1.2+.2微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用課件-2022-2023學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

自然界中微生物數(shù)量繁多，種類龐雜，要想從中分離出需要的特定微生物并不容易，尤其當(dāng)要分離的微生物在混合菌群中不是優(yōu)勢(shì)種群時(shí)，更難實(shí)現(xiàn)。那么我們又如何達(dá)成這一目標(biāo)呢？閱讀課本P16回答：1、為什么水生棲熱菌能從熱泉中篩選出來呢？2、棲熱菌的篩選對(duì)我們篩選出特定微生物有何借鑒意義？二、微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)（一）選擇培養(yǎng)基1．水生棲熱菌的篩選：水生棲熱菌能在70～80℃的高溫條件下生存，而絕大多數(shù)微生物在此條件下不能生存。2．選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，允許特定種類的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。目的：從眾多的微生物中分離所需要的微生物選擇培養(yǎng)基方法特點(diǎn)舉例利用微生物的營養(yǎng)特點(diǎn)進(jìn)行選擇培養(yǎng)通過控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分，使某種微生物能生長(zhǎng)，其他微生物不能生長(zhǎng)利用只含有尿素一種氮源的培養(yǎng)基，可篩選出分解尿素的細(xì)菌；加入高濃度的食鹽可篩選出金黃色葡萄球菌利用某種化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行的選擇培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)物質(zhì)，抑制某些微生物，同時(shí)選擇所需的微生物加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌利用培養(yǎng)條件進(jìn)行的選擇培養(yǎng)改變微生物的培養(yǎng)條件在高溫環(huán)境中培養(yǎng)可以得到耐高溫的微生物，不加含碳有機(jī)物可分離出自養(yǎng)型微生物，不添加氮源可分離固氮菌三種篩選方法的特點(diǎn)及舉例思考-討論選擇培養(yǎng)基配方的設(shè)計(jì)尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種重要的氮肥。尿素被土壤中某些細(xì)菌分解成NH3,再被轉(zhuǎn)化為NO3-、NH4+等被植物吸收。這些細(xì)菌之所以能分解尿素，是因?yàn)槟芎铣呻迕?，來催化尿素分解。討論?、你如何設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方，將土壤稀釋液中能分解尿素的細(xì)菌分離出來？2、該培養(yǎng)基與普通培養(yǎng)基有哪些共同點(diǎn)和不同點(diǎn)？培養(yǎng)基添加尿素作唯一氮源，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素缺乏氮源而不能生長(zhǎng)發(fā)育繁殖，所以用此培養(yǎng)基就能夠選擇出分解尿素的微生物。該培養(yǎng)基只是用尿素作為唯一氮源。其他成分基本相同。（二）微生物的選擇培養(yǎng)如果想知道1g土壤中有多少能分解尿素的細(xì)菌，還需對(duì)土壤菌液進(jìn)行稀釋及科學(xué)的微生物數(shù)量測(cè)定方法---稀釋涂布平板法。2、實(shí)驗(yàn)的具體操作：2）土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌1）制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基1、稀釋涂布平板法是將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。稀釋度足夠高時(shí)，能在培養(yǎng)基表面形成單個(gè)菌落6支試管，分別加入9ml無菌水1ml1021ml1031ml1041ml1051ml1061ml1073）樣品梯度稀釋：微量移液器稀釋10倍菌液101土壤10g在火焰旁稱取土壤10g，加入盛有90ml無菌水的錐形瓶中，搖勻，制成稀釋10倍的土壤菌液分別取1ml上清液，加入盛有9ml無菌水的試管中，依次等比稀釋，制成不同稀釋倍數(shù)的菌液。取6支試管，分別加入9ml無菌水。移液管要經(jīng)過滅菌，并且操作應(yīng)在酒精燈火焰附近完成取菌液：取0.1mL菌液滴加到培養(yǎng)基表面

涂布器消毒：將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中

涂布器滅菌：將沾有少量酒精的涂布器在火焰上灼燒，待酒精燃盡后、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布涂布平板：用涂布器將菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻4）涂布平板操作各梯度分別涂布3個(gè)平板1個(gè)不涂布作空白對(duì)照放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)1～2d5）培養(yǎng)與觀察稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對(duì)照恒溫培養(yǎng)箱接種方法的判斷？？？平板劃線法和稀釋涂布平板法的區(qū)別。比較項(xiàng)目平板劃線法稀釋涂布平板法關(guān)鍵操作接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線①一系列的梯度稀釋②涂布平板操作注意事項(xiàng)每次劃線前后均需灼燒接種環(huán)稀釋度要足夠高，為確保實(shí)驗(yàn)成功可以增加稀釋度的范圍優(yōu)點(diǎn)可以觀察菌落特征，對(duì)混合菌進(jìn)行分離可以分離、純化微生物并計(jì)數(shù)，可以觀察菌落特征缺點(diǎn)不能對(duì)微生物計(jì)數(shù)操作復(fù)雜，需要涂布多個(gè)平板項(xiàng)目直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法原理利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積的樣品中微生物的數(shù)量當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)菌體本身培養(yǎng)基上菌落數(shù)缺點(diǎn)不能區(qū)分死菌活菌，不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)菌體連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落公式每毫升原液含菌數(shù)＝每小格平均菌體數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)每毫升原液含菌數(shù)＝培養(yǎng)基上平均菌落數(shù)÷涂布液體積×稀釋倍數(shù)結(jié)果比實(shí)際值偏大比實(shí)際值偏小稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。（三）微生物的數(shù)量測(cè)定稀釋涂布平板法注意事項(xiàng)①為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30—300的平板上進(jìn)行計(jì)數(shù)。②為增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)說服力與準(zhǔn)確性，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要涂布至少三個(gè)平板作為重復(fù)組。③統(tǒng)計(jì)的菌落往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。④分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。練習(xí)1：甲同學(xué)做此實(shí)驗(yàn)在稀釋倍數(shù)105獲得3個(gè)平板，菌落數(shù)分別是80、90、100，涂布平板時(shí)均使用0.1ml菌液，試計(jì)算每克土壤中可以分離尿素的細(xì)菌數(shù)目？（80+90+100）/30.1×105=9×107個(gè)兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。1、甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230。2、乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。你認(rèn)為這兩位同學(xué)的作法正確嗎？如果有問題，錯(cuò)在哪？

甲：沒有重復(fù)實(shí)驗(yàn)（至少涂布3個(gè)平板）

乙：其中一個(gè)平板計(jì)數(shù)結(jié)果與其他兩個(gè)相差太大，操作過程可能出現(xiàn)了錯(cuò)誤。練習(xí)2：1、尿素的利用尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥。尿素不能直接被農(nóng)作物吸收。土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、細(xì)菌能利用尿素的原因絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出分解尿素的細(xì)菌。探究.實(shí)踐土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)一、基礎(chǔ)知識(shí)：提出問題：1、如何從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌？2、統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌？1、土壤取樣1）取樣的位置：土壤含有大量的微生物，是微生物的天然培養(yǎng)基。細(xì)菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長(zhǎng)，絕大多數(shù)的細(xì)菌分布距地表3～8cm的土壤層。2）取樣要求：先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。

2、制備培養(yǎng)基制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基3、樣品的稀釋測(cè)土壤中細(xì)菌數(shù)量，一般選用1x104

、1x105

和1x106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)。4、微生物的培養(yǎng)與觀察30-370C溫度下培養(yǎng)1-2d，每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)。二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

三、操作提示2）無菌操作3）做好標(biāo)記

本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前要做好標(biāo)記4）制定計(jì)劃對(duì)于耗時(shí)較長(zhǎng)的生物實(shí)驗(yàn)，要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高工作效率，在操作時(shí)更加有條不紊1）不要將過熱的涂布器放在盛有酒精的燒杯中，以免引燃酒精。a、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌b、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。c、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作

四、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1、結(jié)合對(duì)照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2、你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)目在30-300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個(gè)平板的菌落數(shù)接近？3、你統(tǒng)計(jì)的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？鑒定：在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅，說明該細(xì)菌能夠分解尿素。思考：在以尿素作為唯一氮源的培養(yǎng)基微生物都是能分解尿素的嗎？不一定。因?yàn)橛行┪⑸锟梢岳闷渌⑸锏拇x產(chǎn)物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖。CO(NH2)2脲酶+H2O+CO22NH3五、課題延伸選擇培養(yǎng)基特殊成分加入某種化學(xué)物質(zhì)目的抑制其他微生物生長(zhǎng)，促進(jìn)目的微生物的生長(zhǎng)用途舉例鑒別培養(yǎng)基加入某種指示劑發(fā)生特定顏色反應(yīng)分離出特定微生物鑒別不同的微生物用尿素作唯一氮源的培