SNT 5364.2-2021 出口食品中致病菌檢測方法 微滴式數(shù)字PCR法 第2部分：霍亂弧菌-PDF解密

ICS07.100.30CCSX04中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T5364.2—2021出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第2部分:霍亂弧菌DropletdigitalPCRmethodfordetectionofpathogensinexportfood—Part2:Vibriocholerae2021-11-22發(fā)布2022-06-01實施中華人民共和國海關總署發(fā)布ⅠSN/T5364.2—2021本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分:標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。SN/T5364—2021《出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法》共分為8個部分:第1部分:副溶血性弧菌第2部分:霍亂弧菌第3部分:溶藻弧菌第4部分:創(chuàng)傷弧菌第5部分:金黃色葡萄球菌第6部分:單核細胞增生李斯特氏菌第7部分:產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌第8部分:克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)本文件為SN/T5364—2021的第2部分。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本文件由中華人民共和國海關總署提出并歸口。本文件起草單位:中國海關科學技術研究中心、中華人民共和國天津海關、中國檢驗檢疫科學研究院。1SN/T5364.2—2021出口食品中致病菌檢測方法微滴式數(shù)字PCR法第2部分:霍亂弧菌1范圍本文件規(guī)定了食品中總霍亂弧菌和含毒力基因霍亂弧菌的微滴式數(shù)字PCR檢測方法。本文件適用于食品中總霍亂弧菌和含毒力基因霍亂弧菌的快速定性檢測。本文件的檢出限為1CFU/25g~5CFU/25g(或1CFU/25mL~5CFU/25mL)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中,注日期的引用文件,僅該日期對應的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T27403—2008實驗室質量控制規(guī)范食品分子生物學檢測SN/T1022進出口食品中霍亂弧菌檢驗方法3術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。4縮略語下列縮略語適用于本文件。DNA(deoxyribonuleicacid):脫氧核糖核酸。ddPCR(dropletdigitalpolymerasechainreaction):微滴式數(shù)字PCR。gbpA(GlcNAc-bindingproteingene):N-乙酰葡糖胺結合蛋白A的編碼基因。PCR(polymerasechainreaction):聚合酶鏈式反應。tcpA(toxincoregulatedpilingene):毒力協(xié)同調節(jié)菌毛編碼基因。5方法原理分別針對霍亂弧菌種屬特異性gbpA基因及毒力基因tcpA設計引物/探針,將一定濃度的引物、探針與模板DNA及數(shù)字PCR反應預混液混合,配成雙重數(shù)字PCR反應體系。將該雙重數(shù)字PCR體系分布到10000~20000個微滴中,使大部分微滴中模板DNA分子的數(shù)量為1或0,然后進行PCR擴增。gbpA基因及tcpA基因探針5’端分別標記FAM和VIC熒光基團,利用數(shù)字PCR系統(tǒng)的雙通道檢測,可同時對兩個基因的熒光信號進行采集分析。根據(jù)gbpA基因及tcpA基因所對應的陽性微滴2SN/T5364.2—2021的有無判定樣品中是否含有霍亂弧菌和含毒力基因的霍亂弧菌。6主要設備及耗材6.1天平:感量0.1g。6.2均質器。6.3恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。6.4高速臺式冷凍離心機(離心力12000g)。6.5渦旋振蕩儀。6.6核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。6.7生物安全柜。6.8ddPCR擴增儀及相關配套設備。6.9不同量程移液器:100μL~1000μL、20μL~200μL、10μL~100μL、0.5μL~10μL。6.10離心管:2mL、1.5mL和0.2mL。7材料與試劑7.1僅使用分析純試劑和符合GB/T6682規(guī)定的一級水。7.2細菌基因組提取試劑盒。7.3ddPCR反應配套試劑。7.4去游離核酸酶:伯樂1)。7.5陽性對照:霍亂弧菌參照菌株DNA,或含目的片段的DNA亦可。7.6霍亂弧菌N-乙酰葡糖胺結合蛋白A的編碼基因(gbpA)序列片段參見附錄A.1,引物探針如下:gbpA-F:5’-CAAACCAAACTGGAACCCAAA-3’;gbpA-R:5’-TCAACGACACAGAACGGATTG-3’;gbpA-P:5’-FAM-CCATTGTCGCGTGATGCATTTGACC-BHQ1-3’。7.7霍亂弧菌毒力協(xié)同調節(jié)菌毛編碼基因(tcpA)序列片段參見附錄A.2,引物探針如下:tcpA-F:5’-GGGATATGTTTCCATTTATCAACGT-3’;tcpA-R:5’-GCGACACTCGTTTCGAAATCA-3’;tcpA-P:5’-FAM-TGCTTTCGCTGCTGTCGCTGATCTT-BHQ1-3’。8檢測程序食品中霍亂弧菌ddPCR檢測程序見圖1。1)給出這一信息是為了方便本文件使用者,并不表示只認可該產(chǎn)品。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果,則可使用等效產(chǎn)品。3SN/T5364.2—2021圖1食品中霍亂弧菌ddPCR檢測程序9實驗操作步驟9.1樣品制備參照SN/T1022中方法進行樣品制備和第一次選擇性增菌。9.2DNA提取直接取9.1獲得的增菌液2mL加到無菌離心管中,8000g離心2min,盡量吸棄上清;利用100μL磷酸鹽緩沖液重懸沉淀,加入20μL去游離核酸酶,置于37℃作用15min~30min,95℃加熱10min使酶失活。繼而利用細菌基因組提取試劑盒提取DNA,操作方法按試劑盒說明書進行。9.3DNA濃度和純度測定取適量DNA原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后,使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測定260nm和280nm處的吸收值,按照式(1)計算DNA的濃度。式中:ρ=A260×N×50…………(1)ρ—DNA濃度,單位為微克每毫升(μg/mL);A260—260nm處的吸光值;N—核酸稀釋倍數(shù)。當DNA濃度為0.1μg/mL~100μg/mL,A260/A280在1.8~2.0之間時,適用ddPCR檢測。4SN/T5364.2—20219.4ddPCR檢測9.4.1對照和平行檢測過程中分別設置陽性對照、陰性對照和空白對照。以霍亂弧菌標準菌株DNA或含目的片段的DNA作為陽性對照,利用細菌基因組提取試劑盒按步驟9.2提取的大腸埃希氏菌標準菌株DNA作為陰性對照,用等體積的雙蒸水代替DNA模板作為空白對照。每個待檢樣品提取的DNA溶液進行3個平行ddPCR檢測。9.4.2反應體系按照表1配制反應體系。表1ddPCR反應體系試劑名稱儲備液濃度終濃度體積數(shù)字PCR反應預混液2×1×10μLgbpA-F10μmol/L0.75μmol/L1.5μLgbpA-R10μmol/L0.75μmol/L1.5μLgbpA-P10μmol/L0.25μmol/L0.5μLtcpA-F10μmol/L0.75μmol/L1.5μLtcpA-R10μmol/L0.75μmol/L1.5μLtcpA-P10μmol/L0.25μmol/L0.5μLDNA模板— 3μL體系總體積— 20μL9.4.3微滴生成將配制好的數(shù)字PCR反應混合液,加入微滴生成裝置加樣孔中,按儀器操作說明生成微滴。9.4.4ddPCR擴增將生成的微滴緩慢轉移至96孔板中,封膜后置于PCR儀上,按以下參數(shù)進行PCR擴增:95℃10min(升降溫速度:1℃/s);94℃30s(升降溫速度:1℃/s),60℃1min(升降溫速度:1℃/s),45個循環(huán);98℃10min(升降溫速度:1℃/s),4℃保存反應產(chǎn)物。注:PCR反應參數(shù)可根據(jù)基因擴增儀型號的不同進行適當?shù)恼{整。9.4.5熒光信號讀取擴增反應結束后,將96孔板放入ddPCR檢測儀中對每個微滴進行熒光檢測,采用FAM和VIC通道分別讀取gbpA基因及tcpA基因擴增的熒光信號。10結果分析與表述10.1閾值的設定根據(jù)空白對照的終點熒光值設定閾值限,閾值限應對空白和陽性擴增結果進行明確的區(qū)分。5SN/T5364.2—202110.2質量控制10.2.1體系分隔產(chǎn)生的有效微滴的總數(shù)量滿足所用ddPCR儀器型號要求。10.2.2陰性對照和空白對照無熒光信號檢出。10.2.3陽性對照有熒光信號檢出且陰性微滴簇與陽性微滴簇能夠截然分開。10.2.4以上質控條件有一項不符合者,實驗結果視為無效,查找原因后再次進行ddPCR檢測。10.3結果表述10.3.1待檢樣品所有微滴gbpA基因及tcpA基因對應的熒光信號均低于閾值限,待測樣品中不含有霍亂弧菌,檢測結果表述為“未檢出霍亂弧菌”。10.3.2待檢樣品3個平行中至少1個平行gbpA基因有熒光信號高于閾值限的陽性微滴,且陰性微滴簇與陽性微滴簇能夠截然分開,該樣品結果為霍亂弧菌初篩陽性,對樣品的增菌液進一步按SN/T1022中的操作步驟進行確認后報告結果。10.3.3滿足8.3.2的情況下,若tcpA基因同時出現(xiàn)熒光信號高于閾值限的陽性微滴,則該樣品結果為含有毒力基因的霍亂弧菌初篩陽性,對樣品的增菌液進一步按SN/T1022中的操作步驟進行確認后報告結果。11防污染措施檢測過程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。6SN/T5364.2—2021附錄A(資料性)霍亂弧菌特異性基因序列片段A.1霍亂弧菌gbpA基因序列(部分)及