中學(xué)生物微生物課程培訓(xùn)

關(guān)于中學(xué)生物微生物課程培訓(xùn)一、土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制消毒滅菌土樣稀釋平板劃線涂布平板菌落計(jì)數(shù)二、染色技術(shù)芽孢染色、革蘭氏染色三、顯微鏡直接計(jì)數(shù)第2頁,共41頁，2024年2月25日，星期天一、培養(yǎng)基六要素：碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生長(zhǎng)因子、水根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選用、設(shè)計(jì)最適合微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。加富性的選擇培養(yǎng)基（投其所好），固體培養(yǎng)基1、選擇培養(yǎng)基配方：

15.0g瓊脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO4水：1000ml第一專題土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)第3頁,共41頁，2024年2月25日，星期天

培養(yǎng)基的氮源為尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作為氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，而受到抑制，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。第4頁,共41頁，2024年2月25日，星期天怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基胨牛肉膏蛋白培養(yǎng)基是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性只生長(zhǎng)尿素細(xì)菌生長(zhǎng)多種微生物第5頁,共41頁，2024年2月25日，星期天2、牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基配方（用于分離和培養(yǎng)細(xì)菌，是一種天然培養(yǎng)基）配方如下：

牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g瓊脂20g自來水1000mLpH7.4～7.6第6頁,共41頁，2024年2月25日，星期天3、步驟：稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，加熱溶解。調(diào)pH值：用NaOH或HCl調(diào)pH，用pH試紙對(duì)照。加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當(dāng)補(bǔ)水。分裝：注意不要污染棉塞。包扎成捆，掛上標(biāo)簽,注明何種培養(yǎng)基。滅菌備用：培養(yǎng)基滅菌后必須在370C下恒溫培養(yǎng)24h，確定無菌生長(zhǎng)，方可使用。第7頁,共41頁，2024年2月25日，星期天第8頁,共41頁，2024年2月25日，星期天二、消毒滅菌消毒：使用理化因素方法殺死物體表面絕大多數(shù)微生物的方法。滅菌：采用強(qiáng)烈的理化方法殺死物體內(nèi)外所有微生物的方法。干熱滅菌法：電熱烘箱作為干熱滅菌器高壓蒸汽滅菌1.構(gòu)造：（1）鍋體：一般以2KW電熱管作內(nèi)熱源，直接浸在鍋內(nèi)水中，通電后產(chǎn)生蒸汽。另附有支架，以承受內(nèi)鍋體。（2）內(nèi)鍋：由鋁楹嵌接而成，用于承放待滅物品。底附有活動(dòng)的柵格板，以防回流冷凝水將物品弄濕。其邊上還有一用于插排氣管的槽。（3）鍋蓋：上有木把手、安全閥、放氣閥、壓力表（4）其它：橡皮墊圈、旋鈕等第9頁,共41頁，2024年2月25日，星期天高壓蒸汽滅菌法其步驟如下：

1.滅菌器內(nèi)加入一定量的水，將包扎好的物品放入其中。

2.接通電源，進(jìn)行加熱

3.排除高壓鍋內(nèi)的冷空氣，可將排氣閥打開，待排出大氣后關(guān)閉排氣閥；或關(guān)閉排氣閥，待壓力上升到0.5kg/cm2時(shí)再打開排氣閥，待壓力回復(fù)到0時(shí)再關(guān)閉排氣閥。

第10頁,共41頁，2024年2月25日，星期天4.當(dāng)壓力達(dá)1.05kg/cm2時(shí)，此時(shí)滅菌器內(nèi)的溫度為1210C，維持30min。對(duì)熱不穩(wěn)定的培養(yǎng)基如含有葡萄糖、氨基酸等物時(shí)，應(yīng)適當(dāng)降低壓力，延長(zhǎng)時(shí)間。

5.滅菌時(shí)間一到，切斷電源，待壓力降至零時(shí)，才能打開排氣閥，然后打開滅菌器蓋，取出物品。第11頁,共41頁，2024年2月25日，星期天間歇滅菌法：待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1次，每次煮沸1h，連續(xù)3d重復(fù)進(jìn)行。在每?jī)纱握糁笾g，將物品（指培養(yǎng)基）放在370C恒溫條件下培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的芽孢萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)體，以便下次蒸煮時(shí)殺滅。過濾除菌法：不能用加熱滅菌的液體物質(zhì)（如維生素、血清），一般可用細(xì)菌過濾器進(jìn)行除菌。第12頁,共41頁，2024年2月25日，星期天紫外線滅菌法：一般30W燈管，9m3空間，距地面2m每次打開紫外線照射0.5h，就使室內(nèi)空氣滅菌。若照射紫外線時(shí)先噴灑石炭酸等化學(xué)消毒劑，可增強(qiáng)滅菌效果。紫外線雖有較強(qiáng)的殺菌力，但穿透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。

第13頁,共41頁，2024年2月25日，星期天前面配制的牛肉膏蛋白胨、尿素選擇性培養(yǎng)基包扎、滅菌。每組包扎平板2包，5個(gè)/包；包扎1ml吸管5根；1瓶加玻珠無菌水45ml；9ml無菌水試管6根；第14頁,共41頁，2024年2月25日，星期天三、分離與菌落計(jì)數(shù)1、稀釋涂布平板法（1）倒平板在無菌培養(yǎng)皿底部注明分離菌名、稀釋度、組別、班級(jí)。（2）制備土壤稀釋液（3）涂布（4）培養(yǎng)（5）挑菌落第15頁,共41頁，2024年2月25日，星期天如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30——300的平板，則說明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)，如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大，表明試驗(yàn)不精確，需要重新實(shí)驗(yàn)。第16頁,共41頁，2024年2月25日，星期天2、平板菌落計(jì)數(shù)同一稀釋度重復(fù)平板不能少于3個(gè)，重復(fù)平板數(shù)多使統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。同時(shí)10-6,10-7每個(gè)稀釋度計(jì)算出的每克土樣中所含菌落形成的單位數(shù)也不應(yīng)相差太大。計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M第17頁,共41頁，2024年2月25日，星期天平板劃線法第18頁,共41頁，2024年2月25日，星期天接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等第19頁,共41頁，2024年2月25日，星期天第二專題微生物的顯微直接計(jì)數(shù)法

目的：了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造、計(jì)數(shù)原理和計(jì)數(shù)方法，掌握顯微鏡下直接計(jì)數(shù)的技能。原理：測(cè)定微生物細(xì)胞數(shù)量的方法很多，通常采用的有顯微直接計(jì)數(shù)法和平板計(jì)數(shù)法。顯微計(jì)數(shù)法適用于各種含單細(xì)胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計(jì)數(shù)板，一般細(xì)菌則采用彼得羅夫·霍澤（Petrof

Hausser）細(xì)菌計(jì)數(shù)板。

第20頁,共41頁，2024年2月25日，星期天兩種計(jì)數(shù)板的原理和部件相同，只是細(xì)菌計(jì)數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計(jì)數(shù)板較厚，不能使用油鏡，計(jì)數(shù)板下部的細(xì)菌不易看清。血球計(jì)數(shù)板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)，計(jì)數(shù)區(qū)的刻度有兩種：一種是計(jì)數(shù)區(qū)分為16個(gè)大方格（大方格用三線隔開），而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成25個(gè)大方格（大方格之間用雙線分開），而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計(jì)數(shù)區(qū)是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計(jì)數(shù)區(qū)都由400個(gè)小方格組成。第21頁,共41頁，2024年2月25日，星期天圖1血球計(jì)數(shù)板第22頁,共41頁，2024年2月25日，星期天計(jì)數(shù)區(qū)邊長(zhǎng)為1mm，則計(jì)數(shù)區(qū)的面積為lmm2，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計(jì)數(shù)區(qū)的高度為0.1mm，所以每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)的體積為0.1mm3（10-4ml）。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，先要測(cè)定每個(gè)小方格中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)步驟1．鏡檢計(jì)數(shù)室：加樣前，將血球計(jì)數(shù)板及蓋玻片用擦鏡紙或綢布擦干凈后，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢，若有污物需要清洗，干燥后使用。第23頁,共41頁，2024年2月25日，星期天2．視待測(cè)菌液濃度，加無菌水適當(dāng)稀釋，以每小格的菌數(shù)可數(shù)（以每中格10-20個(gè)酵母菌為宜）。3．把蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板的刻度上，以玻棒（或滴管）沾取巳稀釋的酵母茵懸液，從蓋玻片的一端注入，使菌液沿兩玻片間滲入（勿使菌液流到兩邊平臺(tái)上，否則使盞玻片抬高），并用吸水紙吸干溝槽中流出的多余菌液。血球計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)第24頁,共41頁，2024年2月25日，星期天4．計(jì)數(shù)方法：16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)板，需計(jì)數(shù)左上、右上、左下、右下4個(gè)中格（共100個(gè)小格）的酵母菌。25（中格）×16（小格）規(guī)格的計(jì)數(shù)板，除計(jì)數(shù)左上、右上、左下、右下4個(gè)中格外還需加數(shù)中央的一個(gè)中格（共80個(gè)小格，5個(gè)中方格）的酵母菌。5.計(jì)算公式：五個(gè)中方格中總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，

酵母菌細(xì)胞數(shù)/ml=A×16×l04×B(16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)板)酵母菌細(xì)胞數(shù)／ml=A×25×l04×B(25×16規(guī)格的計(jì)數(shù)板)55第25頁,共41頁，2024年2月25日，星期天計(jì)數(shù)原則：位于格線上的菌體一般只數(shù)上方和右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小達(dá)到母細(xì)胞的一半時(shí)，即作兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)。使用完畢后，將血球計(jì)數(shù)板在水籠頭上用水柱沖洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。第26頁,共41頁，2024年2月25日，星期天芽孢染色無菌操作微生物涂片掌握細(xì)菌的芽孢染色（枯草桿菌）熟煉顯微鏡使用第27頁,共41頁，2024年2月25日，星期天細(xì)菌的芽孢染色原理細(xì)菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易著色，若用一般染色法只能使菌體著色而芽孢不著色（芽孢呈無色透明狀）。芽孢染色法就是根據(jù)芽孢既難以染色而一旦染上色后又難以脫色這一特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。所有的芽孢染色法都基于同一個(gè)原則：除了用著色力強(qiáng)的染料外，還需要加熱，以促進(jìn)芽孢著色。當(dāng)染芽孢時(shí)，菌體也會(huì)著色，然后水洗，芽孢染上的顏色難以滲出，而菌體會(huì)脫色。然后用對(duì)比度強(qiáng)的染料對(duì)菌體復(fù)染，使菌體和芽孢呈現(xiàn)出不同的顏色，因而能更明顯地襯托出芽孢，便于觀察。第28頁,共41頁，2024年2月25日，星期天涂片干燥固定第29頁,共41頁，2024年2月25日，星期天芽孢染色的方法和步驟1.涂片、干燥、固定：待涂片晾干后在酒精燈火焰上通過2—3次。2.染色：①加染色液：加5%孔雀綠水溶液于涂片處（染料以鋪滿涂片為度），然后將涂片放在銅板上（用鑷子夾住載玻片），用酒精燈火焰加熱至染液冒蒸汽時(shí)開始計(jì)算時(shí)間，約維持5-10min。加熱過程中要隨時(shí)添加染色液，切勿讓標(biāo)本干涸。（加熱時(shí)溫度不能太高）。②水洗：待玻片冷卻后，用水輕輕地沖洗，直至流出的水中無染色液為止。第30頁,共41頁，2024年2月25日，星期天③復(fù)染：用蕃紅液染色1-2min。3.水洗、晾干或吸干。4.鏡檢：觀察：芽孢（菌體）顏色、形狀、著生位置、芽孢囊特征等。第31頁,共41頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏染色革蘭氏染色法

是1884年由丹麥病理學(xué)家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)上最常用的鑒別染色法，因?yàn)橥ㄟ^此法染色，可將細(xì)菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。第32頁,共41頁，2024年2月25日，星期天？1234結(jié)晶紫碘液酒精復(fù)紅第33頁,共41頁，2024年2月25日，星期天革蘭氏染色的機(jī)理：

主要由于兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同。第34頁,共41頁，2024年2月25日，星期天第35頁,共41頁，2024年2月25日，星期天制片→初染（結(jié)晶紫1min）→水洗→媒染（碘液