酶細(xì)胞和原生質(zhì)體固定化

酶細(xì)胞和原生質(zhì)體固定化游離酶在應(yīng)用中的不足?穩(wěn)定性差：高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子?難于回收和重復(fù)利用：一次性使用酶?產(chǎn)物的分離純化困難第2頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶（細(xì)胞）的由來(lái)和發(fā)展1916年，Nelson&Griffin

“酶不溶于水而具有活性”1948年，Sumner

尿素酶制成非溶性酶1953年，Grubhofer&Schleith

第一次實(shí)現(xiàn)了酶的固定化1960年，千畑一郎開(kāi)始了氨基酰化酶固定化研究1969年，千畑一郎成功的將固定化氨基酰化酶應(yīng)用于DL-AA的光學(xué)分析上1971年，固定化酶名稱(chēng)提出，Immobilizedenzyme第3頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天1973年，固定化微生物的應(yīng)用1976年，固定化酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒和酒精1978年，日本用固定化細(xì)胞生產(chǎn)酶1979年，固定化植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞開(kāi)始研究1982年，日本首次研究用固定化原生質(zhì)生產(chǎn)氨基酸1986年，郭勇等人固定化原生質(zhì)研究第4頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶?固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)的酶。?用于固定化的酶，通常是經(jīng)提取分離純化后的酶，也可以是含酶菌體或菌體碎片。?優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性增加；可反復(fù)使用；利于連續(xù)操作；易于和反應(yīng)產(chǎn)物分離。固定化細(xì)胞?固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞，也稱(chēng)為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。?為動(dòng)植物來(lái)源的天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)開(kāi)辟了新的途徑。

固定化原生質(zhì)體?為胞內(nèi)酶生產(chǎn)技術(shù)路線(xiàn)的變革提供了新的方法。第5頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天第一節(jié)酶固定化第6頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、酶和菌體固定化的方法

吸附法包埋法結(jié)合法交聯(lián)法熱處理法第7頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.吸附法定義:利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而使酶固定的方法。吸附劑:活性炭、氧化鋁、硅藻土、羥磷灰石等。特點(diǎn):操作簡(jiǎn)單,條件溫和,不會(huì)引起酶活性損失,但結(jié)合力弱,使用受限制。第8頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、包埋法將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中使酶固定化的方法。（1）凝膠包埋法：將酶分子包埋在凝膠內(nèi)部的微孔中。天然凝膠：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等；合成凝膠：聚丙烯酰胺凝膠、光交聯(lián)樹(shù)脂等。注意：不適用于底物和產(chǎn)物分子量大的酶的固定化。（2）半透膜包埋法（微囊化法）：將酶包埋在有各種高分子聚合物制成的小球中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉膠膜等。注意：適用于底物和產(chǎn)物分子量都小的酶固定化。第9頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天定義：酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)和載體表面上的功能基團(tuán)之間形成共價(jià)鍵或離子鍵而固定的方法。（1）離子鍵結(jié)合法定義:通過(guò)離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。常用載體（不溶于水的離子交換劑）：DEAE－纖維素、TEAE－纖維素、DEAE－葡聚糖凝膠。特點(diǎn)：反應(yīng)條件溫和，活力損失少，結(jié)合力弱，pH和離子強(qiáng)度等條件改變易影響固定化效果，因此須嚴(yán)格控制pH、離子強(qiáng)度和溫度等操作條件3.結(jié)合法第10頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）共價(jià)鍵結(jié)合法定義：通過(guò)共價(jià)鍵將酶與載體結(jié)合的固定化方法。特點(diǎn)：穩(wěn)定性好，反應(yīng)條件激烈，操作復(fù)雜，控制條件苛刻，相對(duì)酶活力較低載體：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼素與載體結(jié)合的酶官能團(tuán)：氨基、羥基、巰基、咪唑基、羧基和酚基第11頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天載體的選擇載體直接關(guān)系到固定化酶的性質(zhì)和形成，對(duì)載體要求：①一般親水載體優(yōu)于疏水載體②載體結(jié)構(gòu)疏松，表面積大，有一定的機(jī)械強(qiáng)度③帶有與酶結(jié)合的功能基團(tuán)④沒(méi)有或很少有非專(zhuān)一性基團(tuán)⑤載體來(lái)源容易，便宜，并能反復(fù)使用第12頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天要使載體與酶形成共價(jià)鍵，必須首先使載體活化，即借助于某種方法，在載體上引進(jìn)某一活潑基團(tuán)；然后此活潑基團(tuán)再與酶分子上的某一基團(tuán)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵。載體活化方法：重氮法疊氮法溴化氰法烷基化法第13頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天①重氮法：將含有苯氨基的不溶性載體與亞硝酸反應(yīng)，生成重氮鹽衍生物，使載體引進(jìn)了活潑的重氮基團(tuán)。第14頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天載體活化后，活潑的重氮基團(tuán)可與酶分子中的酚基或咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)，制得固定化酶。第15頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天②疊氮法：含有酰肼基團(tuán)的載體可用亞硝酸活化，生成含疊氮基團(tuán)的疊氮化合物。第16頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天羧甲基纖維素疊氮衍生物中活潑的疊氮基團(tuán)可與酶分子中的氨基形成肽鍵，使酶固定化。第17頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天疊氮基團(tuán)還可以與酶分子中的羥基、巰基等反應(yīng)，制成固定化酶。第18頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天③溴化氰法：合有羥基的載體，如纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，可用溴化氰活化生成亞氨基碳酸衍生物：第19頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天活化載體上的亞氨碳酸基團(tuán)在微堿性的條件下，可與酶分子上的氨基反應(yīng)，制成固定化酶。第20頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天④烷基化法：含羥基的載體可用三氯-均三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活化載體。第21頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天活化載體上的鹵素基團(tuán)可與酶分子上的氨基、巰基、羥基等發(fā)生烷基化反應(yīng)，制備成固定化酶。第22頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天4.交聯(lián)法定義：利用雙功能試劑，在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，將酶固定化。交聯(lián)試劑：戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。戊二醛的兩個(gè)醛基都可與酶的游離氨基反應(yīng)，形成席夫堿，使酶交聯(lián)制成固定化酶。第23頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天特點(diǎn)：結(jié)合牢固，可長(zhǎng)時(shí)間使用；交聯(lián)反應(yīng)條件激烈，酶活力損失大。常將交聯(lián)法與吸附法或包埋法聯(lián)合使用。雙重固定化酶法：將酶先用凝膠包埋后再用戊二醛交聯(lián)，或先將酶用硅膠等吸附后再進(jìn)行交聯(lián)等。第24頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.熱處理法定義：將含酶細(xì)胞在一定溫度下加熱處理一段時(shí)間，使酶固定在菌體內(nèi)，而制備得到固定化菌體。適用范圍：熱處理法只適用于那些熱穩(wěn)定性較好的酶的固定化。注意：在加熱處理時(shí)，要嚴(yán)格控制好加熱溫度和時(shí)間，以免引起酶的變性失活。第25頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天第26頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、固定化酶的性質(zhì)酶活力穩(wěn)定性最適溫度最適PH值底物特異性第27頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天1.活力固定化酶的活力在多數(shù)情況下比天然酶小，其專(zhuān)一性也能發(fā)生改變。例如，用羧甲基纖維素作載體固定的胰蛋白酶，對(duì)高分子底物酪蛋白只顯示原酶活力的30％，而對(duì)低分子底物苯酞精氨酸-對(duì)硝基酰替苯胺的活力保持80％。第28頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶的活力降低的原因①酶分子在固定化過(guò)程中，空間構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化，甚至影響活性中心的氨基酸。②固定化后，酶分子空間自由度受到限制(空間位阻)，會(huì)直接影響到活性中心對(duì)底物的定位作用。③內(nèi)擴(kuò)散阻力使底物分子與活性中心的接近受阻。④包埋時(shí)酶被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物不能透過(guò)膜與酶接近。第29頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.穩(wěn)定性固定化酶的穩(wěn)定性一般比游離酶的穩(wěn)定性好。主要表現(xiàn)在：(1)對(duì)熱的穩(wěn)定性提高，可以耐受較高的溫度。(2)對(duì)pH的穩(wěn)定性提高。(3)保存穩(wěn)定性好，可以在一定條件下保存較長(zhǎng)的時(shí)間。(4)對(duì)蛋白酶的抵抗性增強(qiáng)，不易被蛋白酶水解。(5)對(duì)變性劑的耐受性提高，在尿素、有機(jī)溶劑和鹽酸胍等蛋白質(zhì)變性劑的作用下，仍可保留較高的酶活力。第30頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天第31頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化酶的pH穩(wěn)定性明顯優(yōu)于游離酶青霉素酰化酶在不同pH的緩沖液中，于37℃保溫16h測(cè)定酶活力:固定化酶在pH5.5-10.3活力穩(wěn)定；游離酶則僅在pH7.0-9.0穩(wěn)定——。固定化后酶pH穩(wěn)定性提高的可能原因:?

固定化后酶分子與載體多點(diǎn)連接，可防止酶分子伸展變形?

酶活力的緩慢釋放?

抑制酶的自降解:將菌與固態(tài)載體結(jié)合后，酶由于失去了分子間相互作用的機(jī)會(huì)，從而抑制了降解第32頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天3．最適溫度?

固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。?

有些固定化酶的最適溫度與游離酶比較會(huì)有較明顯的變化。例：用重氮法制備的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，其作用的最適溫度比游離酶高5-10℃?

同一種酶，在采用不同的方法或不同載體進(jìn)行固定化后，其最適溫度也可能不同。第33頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天4．最適pH值酶經(jīng)過(guò)固體化后，其作用的最適pH值往往會(huì)發(fā)生變化,影響固定化酶最適pH值的因素主要有:載體的帶電性質(zhì)酶催化反應(yīng)產(chǎn)物的性質(zhì)第34頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天(1)載體性質(zhì)對(duì)最適pH值的影響：?

用帶負(fù)電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值比游離酶的最適pH值為高(即向堿性一側(cè)移動(dòng))。?

用帶正電荷載體制備的固定化酶，其最適pH值比游離酶的最適pH值為低(即向酸性一側(cè)移動(dòng))。?

用不帶電荷的裁體制備的固定化酶，其最適pH值一般不改變(有時(shí)也會(huì)有所改變，但不是由于載體的帶電性質(zhì)所引起的)。第35頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)產(chǎn)物性質(zhì)對(duì)最適pH值的影響：?

產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶的最適pH值要比游離酶的最適pH值高一些。?

產(chǎn)物為堿性時(shí)，固定化酶的最適PH值要比游離酶的最適pH值低一些。?

產(chǎn)物為中性時(shí)，最適pH值一般不改變。第36頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天5.底物特異性固定化酶的底物特異性與游離酶比較有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關(guān)系。?

對(duì)于那些作用于低分子底物的酶，固定化前后的底物特異性沒(méi)有明顯變化。例:氨基?；浮⑵咸烟茄趸?、葡萄糖異構(gòu)酶?

對(duì)于那些可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶而言，固定化酶的底物特異性往往會(huì)發(fā)生變化第37頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天例：?

胰蛋白酶既可作用于高分子的蛋白質(zhì)，又可作用于低分子的二肽或多肽，固定在按甲基纖維素上的胰蛋白酶，對(duì)二肽或多肽的作用保持不變，而對(duì)酪蛋白的作用僅為游離酶的3％左右；?

以羧甲基纖維素為載體經(jīng)迭氮法制備的核糖核酸酶，當(dāng)以核糖核酸為底物時(shí)，催化速度僅為游離酶的2％左右，而以環(huán)化鳥(niǎo)苷酸為底物時(shí)，催化速度可達(dá)游離酶的50-60％。第38頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、固定化酶的應(yīng)用已用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶有:氨基酰化酶：世界上第一種工業(yè)化的固定化酶葡萄糖異構(gòu)酶：世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的固定化酶天門(mén)冬氨酸酶青霉素?；福横t(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛延胡索酸酶β-半乳糖苷酶天冬氨酸-β-脫羧酶第39頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天(1)利用固定化氨基?；干a(chǎn)L氨基酸?

由化學(xué)合成法得到的氨基酸都是無(wú)光學(xué)活性的DL型外消旋混合物，必須進(jìn)行光學(xué)拆分以獲得L型氨基酸。?

外消旋氨基酸拆分的方法有物理化學(xué)法、酶法等，其中以酶法最有效，能夠產(chǎn)生純度較高的L-氨基酸。第40頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天1969年日本人千畑一郎等通過(guò)離子交換法將氨基酰化酶固定在DEAE-葡聚糖載體上，從而制得了世界上第一個(gè)適用于工業(yè)生產(chǎn)的固定化酶。酶活性高，穩(wěn)定性好，可用于連續(xù)拆分酰化-DL-氨基酸。?

產(chǎn)物的純化較簡(jiǎn)單?

收率高?

成本低：固定化氨基?；阜浅７€(wěn)定，酶的費(fèi)用減少。固定化氨基?；该钢纳a(chǎn)工藝還可以自動(dòng)控制，減少了勞動(dòng)力費(fèi)用。第41頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天(2)利用固定化酶合成氨基酸即利用化學(xué)法合成分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的前體，再通過(guò)酶反應(yīng)合成所需要的氨基酸。此法能夠價(jià)廉、高收率地生產(chǎn)發(fā)酵法或化學(xué)合成法尚難解決的一些氨基酸。例：酶法合成L-天冬氨酸是以化學(xué)法容易合成的氨與富馬酸為原料，用大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)酶天冬氨酸酶(系一種裂解酶)進(jìn)行反應(yīng)定量地合成天冬氨酸。第42頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天?

以聚丙烯酰胺凝膠為載體,將具有高活力天冬氨酸酶的大腸桿菌菌體包埋制成固定化天冬氨酸酶，用于工業(yè)化生產(chǎn),將延胡索酸轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天冬氨酸。?

或改用角叉菜膠為載體制備固定化酶，也可將天冬氨酸酶從大腸桿菌細(xì)胞中提取分離出來(lái)，在用離子鍵結(jié)合法制成固定化酶，用于工業(yè)化生產(chǎn)。第43頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、固定化酶的優(yōu)缺點(diǎn)①極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開(kāi)；②可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；③在大多數(shù)情況下，能夠提高酶的穩(wěn)定性；④酶反應(yīng)過(guò)程能夠加以嚴(yán)格控制；⑤產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留，簡(jiǎn)化了提純工藝；⑥較游離酶更適合于多酶反應(yīng)；⑦可以增加產(chǎn)物的效率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；⑧酶的使用效率提高，成本降低。優(yōu)點(diǎn)第44頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天缺點(diǎn)：①固定化時(shí)，酶活力有損失；②增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大；③只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜；④與完整菌體相比不適宜于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)；⑤胞內(nèi)酶必須經(jīng)過(guò)酶的分離手續(xù)。第45頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天第二節(jié)細(xì)胞固定化第46頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天?

細(xì)胞固定化：通過(guò)各種方法將細(xì)胞與水不溶性的載體結(jié)合，制備固定化細(xì)胞的過(guò)程。?

固定化細(xì)胞：固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞。固定化細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長(zhǎng)、繁殖和新陳代謝，所以又稱(chēng)為固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。?

微生物細(xì)胞、植物細(xì)飽和動(dòng)物細(xì)胞都可以制成固定化細(xì)胞。目前，隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，其實(shí)際應(yīng)用甚至超過(guò)了固定化酶。第47頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定化細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)①固定化細(xì)胞的密度大、可增殖，因而可獲得高度密集而體積縮小的工程菌集合體，不需要微生物菌體的多次培養(yǎng)、擴(kuò)大，從而縮短了發(fā)酵生產(chǎn)周期，可提高生產(chǎn)能力；②發(fā)酵穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間反復(fù)使用或連續(xù)使用，有希望將發(fā)酵罐改變?yōu)榉磻?yīng)柱進(jìn)行連續(xù)生產(chǎn)；③發(fā)酵液中含菌體較少，有利于產(chǎn)品分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量等。第48頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天①利用的僅是胞內(nèi)酶，而細(xì)胞內(nèi)多種酶的存在，會(huì)形成不需要的副產(chǎn)物；②細(xì)胞膜、細(xì)胞壁和載體都存在著擴(kuò)散限制作用；③載體形成的孔隙大小影響高分子底物的通透性。固定化細(xì)胞缺點(diǎn)第49頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天一、細(xì)胞固定化的方法分類(lèi)：吸附法和包埋法1.吸附法：是制備固定化動(dòng)物細(xì)胞的主要方法?

載體：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、微載體等；?

特點(diǎn)：吸附力較弱，吸附不牢固，細(xì)胞容易脫落，使用受到一定的限制。第50頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天第51頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.包埋法定義：將細(xì)胞包埋在多孔載體內(nèi)部而制成固定化細(xì)胞的方法。分類(lèi)凝膠包埋法半透膜包埋法第52頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天（1）凝膠包埋法凝膠包埋劑：聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂、海藻酸鈣凝膠、明膠、光交聯(lián)樹(shù)脂主要凝膠包埋法?

瓊脂凝膠包埋法?

海藻酸鈣凝膠包埋法?

角叉菜膠包埋法?

明膠包埋法?

聚丙烯酰胺凝膠包埋法?

光交聯(lián)樹(shù)脂包埋法第53頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天①瓊脂凝膠包埋法：將一定量的瓊脂加到一定體積的水中，加熱使之溶解，然后冷卻至48-55℃，加入一定量的細(xì)胞懸浮液，迅速攪拌均勻后，趁熱分散在預(yù)冷的甲苯或四氯乙烯溶液中，形成球狀固定化細(xì)胞膠粒。特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度差,且氧氣、底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散比較困難，故使用受限制。第54頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天②海藻酸鈣凝膠包埋法：稱(chēng)取一定量的海藻酸鈉，溶于水，配制成一定濃度的海藻酸鈉溶液，經(jīng)殺菌冷卻后，與一定體積的細(xì)胞或孢子懸浮液混合均勻，然后用注射器將混懸液滴到一定濃度的氯化鈣溶液中，形成球狀固定化細(xì)胞膠粒。特點(diǎn)：對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，可以通過(guò)改變海藻酸鈉的濃度改變凝膠孔徑，適用于多種細(xì)胞的固定化；但磷酸鹽會(huì)破壞凝膠結(jié)構(gòu)，故使用時(shí)需控制培養(yǎng)基中磷酸鹽的濃度并保持一定濃度的鈣離子，維持凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。第55頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天③角叉菜膠包埋法：將一定量的角叉菜膠懸浮于一定體積的水中，加熱溶解、滅菌后，冷卻至35-50℃，與一定量的細(xì)胞懸浮液混勻，趁熱滴到預(yù)冷的氯化鉀溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成型后再置于氯化鉀溶液中,制成小球狀固定化細(xì)胞膠粒。特點(diǎn)：具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，若使用濃度低強(qiáng)度不夠，可用戊二醛等交聯(lián)劑做交聯(lián)處理，進(jìn)行雙重固定化。此包埋法操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，通透性能較好。第56頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天④明膠包埋法：配制一定濃度的明膠懸浮液，加熱溶化、滅菌后，冷卻至35℃以上，與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，冷卻凝聚后做成所需形狀的固定化細(xì)胞。特點(diǎn)：若機(jī)械強(qiáng)度不夠時(shí)，可用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)強(qiáng)化。第57頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑤聚丙烯酰胺凝膠包埋法：先配制一定濃度的丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的溶液，與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，然后加入一定量的過(guò)硫酸鈣和四甲基乙二胺，混合后讓其靜置聚合，獲得所需形狀的固定化細(xì)胞膠粒。特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度高，可通過(guò)改變丙烯酰胺的濃度調(diào)節(jié)凝膠孔徑，適用于多種細(xì)胞和酶的固定化，但丙烯酰胺單體對(duì)細(xì)胞有毒害作用，故應(yīng)縮短聚合時(shí)間，減少細(xì)胞與丙烯酰胺單體的接觸時(shí)間。第58頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天⑥光交聯(lián)樹(shù)脂包埋法：選用一定相對(duì)分子量的光交聯(lián)樹(shù)脂預(yù)聚物，加入1%左右的光敏劑，加水配成一定濃度，加熱至50℃左右使之溶解，然后與一定濃度的細(xì)胞懸浮液混合均勻，攤成一定厚度的薄層，用紫外光照射3min左右，即可交聯(lián)固定化制成固定化細(xì)胞，然后在無(wú)菌條件下，切成一定形狀。特點(diǎn)：通過(guò)選擇不同分子量的預(yù)聚物可使聚合而成的樹(shù)脂孔徑得以改變，適合于多種不同直徑的酶分子和細(xì)胞的固定化；光交聚樹(shù)脂的強(qiáng)度高，可連續(xù)使用較長(zhǎng)的時(shí)間；用紫外光照射幾分鐘就可完成固定化。第59頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天二、固定化微生物細(xì)胞的應(yīng)用

應(yīng)用固定化微生物細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)各種胞外產(chǎn)物

利用固定化微生物細(xì)胞與各種電極結(jié)合制成微生物電極第60頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天三、固定化植物細(xì)胞固定化植物細(xì)胞特點(diǎn):?

固定化后由于有載體的保護(hù)作用，可減輕剪切力和其他因素的影響，提高其存活率和穩(wěn)定性；?

細(xì)胞經(jīng)固定化后，被束縛在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)，不容易聚集成團(tuán)；?

固定化植物細(xì)胞發(fā)酵可以簡(jiǎn)便地在不同的培養(yǎng)階段更換不同的培養(yǎng)液；?

可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)的一段時(shí)間，大大縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率；?

易于與培養(yǎng)液分離，利于產(chǎn)品的分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量。第61頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天植物細(xì)胞固定化的方法?

吸附法:將植物細(xì)胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內(nèi)，或者將植物細(xì)胞吸附在中空纖維的外壁上。?

包埋法:包埋法是將植物細(xì)胞包埋在瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、明膠等多孔凝膠之中,包埋方法與微生物細(xì)胞包埋方法基本相同。第62頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天四、動(dòng)物細(xì)胞固定化1.固定化動(dòng)物細(xì)胞特點(diǎn)?

提高細(xì)胞存活率?

提高產(chǎn)率?

可反復(fù)使用或連續(xù)使用較長(zhǎng)的時(shí)間，利于連續(xù)化自動(dòng)化生產(chǎn)?

易于與產(chǎn)物分開(kāi)，利于產(chǎn)物分離純化，提高產(chǎn)品質(zhì)量第63頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天2.動(dòng)物細(xì)胞固定化的方法（1）吸附法：大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于附著細(xì)胞，它們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中，必須趨向于附著在固體表面，故此法特別適合于動(dòng)物細(xì)胞的固定化。常用的吸附固定化載體有轉(zhuǎn)瓶、微載體和中空纖維等。第64頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天①轉(zhuǎn)瓶法轉(zhuǎn)瓶由玻璃或塑料制成，表面經(jīng)過(guò)一定方法處理而帶上電荷(如用高錳酸鉀等氧化劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或紫外光照射等進(jìn)行表面處理)，可使動(dòng)物細(xì)胞容易附著在其表面生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)，轉(zhuǎn)瓶以一定的速度轉(zhuǎn)動(dòng)。特點(diǎn)：轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的設(shè)備簡(jiǎn)單，操作容易，但比表面積較小，細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖受到限制?？稍谵D(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)加列管或多層平板組成列管式轉(zhuǎn)瓶或多層平板式轉(zhuǎn)瓶即可使其比表面積增加，從而提高生產(chǎn)能力。第65頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天②微載體法微載體：指顆粒細(xì)小的固定化載體，直徑一般為l00一200um，相對(duì)密度接近1.0，由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成。特點(diǎn)：?

可用于多種動(dòng)物細(xì)胞的固定化；用于生產(chǎn)β-干擾素、人組織纖溶酶原活化劑、白細(xì)胞介素以及各種疫苗等。?

具有很大的表面積，比轉(zhuǎn)瓶的比表面積大幾百倍，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和物質(zhì)傳遞非常有利。但是固定化細(xì)胞的強(qiáng)度不夠，容易破碎，使用時(shí)間較短。第66頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天③中空纖維法中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成，纖維管壁是半透膜。使用時(shí)，將動(dòng)物細(xì)胞置于纖維管外壁和外殼容器的內(nèi)壁之間，細(xì)胞附著在中空纖維外壁，培養(yǎng)液在中空纖維管內(nèi)流動(dòng)，各種營(yíng)養(yǎng)成分、溶解氧和代謝產(chǎn)物透過(guò)中空纖維膜進(jìn)行傳遞。特點(diǎn)：?

這種固定化細(xì)胞與動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞的存活方式類(lèi)似，中空纖維起著相當(dāng)于體內(nèi)微血管的作用，對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和新陳代謝非常適宜。?

中空纖維成本較高，有時(shí)會(huì)發(fā)生纖維管堵塞現(xiàn)象，大規(guī)模生產(chǎn)的難度較大。中空纖維固定化適用于動(dòng)物附著細(xì)胞，也適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。第67頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天（2）包埋法：一般適用于懸浮細(xì)胞，根據(jù)載體和方法的不同，有凝膠包埋法和半透膜包埋法。①

凝膠包埋法：利用各種多孔凝膠為載體將動(dòng)物細(xì)胞固定化，細(xì)胞被固定在凝膠的微孔中生長(zhǎng)繁殖和新陳代謝，由于有載體的保護(hù)，動(dòng)物細(xì)胞有較好的穩(wěn)定性，可顯著提高其存活率。用于動(dòng)物細(xì)胞固定化的凝膠載體主要有：瓊脂糖凝膠海藻酸鈣凝膠血纖維蛋白第68頁(yè),共76頁(yè)，2024年2月25日，星期天②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜將動(dòng)物細(xì)胞包埋，形成微囊型固定化動(dòng)物細(xì)胞。?

半透膜的孔徑可以根據(jù)需要加以控制和改變。?

制備過(guò)程一般采用海藻酸鈣-聚賴(lài)氨酸包埋技術(shù)：動(dòng)物細(xì)胞先用海藻酸鈣凝膠包埋，制成直徑1-2mm的膠粒，再用聚賴(lài)氫酸處理；使膠粒外層包上一層聚賴(lài)氨酸薄膜，然后將它泡在檸檬酸鈉溶液中，使海藻酸鈣凝膠溶解，便獲得由聚賴(lài)氨酸膜包埋的近乎透明的微囊型固定化動(dòng)物細(xì)胞。第69頁(yè)