SNT 5364.1-2021 出口食品中致病菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR法 第1部分：副溶血性弧菌-PDF解密

ICS07.100.30CCSW04中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T5364.1—2021出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第1部分:副溶血性弧菌DropletdigitalPCRmethodfordetectionofpathogensinexportfood-Part1:Vibrioparahaemolyticus2021-11-22發(fā)布2022-06-01實施中華人民共和國海關(guān)總署發(fā)布Ⅰ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分:標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。SN/T5364—2021《出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法》共分為8個部分:第1部分:副溶血性弧菌;第2部分:霍亂弧菌;第3部分:溶藻弧菌;第4部分:創(chuàng)傷弧菌;第5部分:金黃色葡萄球菌;第6部分:單核細(xì)胞增生李斯特氏菌;第7部分:產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌;第8部分:克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)。本文件為SN/T5364—2021的第1部分。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中華人民共和國海關(guān)總署提出并歸口。海關(guān)。1SN/T5364.1—2021出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第1部分:副溶血性弧菌1范圍本文件規(guī)定了食品中副溶血性弧菌的微滴式數(shù)字PCR檢測方法。本文件適用于食品中副溶血性弧菌的快速定性檢測。本文件的檢出限為1CFU/25g~5CFU/25g(或1CFU/25mL~5CFU/25mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB4789.7食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗副溶血性弧菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403—2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。blaCARB(CARB-typebeta-lactamasegene):CARB型β-內(nèi)酰胺酶編碼基因。DNA(deoxyribonuleicacid):脫氧核糖核酸。ddPCR(dropletdigitalpolymerasechainreaction):微滴式數(shù)字PCR。PCR(polymerasechainreaction):聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。5方法原理針對副溶血性弧菌β-內(nèi)酰胺酶編碼基因(blaCARB)保守序列設(shè)計引物、探針,將一定濃度的引物、探針與模板DNA及數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液混合,配成PCR反應(yīng)體系。將該數(shù)字PCR體系分布到10000~20000個微滴中,使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。blaCARB基因探針5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán),利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的檢測通道,可對每個微滴的熒光信號進(jìn)行采集分析。含有模板DNA的微滴出現(xiàn)熒光信號的增強,形成陽性微滴簇。最終根據(jù)陽性微滴的有無判定樣品中是否含有副溶血性弧菌。26主要設(shè)備及耗材6.1天平:感量0.1g。6.2均質(zhì)器。6.3恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。6.4高速臺式冷凍離心機(離心力12000g)。6.5渦旋振蕩儀。6.6核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.7生物安全柜。6.8ddPCR擴(kuò)增儀及相關(guān)配套設(shè)備。6.9不同量程移液器:100μL~1000μL、20μL~200μL、10μL~100μL、0.5μL~10μL。6.10離心管:2mL、1.5mL和0.2mL。7材料與試劑7.1僅使用分析純試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級水。7.2細(xì)菌基因組提取試劑盒。7.3ddPCR反應(yīng)配套試劑。7.4去游離核酸酶:伯樂1)。7.5陽性對照:副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA,或含目的片段的DNA亦可。7.6副溶血性弧菌β-內(nèi)酰胺酶編碼基因(blaCARB)特異性序列片段參見附錄A,引物探針如下:VP-F:5’-GTGAAGCCGCCATGTTGAT-3’;VP-R:5’-GACCACCAATTTCATTTAGCACTAAG-3’;VP-P:5’-FAM-AGCGACAACACCGCCGCGA-BHQ1-3’。8檢測程序食品中副溶血性弧菌ddPCR檢測程序見圖1。1)給出這一信息是為了方便本文件使用者,并不表示只認(rèn)可該產(chǎn)品。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果,則可使用等效產(chǎn)品。3SN/T5364.1—2021圖1食品中副溶血性弧菌ddPCR檢測程序9實驗操作步驟9.1樣品制備參照GB4789.7中方法進(jìn)行樣品制備和增菌。9.2DNA提取直接取9.1獲得的增菌液2mL加到無菌離心管中,8000g離心2min,盡量吸棄上清;利用100μL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀,加入20μL去游離核酸酶,置于37℃作用15min~30min,95℃加熱10min使酶失活。繼而利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取DNA,操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。9.3DNA濃度和純度測定取適量DNA原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測定260nm和280nm處的吸收值,按照式(1)計算DNA的濃度。ρ=A260×N×50…………(1)4SN/T5364.1—2021式中:ρ—DNA濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);A260—260nm處的吸光值;N—核酸稀釋倍數(shù)。當(dāng)DNA濃度為0.1μg/mL~100μg/mL,A260/A280在1.8~2.0之間時,適用ddPCR檢測。9.4ddPCR檢測9.4.1對照和平行檢測過程中分別設(shè)置陽性對照、陰性對照和空白對照。以副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽性對照,利用細(xì)菌基因組提取試劑盒按步驟9.2提取的大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為陰性對照,用等體積的雙蒸水代替DNA模板作為空白對照。每個待檢樣品提取的DNA溶液進(jìn)行3個平行ddPCR檢測。9.4.2反應(yīng)體系按照表1配制反應(yīng)體系。表1ddPCR反應(yīng)體系試劑名稱儲備液濃度終濃度體積數(shù)字PCR反應(yīng)預(yù)混液2×1×10μLVP-F10μmol/L0.75μmol/L1.5μLVP-R10μmol/L0.75μmol/L1.5μLVP-P10μmol/L0.25μmol/L0.5μLDNA模板 5μL水 1.5μL體系總體積 20μL9.4.3微滴生成將配制好的ddPCR反應(yīng)混合液,加入微滴生成裝置加樣孔中,按儀器操作說明生成微滴。9.4.4ddPCR擴(kuò)增將生成的微滴緩慢轉(zhuǎn)移至96孔板中,封膜后置于PCR儀上,按以下參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增:95℃10min(升降溫速度:1℃/s);94℃30s(升降溫速度:1℃/s),60℃1min(升降溫速度:1℃/s),45個循環(huán);98℃10min(升降溫速度:1℃/s),4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。注:PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。9.4.5熒光信號讀取擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后,將96孔板放入ddPCR檢測儀中對每個微滴進(jìn)行熒光檢測,采用FAM通道讀取熒光信號。510結(jié)果分析與表述10.1閾值的設(shè)定根據(jù)空白對照的終點熒光值設(shè)定閾值限,閾值限應(yīng)對空白和陽性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行明確的區(qū)分。10.2質(zhì)量控制10.2.1體系分隔產(chǎn)生的有效微滴的總數(shù)量滿足所用ddPCR儀器型號要求。10.2.2陰性對照和空白對照無熒光信號檢出。10.2.3陽性對照有熒光信號檢出且陰性微滴簇與陽性微滴簇能夠截然分開。10.2.4以上質(zhì)控條件有一項不符合者,實驗結(jié)果視為無效,查找原因后再次進(jìn)行ddPCR檢測。10.3結(jié)果表述10.3.1待檢樣品所有微滴的熒光信號均低于閾值限,待測樣品中不含有副溶血性弧菌,檢測結(jié)果表述為“未檢出副溶血性弧菌”。10.3.2待檢樣品3個平行中至少1個平行有熒光信號高于閾值限的陽性微滴,且陰性微滴簇與陽性微滴簇能夠截然分開,該樣品結(jié)果為副溶血性弧菌初篩陽性,對樣品的增菌液進(jìn)一步按GB4789.7中的操作步驟進(jìn)行確認(rèn)后報告結(jié)果。11防污染措施檢測過