布魯氏菌病檢測

布魯氏菌病檢測一、概念：布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布?。┦怯刹剪斒暇鸬娜?、畜共患的傳染病。在家畜中，牛、羊、豬最常發(fā)生，且可由牛、羊、豬傳染給人和其他家畜。其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶。二、檢測技術(shù)血清學(xué)檢測技術(shù)病原學(xué)檢測技術(shù)（一）血清學(xué)檢測技術(shù)1、凝集反應(yīng)

抗原與抗體之間具有特異性的化學(xué)親和力，當(dāng)它們比例合適時，則構(gòu)成一個大復(fù)合物，在電解質(zhì)(一般用生理鹽水)的作用下,形成肉眼看可見凝集現(xiàn)象，因此稱為凝集反應(yīng)。2、虎紅平板凝集試驗2.1材料準(zhǔn)備2.1.1抗原、標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。2.1.2受檢血清應(yīng)新鮮，無明顯蛋白凝塊，無溶血和腐敗氣味。2.1.3潔凈的玻璃板，其上劃分成4cm的方格。2.1.4吸管或分裝器，適用于滴加0.03ml。2.1.5牙簽或火柴桿，供攪拌用。2.2操作方法2.2.1將玻璃板上各格標(biāo)記受檢血清號，然后加相應(yīng)血清0.03ml。2.2.2在受檢血清旁滴加抗原0.03ml。2.2.3用牙簽類小棒攪動血清和抗原使之混合。2.2.4每次試驗應(yīng)設(shè)陰、陽性血清對照。2.3判定2.3.1在陰、陽性血清對照成立的條件下，方可對被檢血清進行判定。2.3.2受檢血清在4min內(nèi)出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象者判為陽性（+），無凝集現(xiàn)象，呈均勻粉紅色者判為（-）?；⒓t平板凝集試驗照片虎紅平板凝集試驗照片虎紅平板凝集試驗照片虎紅平板凝集試驗照片虎紅平板凝集試驗照片3布病試管凝集試驗3.1材料準(zhǔn)備3.1.1稀釋液

0.5%石炭酸生理鹽水，檢驗羊血清時用含有0.5%

石炭酸的10%鹽溶液，如果稀釋用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液，抗原的稀釋亦用含0.5%石炭酸的10%鹽溶液。

3.1.3凝集試驗管（三分管）、試管架、吸管及溫箱。3.1.2抗原、陽性血清和陰性血清由制標(biāo)單位提供，按說明書使用。3.2操作方法3.2.1按常規(guī)方法采血分離血清。3.2.2運送和保存血清樣品時防止凍結(jié)和受熱，以免影響凝集價。若3d內(nèi)不能送到實驗室，按每9ml血清加1ml0.5%石炭酸生理鹽水（徐徐加入）防腐，也可用冷藏方法運送血清。3.2.3受檢血清的稀釋3.2.3.1第1管標(biāo)記檢驗編碼后加1.15ml稀釋液。3.2.3.2第2~4管各加入0.5ml稀釋液。3.2.3.3然后用1ml吸管取被檢血清0.1ml；加入第1管內(nèi)，并混合均勻。混合方法是將該試管中的混合液吸入吸管內(nèi)，再沿試管壁吹入試管中，如此吸入、吹出3~4，充分混合后以該吸管吸混合液0.25ml棄去。3.2.3.4取0.5ml混合液加入第2管，用該吸管如前述方法混合。3.2.3.5再吸第2管混合液0.5ml至第3管，如此倍比稀釋至第4管，從第4管棄去混勻液0.5ml。3.2.3.6稀釋完畢，從第1至第4管的血清稀釋度分別為1:12.5;1:25;1:50和1:100。3.2.3.7牛、馬、鹿、駱駝血清稀釋法與上述基本一致，差異是第1管加1.2ml稀釋液和0.05ml被檢血清。3.2.3.8將0.5ml20倍稀釋的抗原加入已稀釋好的各血清管中，并振搖均勻，羊和豬的血清稀釋則依次變?yōu)?:25;1:50;1:100和1:200，牛、馬和駱駝的血清稀釋度則依次變?yōu)?:50;1:100；1:200和1:400。大規(guī)模檢疫時也可只用2個稀釋度，即牛、馬、駱駝用1:50和1:100，豬、山羊、綿羊和狗用1:25和1:50。

12

3

4

5

-

n血清稀釋度1:501:1001:2001:4001:8000.5%石炭酸生理鹽水1.20.50.50.50.50.5棄去0.5被檢血清或陽陰性血清對照0.050.75棄去0.25

0.50.50.50.5

總量0.50.50.50.50.50.5加抗原（1：20）

0.50.50.50.50.50.5充分混勻37℃18-24小時溫育

結(jié)果判定

++++++++++--布魯氏菌病試管凝集反應(yīng)試驗（牛）

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5

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n血清稀釋度1:251:501:1001:2001:4000.5%石炭酸10%鹽水1.150.50.50.50.50.5棄去0.5

被檢血清或陽陰性血清對照0.10.75棄去0.25

0.50.50.50.5

總量0.50.50.50.50.50.5加抗原（1：20）

0.50.50.50.50.50.5充分混勻37℃18-24小時溫育

結(jié)果判定

++++++++++--布魯氏菌病試管凝集反應(yīng)試驗（羊）

3.2.3.10每次檢驗均應(yīng)設(shè)陽性血清、陰性血清和抗原對照，即

a)陰性血清對照：陰性血清的稀釋和加抗原的方法與受檢血清同。

b)陽性血清對照：陽性血清須稀釋到原有滴度，加抗原的方法與受檢血清同。

c)抗原對照：1:20稀釋抗原液0.5ml，再加0.5ml稀釋液，觀察抗原是否有自凝現(xiàn)象。

注：試管凝集試驗簡便方法試管凝集試驗也可用較簡便方式進行，即將血清以0.08毫升、0.04毫升、0.02毫升及0.01毫升分別加入四支小試管內(nèi)，然后每管加入1：40稀釋的抗原1毫升，充分搖勻，這樣4管血清的最后稀釋度分別為1：25、1：50、1：100和1：2003.3判定3.3.1供判定參照比濁管制備方法管號1：40稀釋抗原液mL稀釋液mL清亮度記錄標(biāo)記123450.000.250.500.751.001.000.750.500.250.001007550250++++++++++-3.3.2置37℃~40℃溫箱24h，取出檢查并記錄結(jié)果。3.3.3結(jié)果判定3.3.3.1凝集反應(yīng)程度分為：參照比濁管，按各試管上層液清亮度判讀

a)++++菌體完全凝集，100%下沉，上層液體100%清亮；

b)+++菌體幾乎完全凝集，上層液體75%清亮；

c)++菌體凝集顯著，液體50%清亮；

d)+凝集物有沉淀，液體25%清亮；

e)–凝集物無沉淀，液體均勻渾濁。3.3.3.2牛、馬、鹿和駱駝1:100血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗用1:50血清稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為陽性。3.3.2.3牛、馬、鹿和駱駝1:50血清稀釋，豬、山羊、綿羊和狗用1:25血清稀釋，出現(xiàn)“++”以上凝集現(xiàn)象時，受檢血清判定為可疑反應(yīng)。布病試管凝集試驗照片布病試管凝集試驗照片布病試管凝集試驗照片布病試管凝集試驗照片布病試管凝集試驗照片可疑反應(yīng)家畜經(jīng)3周~4周后重檢，如果仍為可疑，該牛、羊判為陽性。豬和馬經(jīng)重檢仍保持可疑水平，而農(nóng)場的牲畜沒有臨床癥狀和大批陽性患畜出現(xiàn)，該畜被判為陰性。

豬血清偶有非特異性反應(yīng)，須結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查判定，必須要時應(yīng)配合補體結(jié)合試驗和鑒別診斷，排除耶森氏菌交叉凝集反應(yīng)。布魯氏菌病檢測結(jié)果記錄表檢品編號：

**號

樣品名稱：檢測方法：虎紅平板凝集、試管凝集檢測時間：

備注:GB/T18646-2002

共

頁第

頁檢測編號原始編號

檢測結(jié)果檢測編號原始編號

檢測結(jié)果11722833944105陽性對照+116陰性對照-12結(jié)果分析：共檢樣品多少,其中陽性多少,可疑多少,陰性多少備

注（使用方法）:使用方法,使用試劑廠家及批號檢驗人員：

復(fù)核人：

年

月

日試管凝集反應(yīng)試驗原始結(jié)果記錄表編號稀釋度1:501:1001:2001:4001122334陽性對照####5陰性對照----檢驗人員：

復(fù)核人：

年

月

日病原學(xué)技術(shù)一、分離培養(yǎng)和培養(yǎng)基1分離培養(yǎng)凡從可疑病畜、野生動物或者可疑物中分離到布魯氏菌，即可診斷為布魯氏菌病或帶菌。目前已清楚了解，除了外界環(huán)境中有布魯氏菌存在外，還在60多種家畜和野生動物中分離到了布魯氏菌。分離到布魯氏菌是了解疫情、分析疫情、判斷疫情的最可靠資料。1.1牲畜材料中的布魯氏菌分離培養(yǎng)方法1.1.1流產(chǎn)胎兒培養(yǎng)方法:

流產(chǎn)胎兒取來后，先用清水把泥土等污物洗凈，然后在3%的來蘇兒中浸泡半小時以上，取出在無菌條件下進行解剖。分別取出淋巴結(jié)、肝、脾、胃內(nèi)容物、肺和骨髓等接種在普通培養(yǎng)基或者選擇性培養(yǎng)基上，置37℃溫箱培養(yǎng)。一般情況下3~5天即可獲得陽性結(jié)果。2周內(nèi)無陽性結(jié)果可停止培養(yǎng)。牲畜流產(chǎn)胎兒或者死羔犢是布魯氏菌分離培養(yǎng)最可靠、最有價值的細菌學(xué)材料。在流產(chǎn)胎兒的細菌分離中各種器官均有較高的分離率，尤其肺、脾和胃內(nèi)容物。1.1.2胎衣的檢查：取流產(chǎn)和正產(chǎn)的胎衣用清水洗去糞便等污物，再剪下數(shù)個子葉，用滅菌生理鹽水沖凈，然后用滅菌研磨器研碎或剪碎，接種在選擇培養(yǎng)基上或做生物學(xué)檢查。2布魯氏菌的培養(yǎng)基及其制備方法2.1土豆瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨10克瓊脂15克氯化鈉5克牛肉浸膏5克葡萄糖10克甘油8~12克

1:2土豆浸液500毫升蒸餾水500毫升除葡萄糖外，將上述各成分混合熔化，用多層紗布過濾，用20%的氫氧化鈉調(diào)pH7.2,加入葡萄糖，分裝，15磅高壓20分鐘備用。

1:2土豆浸液的制備：新鮮土豆去外皮，切成塊，稱取500克，放1000毫升蒸餾水中加熱煮沸，熟了為止（約10分鐘），用紗布過濾，其液體置15磅高壓20分鐘備用。2.2肝浸液瓊培養(yǎng)基：蛋白胨10克氯化鈉5克瓊脂15克1:4肝浸液1000毫升將上述各成分混合熔化，用多層紗布過濾，用20%的氫氧化鈉調(diào)pH7.2,分裝，15磅高壓20分鐘備用。

1:4肝浸液的制備：取新鮮牛肝（羊和豬肝也可以）去其脂肪和結(jié)締組織后用清水輕輕洗，用絞肉機絞碎稱取250克，加入蒸餾水1000毫升，在冰箱中浸泡24小時，取出加熱煮沸到熟為止，用帆布或紗布脫脂棉過濾，15磅高壓20分鐘備用。2.3胰蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基：胰蛋白胨20克葡萄糖10克氯化鈉5克瓊脂20克蒸餾水1000毫升先把瓊脂放在蒸餾水中加熱熔化，然后將上述其余各成分加入熔化，用紗布脫脂棉過濾，調(diào)pH6.8~7.0，分裝，13磅高壓30分鐘備用。二、防止與個人防護1防止經(jīng)皮膚感染、粘膜感染和呼吸道感染1.1防止家畜流產(chǎn)物引起感染：接羔助產(chǎn)人員，在接種羔助產(chǎn)和處理胎兒，死羔時，應(yīng)做好個人防護，除備有工作服，橡皮圍裙、帽子、口罩和膠鞋外，還應(yīng)該戴乳膠手套和線手套，備有接羔袋和消毒液，嚴(yán)禁赤手抓拿流產(chǎn)物。家畜的流產(chǎn)胎兒、胎盤、胎衣或死胎等，不要隨意丟棄，以防污染環(huán)境或被狗吃掉引起布病傳播。1.2防止經(jīng)粘膜感染:這里所指的粘膜感染主要是指性器官粘膜。實踐證明，布氏菌很容易經(jīng)性器官粘膜感染發(fā)病。1.3防止經(jīng)呼吸道感