轉(zhuǎn)基因育種與方法課件

作物轉(zhuǎn)基因育種就是根據(jù)育種目標(biāo)，從供體生物中分離目的基因，經(jīng)DNA重組與遺傳轉(zhuǎn)化或直接運(yùn)載進(jìn)入受體作物，經(jīng)過(guò)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的遺傳工程體，并經(jīng)過(guò)田間試驗(yàn)與大田選擇育成轉(zhuǎn)基因新品種或種質(zhì)資源。轉(zhuǎn)基因作物（GMC，geneticallymodifiedcrops）什么是轉(zhuǎn)基因育種?轉(zhuǎn)基因育種與方法與常規(guī)育種技術(shù)相比，轉(zhuǎn)基因育種在技術(shù)上較為復(fù)雜，要求也很高，但是具有常規(guī)育種所不具備的優(yōu)勢(shì)：1.拓寬可利用的基因資源；2.培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高抗優(yōu)良品種提供了嶄新的育種途徑；3.可以對(duì)植物的目標(biāo)性狀進(jìn)行定向變異和定向選擇；4.可以大大提高選擇效率，加快育種進(jìn)程。此外，還可將植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥物等生物制品。轉(zhuǎn)基因育種與方法TraditionalcrossbreedingRecombinantDNAtechniques轉(zhuǎn)基因育種與方法

一、轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀第一節(jié)作物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)自從1983年第一株轉(zhuǎn)基因煙草獲得以來(lái)，至今已有120種植物轉(zhuǎn)基因獲得成功。1996年全球大面積種植，并不斷擴(kuò)大。國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)局（ISAAA）統(tǒng)計(jì)結(jié)果轉(zhuǎn)基因育種與方法世界銀行下屬機(jī)構(gòu)預(yù)測(cè)，世界范圍內(nèi)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)業(yè)的交易額：2005年達(dá)到60億美元；2010年達(dá)到200億美元，1500萬(wàn)農(nóng)民種植轉(zhuǎn)基因作物種植國(guó)家先后有30多個(gè)國(guó)家批準(zhǔn)了3000多例田間試驗(yàn)，涉及的植物種類有40多種；2000年有13個(gè)國(guó)家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物；2004年有17個(gè)國(guó)家種植商品化轉(zhuǎn)基因植物。（2004年）美國(guó)（59%），阿根廷（20%），加拿大（6%）中國(guó)（5%），歐洲5%2004年3月英國(guó)批準(zhǔn)大面積種植轉(zhuǎn)基因，但要求非常嚴(yán)格。2005年德國(guó)通過(guò)法案，嚴(yán)格限制（包括實(shí)驗(yàn)室研究）。轉(zhuǎn)基因育種與方法美國(guó)：3900萬(wàn)公頃加拿大：350萬(wàn)公頃阿根廷：1350萬(wàn)公頃中國(guó)：210萬(wàn)公頃轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因作物種類主要為大豆、玉米、棉花和油菜等，以轉(zhuǎn)基因大豆面積最大。根據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部（USDA）2011年6月30日發(fā)布的最新數(shù)據(jù)，按種植面積計(jì)算，美國(guó)種植的88%的玉米、90%的棉花、94%的大豆，都是轉(zhuǎn)基因品種。

目標(biāo)性狀抗除草劑，抗蟲(chóng)和抗病毒病轉(zhuǎn)基因育種與方法美國(guó)三大轉(zhuǎn)基因作物歷年種植面積轉(zhuǎn)基因育種與方法Firstbiotechplantproduct–Flav’rSav’rtomato轉(zhuǎn)基因育種與方法我國(guó)轉(zhuǎn)基因作物研究與利用概況

我國(guó)是世界上主要商品化種植轉(zhuǎn)基因作物的國(guó)家。自行培育的雙價(jià)轉(zhuǎn)基因煙草的抗病蟲(chóng)性達(dá)到60％，產(chǎn)量比對(duì)照增加15％，產(chǎn)值增加20％，1992年每畝增收200元，遺憾的是由于市場(chǎng)的原因現(xiàn)已不推廣。

到1999年我國(guó)已批準(zhǔn)中試的轉(zhuǎn)基因作物有48項(xiàng)：包括水稻、小麥、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、煙草、廣藿香等11種作物；主要目標(biāo)性狀是抗蟲(chóng)、抗病、耐鹽、抗凍、耐儲(chǔ)藏和抗衰老等。已批準(zhǔn)環(huán)境釋放的有49個(gè)品種，涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、甜椒、線辣椒、棉花、楊樹(shù)、煙草等10種作物。

轉(zhuǎn)基因育種與方法經(jīng)全國(guó)基因工程安全委員會(huì)批準(zhǔn)商品化生產(chǎn)的作物已有：我國(guó)自行研制開(kāi)發(fā)的抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因棉花（轉(zhuǎn)Bt及Bt+CpTI雙價(jià)抗蟲(chóng)棉）；

2004年種植轉(zhuǎn)基因棉花370萬(wàn)公頃，占棉花種植面積的50%

美國(guó)Monsanto公司開(kāi)發(fā)的Bt抗蟲(chóng)棉；延遲成熟期的轉(zhuǎn)基因番茄；抗黃瓜花葉病毒(CMV)轉(zhuǎn)基因番茄；抗CMV轉(zhuǎn)基因甜椒；轉(zhuǎn)查爾酮合酶（CHS）反義RNA基因矮牽牛；轉(zhuǎn)Bt毒蛋白基因的水稻轉(zhuǎn)ACC反義合成酶的水稻轉(zhuǎn)基因育種與方法由中國(guó)農(nóng)科院生物工程中心開(kāi)發(fā)的Bt棉對(duì)棉鈴蟲(chóng)有顯著的抗性。與對(duì)照相比減少農(nóng)藥用量80％，并減少用工150個(gè)/hm2，以上兩者可使每公頃節(jié)省1500元，Bt轉(zhuǎn)基因棉種深受棉農(nóng)的歡迎。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因技術(shù)簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)基因研究技術(shù)的中心環(huán)節(jié)即為DNA重組技術(shù)，其最終目的是將DNA片段轉(zhuǎn)入為一個(gè)生物體，從而使該生物體具有表現(xiàn)某種性狀。轉(zhuǎn)基因通過(guò)獲取基因、重組基因和表達(dá)基因等過(guò)程來(lái)實(shí)現(xiàn)。轉(zhuǎn)基因打破了物種的界限，使不同種的生物的遺傳物質(zhì)在分子水平上重新組合在一起，并且完全可以按照人的意志或目的，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物體的改造。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因的方法和原理1目的基因制備和載體系統(tǒng)2幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法3定點(diǎn)突變和受體系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因育種與方法基本步驟1.分離獲得目的基因；2.在體外進(jìn)行DNA重組，將外源DNA連接到能自我復(fù)制又帶有選擇標(biāo)記的載體上；3.將重組DNA轉(zhuǎn)移入受體細(xì)胞；4.篩選出含有目的DNA的受體細(xì)胞克??；轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404,EHA轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法目的基因制備和載體系統(tǒng)目的基因來(lái)源：基因組DNA分離、化學(xué)合成、PCR擴(kuò)增、cDNA文庫(kù)及DNA文庫(kù)中制得。載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、柯氏質(zhì)粒、YAC載體等工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、DNA聚合酶等轉(zhuǎn)基因育種與方法(一)目的基因的獲得根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類：根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克?。粡幕蚪MDNA或mRNA序列克隆基因。1.根據(jù)基因表達(dá)的產(chǎn)物—蛋白進(jìn)行基因克隆

主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子效率低未知基因及產(chǎn)物分離蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導(dǎo)核苷酸序列人工合成轉(zhuǎn)基因育種與方法2.從基因組DNA或mRNA序列克隆基因

(1)同源序列法(HomologyBasedCandidateGeneMethod)根據(jù)基因家族成員所編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中具有保守氨基酸序列的特點(diǎn)克隆基因家族未知成員。氨基酸序列比較設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增文庫(kù)篩選/RACE轉(zhuǎn)基因育種與方法

(2)表達(dá)序列標(biāo)簽EST是指能夠特異性標(biāo)記某個(gè)基因的部分序列，通常包含了該基因足夠的結(jié)構(gòu)信息區(qū)，可以與其它基因相區(qū)分。主要是通過(guò)cDNA的途徑獲得。獲得EST的途徑:大規(guī)模cDNA文庫(kù)測(cè)序各種mRNA水平的分析手段mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA文庫(kù)PCR差異顯示抑制消減雜交…ESTRACE/文庫(kù)篩選dbESTGenBank轉(zhuǎn)基因育種與方法(3)根據(jù)連鎖圖譜克隆目的基因

圖位克隆技術(shù)(Map-basedcloning)轉(zhuǎn)基因育種與方法MarkercM10.8aGenecbpBAC染色體步移亞克隆cDNA文庫(kù)篩選互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)精細(xì)定位染色體步移候選基因轉(zhuǎn)基因育種與方法(4)轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法

轉(zhuǎn)座子是染色體上一段可復(fù)制、移動(dòng)的DNA片段。當(dāng)轉(zhuǎn)座子插入到某個(gè)功能基因內(nèi)部時(shí)，就會(huì)引起該基因的失活，并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型；當(dāng)轉(zhuǎn)座子再次轉(zhuǎn)座或切離這一位點(diǎn)時(shí)，失活基因的功能又可得到恢復(fù)。目前應(yīng)用最為廣泛的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是Ac/Ds玉米轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。插入突變體篩選突變DNA文庫(kù)，PCR，RACE鑒定性狀遺傳分析轉(zhuǎn)座子DNA探針基因部分DNA探針篩選野生型DNA文庫(kù)，PCR，RACE完整目的基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因育種與方法(5)差異顯示法

在生物個(gè)體發(fā)育不同階段，或不同的組織與細(xì)胞中或不同環(huán)境下，基因表達(dá)差異。即不同基因有序的時(shí)空表達(dá)方式，叫做基因的差異表達(dá)。差異顯示PCR(differentialdisplay-PCR,DD-PCR)是指通過(guò)對(duì)來(lái)源特定組織類型的總mRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳，并找出待測(cè)組織和對(duì)照之間的特異擴(kuò)增條帶。葉mRNA根mRNA反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄PCR隨機(jī)引物+3’

錨定poly(t)引物PCRPAGE葉根轉(zhuǎn)基因育種與方法(6)cDNA微陣列,cDNA芯片cDNA序列（純樣）機(jī)器點(diǎn)樣在支持物,與熒光標(biāo)記的不同mRNA樣品分別進(jìn)行雜交,通過(guò)激光共聚焦掃描分析不同cDNA序列的雜交信號(hào)強(qiáng)度,判斷該cDNA在不同mRNA樣品中的表達(dá)豐度.mRNA1mRNA2轉(zhuǎn)基因育種與方法(6)電子克隆insilicocloning

借助于電子計(jì)算機(jī)，利用公布的核酸序列資料，進(jìn)行序列的拼接和組裝最終獲得完整基因序列的技術(shù)，類似于cDNA文庫(kù)的篩選但更加方便和快速。轉(zhuǎn)基因育種與方法PCR反應(yīng)PCR技術(shù)就是在體外通過(guò)酶促反應(yīng)或自發(fā)地?cái)U(kuò)增一段目的基因的技術(shù)。PCR要求反應(yīng)體系具有以下條件：1、要有與被分離的目的基因兩條鏈各一端序列相互補(bǔ)的DNA引物(約20個(gè)堿基左右)；2、具有熱穩(wěn)定性的酶如TaqDNA聚合酶；3、4種dNTP；4、作為模板的目的DNA序列。PCR反應(yīng)可擴(kuò)增出100～5000bp的目的基因。轉(zhuǎn)基因育種與方法PCR反應(yīng)過(guò)程1、變性，即將模板DNA置于95℃的高溫下，使雙鏈DNA的雙鏈解開(kāi)變成單鏈DNA；2、退火，將反應(yīng)體系的溫度降低至55℃左右，使得一對(duì)引物分別與變性后的兩條模板鏈相配對(duì)；3、延伸，將反應(yīng)體系溫度調(diào)整到TaqDNA聚合酶作用的最適溫度72℃，然后以目的基因?yàn)槟０?，合成新的DNA鏈。反復(fù)進(jìn)行約30個(gè)循環(huán)左右，即可擴(kuò)增得到目的DNA序列。轉(zhuǎn)基因育種與方法利用cDNA法由于真核生物的mRNA具有polyA這一結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以用結(jié)合長(zhǎng)度大約為15bp的短鏈多聚DT的纖維素填充的柱子，根據(jù)堿基配對(duì)原則，將其吸附，從真核細(xì)胞的總RNA中提取出來(lái)，再用能打斷A-T氫鍵的緩沖液洗脫。在mRNA群體中，有高豐度的mRNA，拷貝數(shù)多；也有低豐度的mRNA，但種類多，高豐度的mRNA容易合成cDNA。要保證構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中要含有目的克隆，可利用瓊脂糖凝膠電泳、非變性蔗糖梯度離心和羥甲基蔗糖剃度離心等分級(jí)分離不同長(zhǎng)度的mRNA，也可以利用cDNA的大小分級(jí)分離。轉(zhuǎn)基因育種與方法cDNA鏈的合成得到純化的mRNA后，再利用逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶I，緩沖液和4種脫氧核糖核苷三磷酸及短的digo（dT）分子作為引物，合成cDNA。這些cDNA是由該種生物的各種mRNA分子逆轉(zhuǎn)錄得到的，因此是混合物，它們可以通過(guò)末端連接或是加入銜接物等其它方法克隆進(jìn)入質(zhì)粒載體，形成cDNA文庫(kù)。然后，采用DNA雜交或免疫分析的方法來(lái)篩選目的基因轉(zhuǎn)基因育種與方法（二）目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建

目的基因體外重組到適當(dāng)?shù)囊迅脑斓馁|(zhì)粒中包括保存用中間載體（大腸桿菌寄主）：pBR322、pUC、pBluescriptK、pKS,pGEM-T

繁殖載體（大腸桿菌寄主）：JM109,TOP10

植物轉(zhuǎn)化載體（農(nóng)桿菌寄主）：pBI121,pCAM1001轉(zhuǎn)基因育種與方法質(zhì)粒載體質(zhì)粒（plasmid）是能自我復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們?cè)诩?xì)菌中以獨(dú)立于染色體外的方式存在。每個(gè)質(zhì)粒都有一段DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的序列，它能幫助質(zhì)粒DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制。高拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中能達(dá)10～100個(gè)拷貝；低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞中只有1－4個(gè)拷貝。質(zhì)粒要成為克隆載體，就必須進(jìn)行遺傳改造，使之成為一個(gè)具有單一的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)、多個(gè)選擇性標(biāo)記。轉(zhuǎn)基因育種與方法質(zhì)粒載體pBR3221.大小為4361bp，含有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素這樣兩個(gè)抗生素抗性基因2.在四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，還具有BamHI、HindⅢ和SalI三個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。3.PstI識(shí)別位點(diǎn)在氨芐青霉素抗性基4.pBR322帶有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒只在大腸桿菌里進(jìn)行復(fù)制功能。轉(zhuǎn)基因育種與方法pUC19質(zhì)粒長(zhǎng)2686bp，帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)，一個(gè)氨芐青霉素抗性基因和一個(gè)大腸桿菌乳糖操縱子β－半乳糖苷酶基因（lacZ’）的調(diào)節(jié)片段，一個(gè)調(diào)節(jié)lacZ’基因表達(dá)的阻礙蛋白的基因lacI，還有多個(gè)單克隆位點(diǎn)。pUC19的篩選將轉(zhuǎn)化細(xì)胞涂布到含有氨芐青霉素、IPTG和X－gal的固體培養(yǎng)基上，那些帶有自身環(huán)化質(zhì)粒的細(xì)胞由于能夠形成具活性的β－半乳糖苷酶，所以菌落是藍(lán)色，如果插入有目的DNA片段，無(wú)法形成雜合β－半乳糖苷酶，菌落時(shí)白色的。轉(zhuǎn)基因育種與方法λ噬菌體λ噬菌體染色體是長(zhǎng)約49kb的雙鏈DNA，該DNA的兩個(gè)5’末端都是由12個(gè)bp組成的單鏈互補(bǔ)粘性末端，當(dāng)λ噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，這兩個(gè)粘性末端互相結(jié)合，在連接酶作用下封閉成環(huán)在λ噬菌體基因組中位于左邊的基因（A-J）編碼噬菌體頭部和尾部的蛋白質(zhì)，中間的基因（J-N）與重組和生長(zhǎng)過(guò)程有關(guān)，但與裂解生長(zhǎng)過(guò)程無(wú)關(guān)，因此對(duì)裂解生長(zhǎng)過(guò)程來(lái)說(shuō)，中間區(qū)的DNA是非必需的，可以被缺失或置換，因此可以在這個(gè)區(qū)域克隆外源DNA，右邊的基因涉及λ基因的表達(dá)、調(diào)節(jié)、DNA合成晚期功能調(diào)節(jié)以及宿主細(xì)胞裂解等。轉(zhuǎn)基因育種與方法λ噬菌體載體分類：插入型載體和置換型載體。插入型載體：具有單一的酶切位點(diǎn)，可供外源DNA的插入。置換型載體：有成對(duì)的酶切位點(diǎn)，在兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間的DNA片段，可被外源DNA片段置換。λ噬菌體載體可以克隆較大DNA片段，最大長(zhǎng)度約為24kb，只需將λ噬菌體DNA、尾巴和純化的空的頭，混在一起就可以在體外產(chǎn)生具有侵染性的噬菌體顆粒。轉(zhuǎn)基因育種與方法柯氏質(zhì)粒Cosmid柯氏質(zhì)?？煽寺y帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)點(diǎn)?？率腺|(zhì)粒上帶有多個(gè)單克隆位（RE2），兩個(gè)cos位點(diǎn)，DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個(gè)cos位點(diǎn)之間還有一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（RE1）。轉(zhuǎn)基因育種與方法分離基因克隆到某中間載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌提取質(zhì)粒限制酶切/連接克隆到植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌基因槍轉(zhuǎn)化pKS,pBR332,pGEM-TJM109,TOP10…HindIII/EcroI…T4ligasepBI121,pCAM1001…LBA4404,EHA轉(zhuǎn)基因育種與方法幾種有效的轉(zhuǎn)基因方法概括起來(lái)說(shuō)主要有兩類：第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法?；蜣D(zhuǎn)移（transgenosis）是借助于物理、化學(xué)或生物的手段將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并檢查其在該細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況的一種技術(shù)，是細(xì)胞工程中一項(xiàng)重要而應(yīng)用廣泛的技術(shù)。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。細(xì)胞直接攝取外源DNA的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化（transformation），如果通過(guò)噬菌體的釋放和感染將DNA從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的過(guò)程，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因技術(shù)動(dòng)物

TransgenicAnimal1976年Jaenisch等獲得含有SV40DNA的嵌合體小鼠。1980年，Gordon應(yīng)用顯微注射法首次成功地將重組的外源DNA直接注入小鼠受精卵雄原核中，獲得了攜帶外源基因小鼠。1982，Palmiter將大鼠的生長(zhǎng)激素基因用微注射方法導(dǎo)入小鼠的受精卵中獲得巨型小鼠（supermouse），從而在理論上和實(shí)踐意義上都將轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高一步，引起生物學(xué)界極大的關(guān)注，為基因工程育種提供誘人的前景。早期以提高生長(zhǎng)為主，以生產(chǎn)藥用蛋白和可移植的器官轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法談家楨院士（左）、著名老中醫(yī)徐蔚霖教授（右），曾溢滔院士（中），轉(zhuǎn)基因試管?！疤咸稀鞭D(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因熊貓狗轉(zhuǎn)基因育種與方法動(dòng)物轉(zhuǎn)基因的方法1.細(xì)胞融合<10－62.微細(xì)胞介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≤10－63.染色體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移<10－6

4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移≈2×10－4

5.磷酸鈣沉淀物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10－3－10－7

6.顯微注射DNA≈1－10％7.電脈沖介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～30％8.激光，超聲波介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移10～50％9.重組RNA病毒感染≈10～100％10.重組DNA病毒感染≈100％轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微注射DNA顯微注射DNA一般是用微吸管加DNA溶液在顯微鏡下準(zhǔn)確地插入受體細(xì)胞核中，并將DNA注射進(jìn)去的方法，在動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)移中較常使用?，F(xiàn)在，多利用顯微鏡操作器在相差顯微鏡下進(jìn)行操作。每個(gè)細(xì)胞的注射量約為10－11ml，熟練的操作者每10分鐘可注射200個(gè)細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微操作儀轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微操作儀的使用顯微操作儀使用杠桿操作而移動(dòng)，它能靠杠桿操作把微吸管的先端在顯微鏡的視野中作平面移動(dòng)。上下的運(yùn)動(dòng)靠設(shè)在顯微操縱儀支柱上的上下微動(dòng)，粗動(dòng)調(diào)節(jié)裝置進(jìn)行。它與顯微鏡牢固地連接起來(lái)。右側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡本體上，左側(cè)的顯微操作儀是裝在顯微鏡的機(jī)械臺(tái)上，隨機(jī)械臺(tái)的移動(dòng)而移動(dòng)，一般在進(jìn)行操作時(shí)，先將平皿放置在顯微注射儀上，移動(dòng)載物臺(tái)，把視野移到細(xì)胞處，先用緩慢移

動(dòng)顯微操縱儀上固定細(xì)胞的微吸管，同時(shí)使注射器緩慢減壓，吸引目標(biāo)受精卵并固定之，再用另一側(cè)顯微操縱儀移動(dòng)微注射針，對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞核刺入，導(dǎo)入目的基因，完成顯微注射。轉(zhuǎn)基因育種與方法顯微注射法的優(yōu)點(diǎn)1）轉(zhuǎn)化率高達(dá)20％，特別是在沒(méi)有合適的DNA載體系統(tǒng)時(shí)更有價(jià)值；2）對(duì)各種受體細(xì)胞均適用，從體細(xì)胞、淋巴細(xì)胞到受精卵；3）對(duì)轉(zhuǎn)移物質(zhì)沒(méi)有限制，可以是DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒、代謝物或代謝底物以至細(xì)胞器、染色體、細(xì)胞核；4）可以控制轉(zhuǎn)移的量和轉(zhuǎn)移物的濃度；5）可選擇受體細(xì)胞的核的接受位點(diǎn)，可研究物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)，區(qū)隔化和依賴區(qū)隔的修飾；6）受體不用特殊的選擇系統(tǒng)；7）要求的樣品量少，2ml樣品足夠作顯微注射；8）實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞可以化同樣的條件下比較。但也有缺點(diǎn)，如設(shè)備和技術(shù)的要求較高，一次處理細(xì)胞數(shù)量不能太多，對(duì)細(xì)胞有損傷轉(zhuǎn)基因育種與方法2）逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)法轉(zhuǎn)基因育種與方法3）胚胎干細(xì)胞法轉(zhuǎn)基因育種與方法4）精子載體法意大利Lavitrano等1989年首次報(bào)道利用精子作為載體獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠。轉(zhuǎn)基因育種與方法5）細(xì)胞核移植法277次乳腺細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)；獲得29個(gè)發(fā)育為8細(xì)胞的“胚”；13頭代孕母親；1996年7月5日，羊羔6LL3，被命名為“多莉”。轉(zhuǎn)基因育種與方法6）生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)基因育種與方法DNA-磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀反應(yīng)是將外源DNA轉(zhuǎn)移并整合到細(xì)胞株中去的最常用方法，主要用于將基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞。由于核酸以磷酸鈣－DNA共沉淀物的形式存在，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)DNA的吸收會(huì)大大提高，細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用，使DNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并轉(zhuǎn)移整合到細(xì)胞核內(nèi)的染色體內(nèi)。一般是將DNA與CaCl2溶液混合后，同時(shí)加入HEPES緩沖的鹽溶液（HeBS）混合，靜置后形成DNA－磷酸鈣沉淀物，然后用來(lái)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。這個(gè)過(guò)程中，pH值、Ca2＋濃度等都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染的效率有所影響。方法簡(jiǎn)單，效率較高，可達(dá)培養(yǎng)細(xì)胞的20％，但缺點(diǎn)是受體細(xì)胞有限。轉(zhuǎn)基因育種與方法脂質(zhì)體（liposome）介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移脂質(zhì)體是一種內(nèi)部包裝DNA的球狀磷脂雙分層膜結(jié)構(gòu)，能與細(xì)胞膜融合將DNA送入細(xì)胞的。用脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染各種不同的類型的真核細(xì)胞的方法具有較高的轉(zhuǎn)化效率和可重復(fù)性。脂質(zhì)體制備的基本方法是以一定比例稱取磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸，放于氯仿中之后加入待轉(zhuǎn)移的DNA分子制成懸液，經(jīng)超聲化處理后，即形成包含DNA分子的脂質(zhì)體，然后與培養(yǎng)細(xì)胞作用2小時(shí)左右，就可望實(shí)現(xiàn)DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染率受脂質(zhì)體的組成及理化性質(zhì)的影響。脂質(zhì)體可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)和體外的瞬時(shí)穩(wěn)定表達(dá)。轉(zhuǎn)基因育種與方法基因槍介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移

基因槍法最早是由美國(guó)康奈爾大學(xué)的Sanford最先提出的。它通過(guò)高速飛行的金屬顆粒將包被其外的目的基因直接導(dǎo)入到受體細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的方法。1992年，世界首例轉(zhuǎn)基因小鼠就是通過(guò)該法獲得的。轉(zhuǎn)基因育種與方法基因槍轉(zhuǎn)化的原理轉(zhuǎn)基因育種與方法(2)基因槍轟擊法（微彈轟擊技術(shù)micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動(dòng)力射入受體細(xì)胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達(dá)。步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹(shù)花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法決定基因槍使用成功的因素第一因素是動(dòng)力系統(tǒng)。根據(jù)動(dòng)力系統(tǒng)，基因槍分為三大類：一類是以火藥爆炸力作為動(dòng)力加速微彈；第二類是以電弧放電蒸發(fā)浪作為動(dòng)力；第三類是以高壓氣體作為動(dòng)力。第二因素是微彈的制備過(guò)程。用的微載體有兩類：一是鎢粉，另一個(gè)是金粉，直徑一般為0.6－4μm。常用的將DNA包被到微載體上所用的沉淀試劑有亞精胺、氯化鈣、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等。第三個(gè)因素是受體材料的選擇。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因植物方法第一類是以載體為媒介的遺傳轉(zhuǎn)化，也稱為間接轉(zhuǎn)移系統(tǒng)法。第二類是外源目的DNA的直接轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)基因育種與方法1.載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因方法。將外源基因重組進(jìn)入適合的載體系統(tǒng)，通過(guò)載體將攜帶的外源基因?qū)胫参锛?xì)胞，整合在核染色體組中并隨核染色體復(fù)制和表達(dá)。農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒（tumor-inducingplasmid）或Ri質(zhì)粒(root-indcing

plasmid)介導(dǎo)法是迄今為止植物基因工程中應(yīng)用最多、機(jī)理最清楚、最理想的載體轉(zhuǎn)移方法。轉(zhuǎn)基因育種與方法農(nóng)桿菌與植物細(xì)胞相互作用的機(jī)制

轉(zhuǎn)基因育種與方法土壤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)基因育種與方法農(nóng)桿菌:usedextensivelyforgeneticengineeringofplants.包含Ti質(zhì)粒

Tumorinducingplasmid(bacterialplasmid)T-DNA(Transferred-DNA),

可以轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物基因組.TumorinducedbyA.tumefaciens轉(zhuǎn)基因育種與方法TiPlasmidT-DNAregionLeftborderRightbordervirgenesori已知農(nóng)桿菌附著到植物細(xì)胞后，只留在細(xì)胞間隙中。T-DNA首先在細(xì)菌中被加工、剪切、復(fù)制，然后轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。auxin轉(zhuǎn)基因育種與方法Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為95～156×106D,約有200kb組成。根據(jù)其誘導(dǎo)的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚(yú)堿型(octopine)胭脂堿型(nopaline)農(nóng)桿堿型（agropine）農(nóng)桿菌素堿型（agrocinopine）或稱琥珀堿型(succinamopine)Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型轉(zhuǎn)基因育種與方法Ti質(zhì)粒的功能區(qū)域

（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）：

農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來(lái)轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，稱為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）

該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）

該區(qū)段上存在著與細(xì)菌接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）

該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。轉(zhuǎn)基因育種與方法2.外源基因直接導(dǎo)入法（1）化學(xué)刺激法細(xì)胞融合劑：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）轉(zhuǎn)基因育種與方法(2)基因槍轟擊法

（微彈轟擊技術(shù)micro-projectilebombardment)將外源DNA包裹在微小的鎢粉或金粉顆粒的表面，借助高壓動(dòng)力射入受體細(xì)胞或組織，最后整合到植物基因組并得以表達(dá)。步驟簡(jiǎn)單易行：適合于大多數(shù)細(xì)胞或組織，克服了受體材料的限制，不必制備原生質(zhì)體，具有相當(dāng)廣泛的應(yīng)用范圍，已經(jīng)成為植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化最有效方法之一。到目前為止，利用基因槍法已經(jīng)在煙草、豆類和多數(shù)禾本科農(nóng)作物、果樹(shù)花卉和林木等植物上獲得轉(zhuǎn)基因植株。單子葉植物轉(zhuǎn)基因育種與方法1.Pericarpsholudbepulledbackandtheimmatureembryos(0.5-1.0mm)areremoved.2.TheimmatureembryosareplacedonacallusinductionmediumhighosmoticmediapreparecallifortransfomationTransformationisperformedbygenegunmethod轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法(3)微注射法

細(xì)胞操作：利用瓊脂糖包埋、聚賴氨酸粘連和微吸管吸附等方式將受體細(xì)胞（原生質(zhì)體或生殖細(xì)胞）固定，然后將供體DNA或RNA直接注射進(jìn)入受體細(xì)胞。子房注射法或花粉管通道法：具有較大子房或胚囊的植株可在田間進(jìn)行活體操作。操作簡(jiǎn)便、成本低。轉(zhuǎn)基因育種與方法（五）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定1.轉(zhuǎn)化體的篩選外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低目的基因已被整合到核基因組并表達(dá)轉(zhuǎn)化細(xì)胞更少使用特異性選擇標(biāo)記基因（selectablemarkergenes）進(jìn)行標(biāo)記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細(xì)胞。常用選擇標(biāo)記基因：抗生素抗性基因除草劑抗性基因?qū)⑦x擇標(biāo)記基因與適當(dāng)啟動(dòng)子構(gòu)成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。標(biāo)記基因在受體細(xì)胞表達(dá)，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞具有抵抗相應(yīng)抗生素或除草劑的能力而存活下來(lái)。非轉(zhuǎn)化細(xì)胞則被抑制、殺死。轉(zhuǎn)基因育種與方法載體構(gòu)建中常用的選擇標(biāo)記

如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體同樣是一個(gè)重要問(wèn)題?？茖W(xué)家家一直試圖把轉(zhuǎn)化體帶上一個(gè)標(biāo)記，從而便于選擇和篩選。至今己建立了許多標(biāo)記基因，并已插入各種轉(zhuǎn)化載體中，作為一種標(biāo)記基因。轉(zhuǎn)基因育種與方法作為標(biāo)記基因，必須具備以下四個(gè)條件：①編碼一種不存在于正常植物細(xì)胞中的酶；②基因較小，可構(gòu)成嵌合基因；③能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達(dá)；④檢測(cè)容易，并且能定量分析。細(xì)菌篩選標(biāo)記基因：產(chǎn)物給予細(xì)胞產(chǎn)生一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細(xì)胞不能生長(zhǎng)、發(fā)育與分化。而轉(zhuǎn)化細(xì)胞對(duì)該標(biāo)記產(chǎn)生抗性，不影響其生長(zhǎng)等，從而將轉(zhuǎn)化細(xì)胞選擇出來(lái)，例如，Cat（氯霉抗性基因）。植物篩選標(biāo)記基因：強(qiáng)調(diào)給轉(zhuǎn)化細(xì)胞帶上一種標(biāo)記，起報(bào)告和識(shí)別作用，故稱報(bào)告基因。轉(zhuǎn)基因育種與方法報(bào)告基因:

Gus基因（β-葡糖苷酸酶基因）在植物細(xì)胞中所產(chǎn)生的葡糖苷酸酶在檢測(cè)上具有以下特點(diǎn)：①在一定條件下與X-G1ucuionicacid（5-bromo-4-chioro-3-indoyl-β-D-glucuronicacid）底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，既可以用分光光度計(jì)法測(cè)定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍(lán)色斑點(diǎn)。②當(dāng)加入4-甲基傘形酮基和葡萄糖苷酸時(shí)生成4-甲基傘形酮，發(fā)熒光（λ=465nm）。因而可以用熒光光譜法測(cè)定。由于熒光強(qiáng)度高，本底低，故熒光檢測(cè)極為靈敏。③檢測(cè)容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時(shí)間內(nèi)測(cè)定完畢。④價(jià)格便宜。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法GFP（綠色熒光蛋白基因）;

LUC(螢火蟲(chóng)熒光素酶基因);報(bào)告基因:轉(zhuǎn)基因育種與方法表達(dá)熒光的轉(zhuǎn)基因魚(yú)轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)基因育種與方法啟動(dòng)子的選擇35S,cauliflowermosaicvirus35Spromoter

CaMV35S

isastrongpromoterthatisactiveinessentiallyalldicotplanttissues.

轉(zhuǎn)基因育種與方法(三〕受體材料的選擇

受體是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應(yīng)滿足如下條件：1、高效穩(wěn)定的再生能力；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來(lái)源方便，如胚和其它器官等；4、對(duì)篩選劑敏感；5、轉(zhuǎn)化率高轉(zhuǎn)基因育種與方法常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過(guò)脫分化培養(yǎng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點(diǎn)：外植體來(lái)源廣，繁殖快，易接受外源基因，轉(zhuǎn)化效率高。缺點(diǎn)：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因育種與方法2.直接分化再生系統(tǒng)

外植體材料細(xì)胞不經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。優(yōu)點(diǎn)：周期短、操作簡(jiǎn)單，體細(xì)胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點(diǎn)：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復(fù)細(xì)胞壁具有分化再生能力，是應(yīng)用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點(diǎn)：高效、廣泛地?cái)z取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得基因型一致的克隆細(xì)胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點(diǎn)：不易制備、再生困難和變異程度高。轉(zhuǎn)基因育種與方法4.胚狀體再生系統(tǒng)是指具有胚胎性質(zhì)的個(gè)體。優(yōu)點(diǎn)：個(gè)體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力強(qiáng)，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點(diǎn)：技術(shù)含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。5.生殖細(xì)胞受體系統(tǒng)以生殖細(xì)胞如花粉粒、卵細(xì)胞等受體細(xì)胞進(jìn)行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行小孢子和卵細(xì)胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細(xì)胞受精過(guò)程進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導(dǎo)入法，花粉粒浸泡法，子房微針注射法等。轉(zhuǎn)基因育種與方法轉(zhuǎn)化體的鑒定

通過(guò)篩選得到的再生植株初步證明標(biāo)記基因整合進(jìn)入受體細(xì)胞。至于目的基因是否整合到受體核基因組、是否表達(dá)，還必須對(duì)抗性植株進(jìn)一步檢測(cè)。DNA水平的鑒定

檢測(cè)內(nèi)容：是否整合、拷貝數(shù)、整合位置。檢測(cè)方法：特異性PCR（以外源基因兩側(cè)序列設(shè)計(jì)引物）

Southern雜交（外源目的基因序列為探針）轉(zhuǎn)基因育種與方法特異性PCR檢測(cè)外源基因整合到受體轉(zhuǎn)基因育種與方法(2)轉(zhuǎn)錄水平的鑒定常用的方法Northern雜交（標(biāo)記的RNA為探針對(duì)總RNA雜交）RT-PCR檢測(cè)mRNAcDNAPCR轉(zhuǎn)基因育種與方法（3）翻譯水平的鑒定為檢測(cè)外源基因轉(zhuǎn)錄形成的mRNA能否翻譯，還必須進(jìn)行翻譯或者蛋白質(zhì)水平檢測(cè)。主要方法：Western雜交免疫檢測(cè)轉(zhuǎn)基因育種與方法（六）轉(zhuǎn)化體的安全性評(píng)價(jià)和育種利用根據(jù)有關(guān)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的管理規(guī)定、在可控制的條件下進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)和大田育種利用研究。通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法往往難以直接獲得理想的品種（系）原因：外源基因失活、純合致死、花粉致死、其它性狀變化等。因此獲得轉(zhuǎn)化體后，應(yīng)結(jié)合雜交、回交、自交等常規(guī)轉(zhuǎn)育手段，最終選育綜合性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因品種。轉(zhuǎn)基因育種與方法第三節(jié)轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性轉(zhuǎn)基因育種與方法

直至今天，轉(zhuǎn)基因作物的安全性在全球范圍內(nèi)引起了激烈的爭(zhēng)論。反對(duì)者認(rèn)為轉(zhuǎn)基因作物具有極大的潛在危險(xiǎn)，可能會(huì)對(duì)人類健康和人類生存環(huán)境造成威脅。在歐洲，轉(zhuǎn)基因作物被一些媒體稱之為“惡魔食品”（frankensteinfood）。Frankenstein是英國(guó)科幻小說(shuō)中由一個(gè)科學(xué)家創(chuàng)造、最終又毀滅了這個(gè)科學(xué)家的怪物。那么，人類研制與種植轉(zhuǎn)基因作物到底是毀滅自己，還是拯救自己呢？

轉(zhuǎn)基因育種與方法對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的安全性爭(zhēng)論，國(guó)際上有幾個(gè)典型的事件。

Pusztai事件：英國(guó)Rowett研究所有位Pusztai博士，他用轉(zhuǎn)雪花蓮凝集素基因的土豆喂大鼠，1998年秋天在英國(guó)電視臺(tái)發(fā)表講話，聲稱大鼠食用了這種土豆后，體重和器官重量減輕，免疫系統(tǒng)受到了破壞。后果：綠色和平組織、地球之友等反生物技術(shù)組織把這種土豆說(shuō)成“殺手”，并策劃了破壞轉(zhuǎn)基因作物試驗(yàn)地等行動(dòng)，焚燒了印度的兩塊試驗(yàn)田，甚至美國(guó)加州大學(xué)戴維斯分校的非轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)材料也遭破壞，以致研究生畢業(yè)論文都無(wú)法如期完成。英國(guó)皇家學(xué)會(huì)組織了同行評(píng)審，并于1999年５月發(fā)表評(píng)論，指出Pusztai的試驗(yàn)有六方面的錯(cuò)誤：不能確定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的化學(xué)成分有差異；對(duì)食用轉(zhuǎn)基因土豆的大鼠，未補(bǔ)充蛋白質(zhì)以防止饑餓；供試動(dòng)物數(shù)量少，飼喂幾種不同的食物，且都不是大鼠的標(biāo)準(zhǔn)食物，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；試驗(yàn)設(shè)計(jì)差；統(tǒng)計(jì)方法不當(dāng)；試驗(yàn)結(jié)果無(wú)一致性等。轉(zhuǎn)基因育種與方法

斑蝶事件：

1999年5月，康奈爾大學(xué)的一個(gè)研究組在《Nature》雜志上發(fā)表文章，聲稱轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)玉米的花粉飄到一種名叫“馬利筋”的雜草上，用馬利筋葉片飼喂美國(guó)大斑蝶，導(dǎo)致44％的幼蟲(chóng)死亡。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果在科學(xué)上沒(méi)有說(shuō)服力：玉米的花粉非常重，擴(kuò)散不遠(yuǎn)，在玉米地以外５米，馬利