雙熒光素酶報(bào)告基因

報(bào)告基因分析

2021/5/911.基本概念和實(shí)驗(yàn)原理報(bào)告基因:編碼可供檢測(cè)的酶與蛋白質(zhì)的基因。是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究領(lǐng)域中用于分析結(jié)構(gòu)基因旁側(cè)區(qū)域潛在的順式元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和沉默子等)和反式作用因子相互作用關(guān)系的一種重要工具。

2021/5/92可作為報(bào)告基因的條件:①編碼產(chǎn)物的活性不受宿主細(xì)胞的干預(yù)。②編碼產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中不存在,易于區(qū)別。③編碼產(chǎn)物的活性的測(cè)定必須具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)。常用的報(bào)告基因：氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(CAT)、β-gal、熒光酶基因(Luc)2021/5/932021/5/942021/5/952.用途：基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的研究：最初的功能。作為分子標(biāo)記的應(yīng)用：如利用GFP作為標(biāo)記物檢測(cè)基因在植物酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移。生物大分子之間的相互作用：激活劑或拮抗劑在改變活細(xì)胞中受體活性作用等方面的研究。其他方面的應(yīng)用：RNA干擾研究、影像技術(shù)及藥物篩選等。2021/5/963.實(shí)驗(yàn)技術(shù)：基因克隆轉(zhuǎn)染細(xì)胞產(chǎn)物檢測(cè)2021/5/97基因克隆的特點(diǎn)和技術(shù)路線特點(diǎn)：分子水平上操作，細(xì)胞水平上表達(dá)技術(shù)路線：

1分離制備目的DNA片段和載體

2目的DNA與載體的剪切

3目的DNA與載體的連接

4重組DNA分子轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞

5篩選陽(yáng)性克隆，大量擴(kuò)增2021/5/98

在這個(gè)過(guò)程中：1.“基因剪刀”

剪切DNA的酶就像一把“基因剪刀”2.“縫紉針”

連接不同來(lái)源DNA分子的酶就像一根“縫紉針”，使二者連在一起3.“交通工具”使用載體好比一輛車子

4.“乘客”

有用基因如IL2好比乘客，車子把乘客送進(jìn)理想天堂（宿主細(xì)胞）去繁衍生息，春華秋實(shí)，生產(chǎn)我們需要的產(chǎn)品或開展基因治療（IL2/LAK→抗癌）。2021/5/99一、目的基因的獲取直接從染色體DNA中分離通過(guò)mRNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因從cDNA文庫(kù)獲取目的基因

PCR擴(kuò)增目的基因人工體外合成基因片段

2021/5/9102021/5/911二、載體定義：能攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的一類DNA分子。特性：1

復(fù)制起點(diǎn)(ori)2多克隆位點(diǎn)：多種限制酶的單一切割位點(diǎn)3篩選標(biāo)志Amp+Kan+Neo+4分子量不宜過(guò)大否則易斷裂、轉(zhuǎn)化效率低5表達(dá)載體還要有P、E、前導(dǎo)序列、加尾信號(hào)、信號(hào)肽、核定位序列等2021/5/912

載體的分類分類依據(jù)

類別克隆擴(kuò)增或表達(dá)舉例1.按功能分成（1）克隆載體（2）表達(dá)載體√√PBR322PCDN32.按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體PUC8PBUDCE41YE3.按載體來(lái)源分質(zhì)粒載體噬菌體載體病毒載體pGEX-4TM13pAdV54.按克隆片段得大?。寺∧芰Γ┓?1)<1kb(2)<10kb(3)<22kb(4)<50kb(5)0.1-0.4Mb(6)0.5-2Mb(1)M13(2)plasmid(3)λphage(4)casmid(5)BAC(6)YAC√2021/5/913常用的報(bào)告基因載體類型：1）basic載體：不含P/E,用于檢測(cè)啟動(dòng)子活性。2）control載體：含啟動(dòng)子，用于檢測(cè)增強(qiáng)子或沉默子的活性。2021/5/914酶切注意事項(xiàng)（最好雙酶切）酶的保存：低溫保存，冰上操作。貯存環(huán)境是甘油，避免反復(fù)凍融。酶切反應(yīng)體系：酶量不能超過(guò)反應(yīng)體積的1/10。反應(yīng)緩沖液：合適的pH值、鹽離子濃度，配套提供。DNA樣品要求：一定純度和濃度，不能混有酚、氯仿、EDTA、SDS、過(guò)多鹽類等。溫度和時(shí)間：通常37℃1-2h反應(yīng)終止：EDTA、SDS、加熱、直接放入-20℃操作要求：無(wú)菌新的dorf管、槍頭、去離子三蒸水。電泳鑒定酶切是否完全。2021/5/915連接-定向克?。ㄗ畛Ｓ茫┓椒ǎ弘p酶切優(yōu)點(diǎn)：防止載體自身環(huán)化正向插入單拷貝插入連接效率高2021/5/916轉(zhuǎn)化的原理和過(guò)程感受態(tài)：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)。致敏：用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作。轉(zhuǎn)化過(guò)程：1對(duì)數(shù)期細(xì)菌置于冷Cacl2、Mgcl2中，制備感受態(tài)2加入重組質(zhì)粒，冰浴30分鐘，不要震蕩342℃水浴60~90S，熱休克4馬上冰浴2021/5/917第七節(jié)篩抗藥性篩選：amprtetr

kanr插入表達(dá)篩選:藍(lán)白斑篩選：測(cè)序菌落或噬菌斑雜交篩選酶切鑒定：插入否？插入方向？2021/5/918轉(zhuǎn)染：指真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)程。若此DNA未與宿主細(xì)胞DNA整合而獲表達(dá)，稱“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(transienttransfection)”；若與宿主細(xì)胞DNA整合并隨后者的復(fù)制而復(fù)制稱“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(stabletransfection)”。

2021/5/919轉(zhuǎn)染方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。

注意事項(xiàng)：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)