高效液相色譜法改動(dòng)

高效液相色譜法改動(dòng)§20.1

概述§20.2

高效液相色譜法的分類與基本原理

20.2.1

高效液相色譜法的分類

20.2.2

基本原理§20.3

各類高效液相色譜法

20.3.1液－固吸附色譜法

20.3.2液－液分配色譜法

20.3.3化學(xué)鍵合相色譜法

20.3.4其他色譜法第2頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天§20.4固定相

20.4.1液－固色譜固定相

20.4.2化學(xué)鍵合相

20.4.3其他固定相§20.5流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)）

20.5.1分離方程式

20.5.2Snyder溶劑分類

20.5.3正相洗脫與反相洗脫

20.5.4洗脫方式第3頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

20.5.5流動(dòng)相最優(yōu)化方法簡(jiǎn)介§20.6高效液相色譜儀

20.6.1輸液泵

20.6.2

色譜柱與進(jìn)樣器

20.6.3

檢測(cè)器

20.6.4

超高效液相色譜儀§20.7

定性、定量分析方法

20.7.1

定性分析方法

20.7.2

定量分析方法第4頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法概述第5頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

高效液相色譜法

HPLC

（highperformanceliquidchromatograph）高壓輸液泵高效固定相高靈敏度檢測(cè)器第6頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法與經(jīng)典液相色譜法的比較見表第7頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第8頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第9頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜法與GC的比較見表第10頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第11頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第12頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

高效液相色譜法的分類與基本原理第13頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.2.1高效液相色譜法的分類按固定相的聚集狀態(tài)：LLC和LSC按分離機(jī)制：分配、吸附、離子交換（IEC）、空間排阻（SEC）、親合（AC）、手性（CC）、膠束（MC）、電色譜法（EC）。第14頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLCLSCLLCNLLC和RLLCBPC（狹）RBPCNBPCISC一般RBPCPICIEC一般IECICAA（氨基酸分析法）SECGPC和GFCAC（親和）MC（膠束）CC（手性）第15頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.2.2高效液相色譜法的基本原理HPLC的范氏方程：第16頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天討論：

渦流擴(kuò)散項(xiàng)：填料和填充均勻程度高效液相色譜柱的裝填第17頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天縱向擴(kuò)散項(xiàng)第18頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天傳質(zhì)阻力項(xiàng)第19頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天溫度一般為室溫

選甲醇、乙腈粘度小的溶劑粒徑第20頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天綜上所述，HPLC應(yīng)采用：1)采用小粒徑、窄粒度分布的球形固定相，首選化學(xué)鍵合相，用均漿法裝柱；2）采用低粘度流動(dòng)相，低流速（1ml/min)；3）柱溫一般以25～35度為宜。太低，則流動(dòng)相的粘度增加，溫度高易產(chǎn)生氣泡。第21頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天流速分析型HPLC一般流量為1mL/min。第22頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天各類高效液相色譜法第23頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.3.1液－固吸附色譜法分離機(jī)理

溶質(zhì)分子與流動(dòng)相分子競(jìng)爭(zhēng)吸附吸附劑表面吸附活性中心，靠溶質(zhì)分子的分配系數(shù)（容量因子）不同而分離。影響容量因子的因素

溶質(zhì)分子的極性溶劑的極性硅膠的活性第24頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天若以硅膠為固定相：洗脫劑：以烷烴為底劑，加適量極性調(diào)整劑組成的二元或三元流動(dòng)相。流動(dòng)相應(yīng)該不含水。第25頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.3.2液－液分配色譜法分離機(jī)理靠樣品組分溶入固定相與流動(dòng)相達(dá)到“平衡”后分配系數(shù)的差別而分離。正、反相液－液色譜法

注意流出順序。目前，物理涂漬的液－液色譜幾乎已被化學(xué)鍵合相所取代。第26頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.3.3化學(xué)鍵合相色譜法

將固定液的官能團(tuán)鍵合在載體表面，就構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法，簡(jiǎn)稱鍵合相色譜法（bondedphasechromatograph，BPC）第27頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天化學(xué)鍵合相的優(yōu)點(diǎn)均一、穩(wěn)定；不易流失，使用周期長(zhǎng)；柱效高；重現(xiàn)性好。第28頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天反相鍵合相色譜法（RBPC或RHPLC）固定相：在載體表面鍵合含弱極性或中等極性的基團(tuán)，如十八烷基硅烷（C18）（ODS柱）、辛烷基（C8）、甲基（－CH3）、苯基等。第29頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相：以水做主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如甲醇、乙腈、四氫呋喃等。出峰順序：

極性強(qiáng)的組分先出柱，極性弱的組分后出柱。分析對(duì)象：

分離非極性至中等極性的各種分子型化合物。第30頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天影響保留時(shí)間的因素：

溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)：極性越弱，保留時(shí)間越長(zhǎng)。

流動(dòng)相的表面張力、介電常數(shù)和pH值：對(duì)于二元或多元體系改變?nèi)軇┑呐浔瓤筛淖兞鲃?dòng)相的表面張力和介電常數(shù)。通常，流動(dòng)相中有機(jī)溶劑含量增加，k變小。例如：在水－甲醇體系中增加甲醇的量，可降低表面力和介電常數(shù)，使容量因子變小。第31頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天正相鍵合相色譜法

固定相：在載體表面鍵合含中等極性或較強(qiáng)極性的基團(tuán)，如氰基（－CN）、氨基（—NH3）、或二羥基等。

流動(dòng)相：以非極性或弱極性的溶劑如己烷、庚烷等為主體，加適量的極性調(diào)節(jié)劑增加選擇性如乙醚、氯仿、二氯甲烷等。第32頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天出峰順序：

極性弱的組分先出柱，極性強(qiáng)的組分后出柱。影響保留時(shí)間的因素：鍵合相的種類、流動(dòng)相的強(qiáng)度、試樣的性質(zhì)。流動(dòng)相的極性增強(qiáng)，洗脫能力增加，保留時(shí)間縮短。第33頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天適應(yīng)范圍：

分離溶于有機(jī)溶劑的極性至中等極性的分子型化合物。第34頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天反相離子對(duì)色譜法（RPIC）第35頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天寫成通式：第36頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天表：反相離子對(duì)色譜的離子對(duì)試劑序號(hào)反離子種類主要應(yīng)用對(duì)象1季銨鹽（如四丁基銨磷酸鹽TBA、溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）強(qiáng)酸、弱酸、磺酸染料、羧酸、氫化可的松及其鹽2叔銨（如三辛銨）磺酸鹽、羧酸等3烷基磺酸鹽（如甲基、戊基、己基、庚基、樟腦磺酸鹽）強(qiáng)堿、弱堿、兒茶酚胺、鴉片堿等4高氯酸胺5烷基磺酸鹽（如十二烷基磺酸鹽、正庚烷基磺酸鈉（PICB7)與3類似，選擇性不同第37頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子對(duì)色譜法的適用對(duì)象：

用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換色譜法無(wú)法分離的離子型和非離子型化合物的混合物的分離。第38頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天離子抑制色譜法（ionsuppressionchromatograph，ISC）在反相色譜法中，通過(guò)向流動(dòng)相加入少量弱酸（常用乙酸）、弱堿（常用氨水）或緩沖鹽（常用磷酸鹽及乙酸鹽）來(lái)調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH，抑制樣品組分的離解，增加它在固定相中的溶解度，以達(dá)到分離有機(jī)弱酸、弱堿的目的，這種技術(shù)稱為離子抑制色譜法。第39頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天調(diào)節(jié)pH范圍：2～7.5

pH>8.0

破壞鍵合相與載體的結(jié)合

pH<2.0

腐蝕柱子離子抑制色譜法適用：弱酸堿物質(zhì)

pKa=3～7弱酸；

pKa=7～8弱堿；兩性化合物。第40頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.3.4其他色譜法離子色譜法

IonChromatography，簡(jiǎn)稱IC

傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問(wèn)題：

a.需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；

b.洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。第41頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

離子色譜的創(chuàng)始人是H.Small。

1975年提出抑制型離子色譜法。第42頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

以分析F-、Cl-等陰離子為例：交換柱裝OH型陰離子交換樹脂，抑制柱內(nèi)裝H型的強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹脂。流動(dòng)相是氫氧化鈉或碳酸氫鈉組成的稀溶液。第43頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天手性色譜法（chiralchromatography）

～是利用手性固定相或手性流動(dòng)相添加劑分離分析手性化合物的對(duì)映異構(gòu)體的色譜法。第44頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天環(huán)糊精色譜法（CDC）根據(jù)環(huán)糊精與手性分子的鑲嵌關(guān)系分離異構(gòu)體。膠束色譜法（MC）

該系統(tǒng)具有固定相－流動(dòng)相－膠束－固定相，3個(gè)界面、3個(gè)分配系數(shù)，具有較好的選擇性。第45頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天親合色譜法（Affinitychromatograph）

利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。第46頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天固定相第47頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.4.1化學(xué)鍵合相色譜法的固定相

鍵合相（bondedphase；BP）：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將官能團(tuán)鍵合在載體表面所形成的固定相。載體的類型：硅膠又有表面多孔型（即薄殼型）和全多孔微粒型。第48頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天廠商：Porasil、Zorbel4、Lichrosorb系列，上海試劑一廠的堆積硅珠、青島海洋化工廠的YWG系列、天津試劑二廠的DG系列廠商：Zipax、CorasilⅠ和Ⅱ

Vydac、Pellosil以及上海試劑一廠的薄殼玻璃珠。無(wú)定形球形全多孔硅膠（廢棄）第49頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天b.其他金屬氧化物制備硅膠載體的好處。硅膠載體的不足：

在堿性介質(zhì)中（pH>8）不穩(wěn)定；在孔隙中大分子擴(kuò)散困難，降低柱效；硅膠表面上的剩余硅羥基對(duì)分離有影響。目前研制的基質(zhì)有：氧化鋁、氧化鋯、氧化釷和氧化鈦。第50頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天主要掌握正相和反相鍵合相：鍵合的基團(tuán)的極性及適用情況。

第51頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天表：反相HPLC常用的化學(xué)鍵合相類型牌號(hào)名稱官能團(tuán)粒度/μm形狀說(shuō)明長(zhǎng)鏈YWG-C18H37C18硅烷10非球形PartisilODSC18硅烷5，10非球形5％CZprbaxODSC18硅烷6球形15％C短鏈LiChrosorbRP-8C8硅烷5，10非球形13％～14％CYWGC6H6苯基硅烷10非球形7％CLiChrosorbRP-2二甲基硅烷5，10非球形5％C第52頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天鍵合相的性質(zhì)和特點(diǎn)

含碳量：指鍵合在硅膠表面上的烷基所含碳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，隨鏈長(zhǎng)增長(zhǎng)，從3％～22％。

覆蓋度：指硅膠被鍵合后，在硅膠中的有效羥基與硅烷試劑反應(yīng)的程度，在鍵合后有時(shí)還用短鏈的硅烷試劑與剩余和新產(chǎn)生的羥基反應(yīng)，使羥基全部被”帽蓋“（即封尾）而不起作用。第53頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

鍵合相的特點(diǎn)：使用過(guò)程中不流失；化學(xué)穩(wěn)定性好；適于梯度洗脫；載樣量大。第54頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天流動(dòng)相（溶劑系統(tǒng)）第55頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天HPLC對(duì)流動(dòng)相的要求：不與固定相反應(yīng)；對(duì)試樣有適宜的溶解度，k在1～10之內(nèi)，最好在2～5之間；與檢測(cè)器相適應(yīng)；純度高，粘度小。使用前濾過(guò)，脫氣。第56頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.5.1分離方程式

討論：α主要受溶劑種類的影響；在溶劑組成確定后，k主要由溶劑的配比所左右。第57頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.5.2Snyder溶劑分類

Snyder選擇了3個(gè)參考物質(zhì)，用于檢驗(yàn)溶劑的3種分子間作用力，分別用Xe、Xd、Xn表述。

表：參考物與被檢溶劑間的作用力參考物乙醇（質(zhì)子給予體）二氧六環(huán)（質(zhì)子受體）硝基甲烷（強(qiáng)偶極）被檢溶劑的作用力類型質(zhì)子受體作用力(Xe)質(zhì)子給予體作用力(Xd)強(qiáng)偶極作用力(Xn)第58頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

描述溶劑極性用Snyder提出的溶劑極性參數(shù)P'來(lái)衡量。表：常用溶劑的極性參數(shù)和選擇性參數(shù)溶劑P'XeXdXn正戊烷0.0---乙醚2.80.530.130.34二氯甲烷3.10.290.180.53氯仿4.10.250.410.33甲醇5.10.480.220.31第59頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

可將81種色譜溶劑，按Xe、Xd、Xn在三角形坐標(biāo)圖上的相鄰關(guān)系分為8類。

選擇不同組別的溶劑，分子作用力不同，容易使α改變，利于分離。第60頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.5.3正相洗脫與反相洗脫

溶劑洗脫強(qiáng)度指流動(dòng)相中溶劑的洗脫能力,它不僅與流動(dòng)相，而且與固定相的極性有關(guān)。在正相色譜中,“溶劑洗脫強(qiáng)度”與溶劑極性成正比；而在反相色譜中，溶劑極性越大,洗脫能力越小。第61頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天

反相鍵合相色譜法的溶劑強(qiáng)度用另一強(qiáng)度因子S表示。表：反相色譜常用溶劑的強(qiáng)度因子S水甲醇乙腈丙酮二噁烷乙醇異丙醇四氫呋喃03.03.23.43.53.64.24.5第62頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天混合液設(shè)計(jì)統(tǒng)計(jì)技術(shù)：根據(jù)溶劑選擇性分組，選具有顯著選擇性差異的溶劑。反相：水為底劑，甲醇、乙腈和四氫呋喃為選擇性溶劑。正相：已烷或戊烷為底劑，乙醚、氯仿和二氯甲烷為選擇性溶劑。第63頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天混合溶劑的強(qiáng)度

第64頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天20.5.4洗脫方式等度洗脫：

在一個(gè)分析周期內(nèi)流動(dòng)相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少、性質(zhì)差別不大的試樣。第65頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天梯度洗脫（程序洗脫）在一個(gè)分析周期內(nèi)程序程序控制改變流動(dòng)相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和pH值等，可使一個(gè)復(fù)雜樣品中性質(zhì)差異很大的組分，能在各自適宜的分離條件（容量因子k適宜）下分離。梯度洗脫能縮短分析時(shí)間、提高分離度、改善峰形、提高檢測(cè)靈敏度。第66頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天高效液相色譜儀第67頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天總圖第68頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天第69頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天高壓泵主要部件之一，壓力：150～350×105Pa。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性第70頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星期天梯度淋洗裝置外梯度:

利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。內(nèi)梯度:

一臺(tái)高壓泵,通過(guò)比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。第71頁(yè),共79頁(yè)，2024年2月25日，星