多肽合成與生物活性肽省公開(kāi)課一等獎(jiǎng)全國(guó)示范課微課金獎(jiǎng)?wù)n件

多肽合成與生物活性肽1/68一、多肽與多肽合成2/68氨基酸甘氨酸（Gly、G）、丙氨酸（Ala、A）、苯丙氨酸（Phe、F）、谷氨酰胺（Gln、Q）、天冬酰胺（Asn、N）、纈氨酸（Val、V）、亮氨酸（Leu、L）、異亮氨酸（Ile、I）、脯氨酸（Pro、P）、甲硫氨酸（Met、M）、半胱氨酸（Cys、C，巰基）、絲氨酸（Ser、S，羥基）、蘇氨酸（Thr、T，羥基）酪氨酸（Tyr、Y，酚羥基）、色氨酸（Trp、W，吲哚基）、谷氨酸（Glu、E，羧基）、天冬氨酸（Asp、D、羧基）、賴氨酸（Lys、K，氨基）、精氨酸（Arg、R，氨基）、組氨酸（His、H，胺基）3/68多肽（蛋白質(zhì)）

氨基酸“首－尾”以酰胺鍵相連，相連氨基酸數(shù)較少時(shí)稱多肽，較多時(shí)稱蛋白質(zhì)。多肽、蛋白質(zhì)4/68人工合成胰島素

1965年，我國(guó)上海生化所、上海有機(jī)所和北京大學(xué)科學(xué)家經(jīng)過(guò)6年多努力，在世界上首次人工合成含有生命活力蛋白質(zhì)－牛胰島素。（1953年合成八肽－催產(chǎn)素，取得了1955年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。）

胰島素由A、B兩個(gè)肽鏈組成，A鏈有21個(gè)氨基酸，B鏈有個(gè)30個(gè)氨基酸，A鏈和B鏈間由三個(gè)二硫鍵連接起來(lái)。5/68

上面氨基酸縮合脫水形成肽反應(yīng)式在生物體內(nèi)多肽、蛋白質(zhì)合成是成立，但在人工合成多肽時(shí)，這一反應(yīng)式是不能實(shí)現(xiàn)。6/68液相法合成多肽

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固相多肽合成方法

Merrifield在1962年開(kāi)創(chuàng)了固相多肽合成法，并于1984年取得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。固相多肽合成法原理：用交聯(lián)聚合物樹(shù)脂作為載體，肽合成在交聯(lián)聚合物樹(shù)脂內(nèi)進(jìn)行（共價(jià)固載于載體上）。交聯(lián)聚合物樹(shù)脂在任何溶劑中都不能溶解，但在一些溶劑中可溶脹，這么反應(yīng)物、催化劑等可擴(kuò)散到樹(shù)脂內(nèi)部參加反應(yīng)。每一步反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)濾、洗滌，即可將剩下反應(yīng)物、催化劑、副產(chǎn)物等去掉，然后進(jìn)行下一步反應(yīng)。最終將合成肽從樹(shù)脂上裂解下來(lái)。8/68聚合9/68功效基基化10/6811/68固相合成12/68固相合成優(yōu)點(diǎn)能夠用過(guò)量反應(yīng)試劑使反應(yīng)完全。每步產(chǎn)物都固定于不溶于任何溶劑固相載體上，所以所需產(chǎn)物與其它過(guò)量試劑、催化劑等小分子試劑分離可經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單過(guò)濾而實(shí)現(xiàn)。在裂解前全部操作步驟中，固相載體一直處于同一容器中，沒(méi)有任何機(jī)械損失。能夠用大過(guò)量反應(yīng)試劑及催化劑，使每一步反應(yīng)趨于完全，提升產(chǎn)率，使最終產(chǎn)物純化愈加輕易。沒(méi)有液相法中碰到當(dāng)肽鏈較長(zhǎng)時(shí)不易找到適當(dāng)溶劑問(wèn)題。輕易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化?，F(xiàn)已經(jīng)有自動(dòng)化程度很高自動(dòng)多肽合成儀。13/68二、生物活性肽14/68

生物活性肽在生命活動(dòng)中起著非常主要作用，如胰島素、生長(zhǎng)激素、促腎上腺皮質(zhì)激素、催產(chǎn)素等。許多天然活性肽或天然活性肽類(lèi)似物也是非常主要藥品，多肽作為藥品含有以下優(yōu)點(diǎn)。高效、專(zhuān)一，用量少

如鮭魚(yú)降鈣素劑量為20g/支（50000支/g)結(jié)構(gòu)多變，伴隨各種生物技術(shù)和計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)發(fā)展，可得到含有各種功效多肽藥品

如在計(jì)算機(jī)模擬基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)合成了治療艾滋病多肽藥品T-20。FDA已同意200各種多肽和蛋白質(zhì)藥品臨床應(yīng)用。代謝產(chǎn)物為無(wú)毒氨基酸15/68抗菌素耐藥性

抗菌素使用挽救了無(wú)數(shù)生命，使人預(yù)期壽命增加了十年以上。但伴隨抗菌素使用，細(xì)菌也逐步對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性。一個(gè)新藥研制平均周期是約10年，而一個(gè)新抗菌素臨床使用后細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生耐藥性平均時(shí)間為約2年。

一些超級(jí)細(xì)菌對(duì)當(dāng)前使用全部抗菌素包含被稱為抗菌最終防線萬(wàn)古霉素含有耐藥性。細(xì)菌感染住院患者中約7%因?yàn)槟退幖?xì)菌感染而死亡。

陽(yáng)離子抗菌肽16/68抗菌素種類(lèi)

-內(nèi)酰胺類(lèi)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)喹諾酮四環(huán)素類(lèi)氨基糖苷類(lèi)磺胺類(lèi)17/68耐藥機(jī)理1.細(xì)菌變異細(xì)胞壁上抗菌素結(jié)合部位，使抗菌素失去與細(xì)胞壁結(jié)合能力。

如萬(wàn)古霉素與細(xì)菌細(xì)胞壁粘肽末端-D-Ala-D-Ala結(jié)合，從而抑制細(xì)菌一些生理功效，起到抑菌作用。

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抗萬(wàn)古霉素細(xì)菌則把-D-Ala-D-Ala變異成-D-Ala-D-Lac，使萬(wàn)古霉素對(duì)其失去結(jié)協(xié)力而不起作用19/682.經(jīng)過(guò)分泌

-內(nèi)酰胺酶而破壞化學(xué)上很不穩(wěn)定

-內(nèi)酰胺類(lèi)抗菌素

-內(nèi)酰胺環(huán)。3.分泌某種酶修飾抗菌素上一些基團(tuán)如乙?；u基等。20/68陽(yáng)離子抗菌肽1981年Boman等人從西哥羅佩蛾（MothHyalophoracecropia）體中分離得到抗菌多肽天蠶素（cecropin）（Nature，1981，292，246）?？咕膹V泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，用來(lái)對(duì)付細(xì)菌、病毒和真菌等，已發(fā)覺(jué)抗菌肽已超出1000種?？咕闹卸己休^多堿性氨基酸，在生理?xiàng)l件下帶凈正電荷，所以也叫陽(yáng)離子抗菌肽。21/68

抗菌肽陽(yáng)離子部分與細(xì)菌細(xì)胞膜（陰離子性磷脂膜）磷酸基負(fù)離子結(jié)合（靜電作用），多肽疏水部分與細(xì)胞膜碳?xì)滏溄Y(jié)合（疏水作用），從而起到抑菌作用。

抗菌機(jī)理22/68抗菌肽不易產(chǎn)生耐藥性原因

因?yàn)殛?yáng)離子多肽與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合特異性不高，細(xì)菌不易經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單變異或修飾多肽產(chǎn)生耐藥性。

抗菌肽副作用

大部分抗菌肽除含有抗菌活性外，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞也有毒性，如溶血活性。

抗菌肽抗菌活性和溶血活性都由多肽兩親性引發(fā)，但一些抗菌肽含有溶血活性，而另一些抗菌肽沒(méi)有溶血活性現(xiàn)象不能到達(dá)滿意解釋。23/6824/6825/68*BC,bloodcell;H,haemolymph;E,epithelialtissue.M.Zasloff,Nature,,415,389-39526/68TableCommercialdevelopmentofantimicrobialpeptidesofanimaloriginModeofusePeptideCompanyApplicationStageToticalMSI-78GenaeralInfecteddiabeticCompletedPhaseIII;notfootulcersapprovedbyFDA,pend-ingadditionalstudiesToticalMBI-226MicrologixCatheterinfectionPhaseIIIToticalMBI-594MicrologixAcnePhaseIIOralIB-367IntrobioticsMucostisPhaseIIIOralP-113DemegenGingivitisPhaseIISystemicHeliomycinEntomedAntifungalPreclinicalSystemicHumanAMPharmAntibacterialPreclinicallavotoferricinSystemicBPIXomaMeningococcalPhaseIIImeningitisM.Zasloff,Nature,,415,389-39527/68當(dāng)前研究熱點(diǎn)抗菌機(jī)理、溶血機(jī)理提升抗菌活性，抗菌活性不夠高，因而用量較大減小鏈長(zhǎng)，肽鏈較長(zhǎng)時(shí)合成成本高，且免疫源性高較少溶血副作用

28/68GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH2Melittin氨基酸序列蜂毒肽(melittin)類(lèi)似物

我們研究發(fā)覺(jué)，蜂毒肽12－26殘基片斷基本保留抗菌活性，但溶血活性基本消失。

蜂毒肽由26個(gè)氨基酸組成，含有很強(qiáng)抗菌活性，同時(shí)還含有很強(qiáng)溶血副作用。29/68Melittin短缺肽及其類(lèi)似物抗菌和溶血活性

PeptideHD50ag.HRBC（

g/ml）MICag.SA（

g/ml）Melittin56.25M(13-26)

1000012.5M(12-26)

1000012.5M(11-26)

100006.25M(11-26,G12W192L)11006.25M(11-26,G12A15W193L)2903.130/68以M(12-26)為模板，逐一改變1-9位疏水性

GLPALISWIKRKRQQ-NH2結(jié)果：右側(cè)氨基酸疏水性增加，則其抗菌活性顯著增加；左側(cè)氨基酸疏水性增加，則其抗菌活性略有增加。右側(cè)氨基酸疏水性增加，則其溶血活性減??；左側(cè)氨基酸疏水性增加，則其溶血活性增加。31/68三、聚合物修飾多肽、蛋白質(zhì)藥品32/68多肽、蛋白質(zhì)藥品缺點(diǎn)口服生物利用率低

消化系統(tǒng)各種蛋白水解酶降解作用保留壽命短血液半衰期短

血液及各器官中蛋白水解酶降解作用、腎過(guò)濾清楚作用含有免疫原性不易穿透生物膜33/68聚乙二醇，poly(ethyleneglycol)(PEG)，poly(ethyleneoxide)(PEO)：特征：兩親性，既親水又親油，可溶于水和許多有機(jī)溶劑如鹵代烴，鏈高度柔順。無(wú)毒，可靜脈注射、口服和外用高生物相容性，是已知聚合物中對(duì)蛋白質(zhì)吸附作用最小聚合物。表面用PEG修飾可減小對(duì)蛋白質(zhì)吸附，進(jìn)而降低被RES俘獲和免疫反應(yīng)。34/68多肽、蛋白質(zhì)藥品用PEG修飾MainadvantagesofPEGylatedprotein.35/68PEGconjugateTypeofPEGylationsYeartomarketDiseasePEG–asparaginase(Oncaspar?)Random,linearPEG1994AcutelymphoblasticleukemiaPEG–adenosinedeaminase(Adagen?)Random,linearPEG1990Severecombinedimmunodeficiencydisease(SCID)PEG–interferonα2a(Pegasys?)Random,branchedPEG40kDaHepatitisCPEG–interferonα2b(PEG–Intron?)Random,linearPEG12kDaHepatitisCandclinicaltrialsforcancer,multiplesclerosis,HIV/AIDSApprovedPEGconjugates36/68PEGconjugateTypeofPEGylationsYeartomarketDiseasePEG–G-CSF(pegfilgrastim,Neulasta?)Selective,linearPEG20kDaTreatingofneutropeniaduringchemotherapyPEG–growthhormonereceptorantagonist(Pegvisomant,Somavert?)Random,linearPEG5kDa(geneticmodifiedprotein)AcromegalyApprovedPEGconjugates(continued)37/68PEG修飾多肽、蛋白質(zhì)藥品作用柔順PEG鏈及其結(jié)合水分子對(duì)多肽、蛋白質(zhì)起到保護(hù)作用，減小蛋白酶對(duì)其降解作用。PEG修飾使其分子量增大，減小腎過(guò)濾去除作用。PEG保護(hù)作用減小其免疫原性。PEG化后在更寬pH和溫度范圍內(nèi)更穩(wěn)定。使多肽、蛋白質(zhì)藥品含有更高療效顯著延長(zhǎng)其血液半衰期副作用小保留時(shí)間長(zhǎng)38/68PEG分子量、支化對(duì)修飾多肽、蛋白質(zhì)藥品影響PEG分子量愈大，則對(duì)多肽、蛋白質(zhì)保護(hù)作用愈大，血液半衰期愈長(zhǎng)，免疫原性愈小。支化PEG對(duì)多肽、蛋白質(zhì)保護(hù)作用比直鏈PEG大。PEG化往往使多肽、蛋白質(zhì)體外生物活性降低。PEG分子量愈大，體外生物活性降低降低得愈多。

PEG分子量大小對(duì)多肽、蛋白質(zhì)保護(hù)作用影響和對(duì)其體外生物活性影響是相互矛盾。39/68Interferon

-2aPEG化ReactionmechanismofthesynthesisofPEG2-IFN.P.Bailon,etal.,BioconjugateChem.,,12,195-202

40/68InVitroAntiviralActivitiesofInterferon

-2aandPEG2-IFNInterferon

-2aPEG化后其血清半衰期增加了70倍。41/68Invivoantitumoractivityofinterferon

-2a(toppanel)andPEG2-IFN(bottompanel)42/68Growthhormone-releasingfactor(GRF)PEG化假如多肽中含有多個(gè)氨基，PEG化往往得到混合物。P.Espositoa,etal.,Adv.DrugDeliveryRev.,55,1279–1291PrimaryaminoacidsequenceofGRF43/68InvitrobiologicalactivityofthetwoisomerscompositionGRF–1PEG5000andofthetwosinglemono-PEGylatedisomers44/68Biologicalstabilityinhumanpooledplasma45/6846/68抗菌肽PEG化Nisin用5000kDaPEG修飾后抗菌活性完全喪失。A.Guiotto,etal.,IlFarmaco,58,45-5047/68tachyplesin用5000kDaPEG修飾Y.Imura,etal.,Biochim.Biophys.Acta,1768,1160–116948/68PEG分子量、支化對(duì)修飾多肽、蛋白質(zhì)藥品影響PEG分子量愈大，則對(duì)多肽、蛋白質(zhì)保護(hù)作用愈大，血液半衰期愈長(zhǎng)，免疫原性愈小。支化PEG對(duì)多肽、蛋白質(zhì)保護(hù)作用比直鏈PEG大。PEG化往往使多肽、蛋白質(zhì)體外生物活性降低。PEG分子量愈大，體外生物活性降低降低得愈多。

PEG分子量大小對(duì)多肽、蛋白質(zhì)保護(hù)作用影響和對(duì)其體外生物活性影響是相互矛盾。49/68PEG修飾降低生物活性原因直接修飾在活性部位。PEG位阻作用。從熱力學(xué)原理分析，多肽PEG化后其平動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)熵增加是使其活性降低普適原因

。50/68用大分子量PEG修飾多肽（文件中采?。ù志€代表多肽，細(xì)線代表PEG）

用小分子量PEG修飾強(qiáng)疏水性多肽聚集和與受體作用51/68Self-assemblyofPEGylatedpeptidesandshieldingeffectbyPEGshell

52/68多肽固相合成及其PEG化MAGLLALILWIKRKR-NH2

mPEG750-MAmPEG750-GLLALILWIKRKR-NH2mPEG1100-MAmPEG1100-GLLALILWIKRKR-NH253/68TEMimagesofmPEG750-MA(a)andmPEG1100-MA(b)aggregates

54/68DegradationprofilesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MAincubatedwithchymotrypsin(3.64

g/mL)atpH4.5and37C

55/68DegradationprofilesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MAincubatedwith20%bovinecalfserumat37

C

56/68AntimicrobialactivitiesofMA,mPEG750-MAandmPEG1100-MA

57/68藥品靶向釋放58/68藥品控制釋放緩釋

在一定