fā)的化合物就需要能直接將這些化合物提取到氣態(tài)的方法。這種直接的離子源有兩類：液相離子源和固相離子源。在液相離子源中被分析物是處于溶液中，需將溶液霧化并在大氣壓中中形成離子，然后在真空的作用子下迫使離子進(jìn)入分析器，這類離子源有電噴霧（Electro-spray，ESI）、大氣壓中化學(xué)電離（Atmosphericpressurechemicalionization，APCI）等。在固相離子源中，被分析物處于不揮發(fā)的沉積狀態(tài)，這種沉積狀態(tài)可由各種制備方法產(chǎn)生，其制備過(guò)程經(jīng)常會(huì)涉及引入一種固體或非揮發(fā)性液體做為基質(zhì)，被分析化合物的沉積隨后經(jīng)高能粒子或光子照射使沉積物表面的離子釋放出來(lái)并在電場(chǎng)的作用下進(jìn)入分析器，這類離子源有基質(zhì)輔助激光解析（Matrix-assistedlaserdesorption）、等離子體解析(Plasmadesorption)離子源等。質(zhì)量分析器

質(zhì)量分析器可由不同的原理發(fā)展而成。大致而言它們可以分為兩類，一類是以時(shí)間的尺度將不同質(zhì)荷比的離子進(jìn)行分離，例如四級(jí)桿質(zhì)譜；另一類則是以空間的尺度將不同質(zhì)荷比的離子進(jìn)行分離，例如離子阱質(zhì)譜。當(dāng)然分類也可以用質(zhì)量分析器的其他性質(zhì)，比如脈沖式的或是連續(xù)式的等等。隨著儀器的發(fā)展，也出現(xiàn)許多將不同的質(zhì)量分析器聯(lián)用的組合，例如四級(jí)桿-飛行時(shí)間（Quadrupole-TOF）等。當(dāng)評(píng)價(jià)一臺(tái)質(zhì)譜儀的性能，一般會(huì)考慮到以下這些因素：可分析的質(zhì)量區(qū)間、分析速度、傳送能力（進(jìn)入分析器與到達(dá)檢測(cè)器離子的比例）、質(zhì)量準(zhǔn)確度和分辨度。表一列出了某些常用質(zhì)量分析器的基本特征。

兩個(gè)或數(shù)個(gè)質(zhì)量分析器可被串聯(lián)起來(lái)使用，使得在前級(jí)質(zhì)量分析器中的選定碎片在后一級(jí)質(zhì)譜中得到進(jìn)一步分析，這樣的質(zhì)譜被稱為串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS或MSn）。也可以將色譜（氣相或液相）連接在離子源的前端做為樣品的輸入裝置，使得色譜的分離能力與質(zhì)譜的分離鑒定能力得到疊加，被稱為色質(zhì)聯(lián)用（GC-MS或LC-MS）,聯(lián)用的質(zhì)譜部分自然也可以是串聯(lián)質(zhì)譜。目前臨床實(shí)驗(yàn)室中最常用的質(zhì)譜就是液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）。檢測(cè)器和電腦

檢測(cè)器的作用在于使通過(guò)質(zhì)量分析器的離子產(chǎn)生電信號(hào)（電流），此電流的強(qiáng)度與其豐度成比例。對(duì)離子的測(cè)定無(wú)非總是根據(jù)其電荷、質(zhì)量或是速率。由于在每個(gè)特定時(shí)間點(diǎn)上由質(zhì)量分析器中出來(lái)的離子有限，其所形成的電流也十分有限，因此其后部都連有放大電路。檢測(cè)器與質(zhì)譜的其他部件一樣仍處于不斷發(fā)展之中以應(yīng)對(duì)新的需求，例如測(cè)定質(zhì)量很大的離子。

電腦在質(zhì)譜分析中的基本作用與許多分析儀器基本相同，主要有三個(gè)功能：控制儀器、獲取和加工分析資料集對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行解讀，從而最后向用戶輸出一份分析結(jié)果的報(bào)告。這其中涉及到模數(shù)信號(hào)的轉(zhuǎn)換、分析過(guò)程中的取樣頻率與分析質(zhì)量的關(guān)系，用戶也應(yīng)該對(duì)所用數(shù)據(jù)庫(kù)的特點(diǎn)有所了解，以便對(duì)電腦給出的分析結(jié)果有正確的解讀。三、

質(zhì)譜在臨床實(shí)驗(yàn)室中的主要應(yīng)用

（1）

治療藥物濃度檢測(cè)（TDM）

同樣的藥物用在不同病人身上效果往往是有差異的，這里面有遺傳的因素也有環(huán)境的影響，其主要的表現(xiàn)則為代謝上的差異。對(duì)病人用藥后血藥濃度的檢測(cè)將大大提高用藥的合理性并避免或減少副作用的出現(xiàn)。圖二顯示了血藥濃度檢測(cè)的基本概念。

圖中的曲線顯示了連續(xù)用藥后血藥濃度的變化：每次用藥后血藥濃度在較快的上升至最大濃度后逐漸下降，至一定的水平后給予第二次用藥。合理的用藥應(yīng)該注意到兩點(diǎn)：一是血藥濃度的最高水平不得超越藥物的毒性水平；二是后繼用藥必需在不低于該藥物的最低有效水平前給予。具有下列特點(diǎn)的藥物最應(yīng)該進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)：毒性大而且毒性水平與有效濃度之間區(qū)間窄的藥物；個(gè)體間藥代動(dòng)力學(xué)差異大的藥物；需長(zhǎng)期使用的藥物?；蚴沁€有一條：價(jià)格昂貴的藥物。

用于器官移植等病情的免疫抑制劑是符合上述需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)的一個(gè)很好的例子。上世紀(jì)八十年代出現(xiàn)的環(huán)孢霉素（Cyclosporine）大大提高了器官移植的成功率并明顯延長(zhǎng)了接受器官移植者的生命。環(huán)孢霉素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上是一種親脂性的多肽，溶解性差也不易吸收，其有效的血濃度范圍很窄，每位病人對(duì)環(huán)孢霉素的吸收能力差異性很大，形成劑量高會(huì)造成對(duì)腎臟的毒性，劑量低則不能抑制排斥的出現(xiàn)，檢測(cè)和控制血藥濃度是必要的治療手段。繼環(huán)孢霉素之后又研發(fā)出一些有效的免疫抑制劑，如他克莫司（Tacrolimus，F(xiàn)K506）、西羅莫司（Sirolimus）、依維莫司（Everolimus）等，用藥時(shí)也都有進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)的需求。

以針對(duì)某種藥物的抗體為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的血藥濃度檢測(cè)曾是廣為使用的檢測(cè)技術(shù)，但近年來(lái)發(fā)展成功的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜已經(jīng)越來(lái)越成為主流的檢測(cè)手段。主要的原因是：質(zhì)譜可以準(zhǔn)確地針對(duì)原藥分子，而不像免疫測(cè)定難以避免的會(huì)與原藥的某些代謝產(chǎn)物出現(xiàn)交叉反應(yīng)；質(zhì)譜法可以同時(shí)檢測(cè)到多種藥物的血藥水平（如數(shù)種免疫抑制劑，圖三）；快速簡(jiǎn)便。

表二列出除免疫抑制劑以外，其他值得用LC-MS/MS進(jìn)行治療藥物濃度檢測(cè)的一些例子。(2)與疾病相關(guān)體液成分的檢測(cè)

體液各種成分的種類和含量與人體的健康水平密切相關(guān)，也往往反映疾病的是否存在或是病情輕重的指標(biāo)。了解體液特定成分的含量或全面掃描體液中的各種成分來(lái)反映機(jī)體的健康狀況是多年來(lái)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)界努力追求的目標(biāo)。質(zhì)譜分析可同時(shí)檢測(cè)多種靶標(biāo)及其快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)使它必然成為一種有極大潛力的醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)。

質(zhì)譜目前在這一領(lǐng)域最為廣泛使用的是對(duì)新生兒遺傳代謝病的篩選。新生兒遺傳代謝病是指一組包含多種涉及到多種氨基酸代謝、脂肪酸代謝及有機(jī)酸代謝的隱性遺傳病，由父母雙方遺傳給后代，遺傳缺陷的所在位置分別是各種代謝環(huán)節(jié)中的催化劑--酶。其中發(fā)病率比較最高的是苯丙酮尿癥（根據(jù)德國(guó)、美國(guó)、卡塔爾、日本共70多萬(wàn)例的篩選結(jié)果，苯丙酮尿癥的發(fā)病率約為7.8/十萬(wàn)人，另?yè)?jù)一份報(bào)告對(duì)中國(guó)調(diào)查的結(jié)果是大約為18000個(gè)新生兒中出現(xiàn)一例）。苯丙酮尿癥發(fā)病的原因是由于在12號(hào)染色體長(zhǎng)臂上編碼苯丙氨酸羥化酶的基因（PAH）出現(xiàn)畸變，導(dǎo)致苯丙氨酸羥化酶的功能下降，使苯丙氨酸難以代謝成酪氨酸。這將一方面使苯丙氨酸聚集造成神經(jīng)系統(tǒng)等方面的毒性，另一方面又由于酪氨酸的缺乏使其形成神經(jīng)介質(zhì)及色素等方面的功能被削弱。盡早的治療（主要是飲食控制）有可能恢復(fù)病兒的正常成長(zhǎng)，喪失治療時(shí)機(jī)則不免形成終身殘障。圖四顯示了苯丙酮羥化酶的催化作用，這一催化作用的受損將是苯丙酮尿癥的起因。

除了苯丙酮尿癥外，還有幾十種有遺傳代謝病，例如在中國(guó)人中發(fā)病較多的甲基丙二酸血癥等等。這些疾病雖然在發(fā)病機(jī)制中涉及的酶各不相同，但有一些共同的特點(diǎn)：（1）發(fā)病的早期癥狀類同；（2）如發(fā)病早期得不到及時(shí)的治療，轉(zhuǎn)歸會(huì)十分兇險(xiǎn)，例如發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙或生命夭折；（3）大部分疾病如能得到早期診斷和治療，會(huì)有明顯的治療效果。LC-MS/MS由于具有快速對(duì)多個(gè)靶標(biāo)（約60個(gè)）同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)的能力，是目前最為有效的對(duì)這組疾病的篩選檢測(cè)方法。

根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）2012年發(fā)布的有關(guān)用串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行新生兒篩查的指南（ISSN0273-3099）建議檢測(cè)的疾病列于表三。

4.

AdawayJ.E.andKeevilB.C.,“TherapeuticDrugMonitoringandLC-MS/MS”,J.ChromatographyB,883-884:33-49,2012

5.

GiebelR.etal.,“MicrobialFingerprintingusingMAL