分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-質(zhì)粒的提取和酶切鑒定

Theextractionand

endonucleasecleavageofplasmid

質(zhì)粒的提取和酶切鑒定

huangchunhong

掌握質(zhì)粒DNA提取的原理與方法

了解DNA限制性核酸內(nèi)切酶酶切鑒定原理

質(zhì)粒為環(huán)狀雙鏈DNA，它是染色體DNA之外的單獨(dú)復(fù)制單元。質(zhì)粒一般存在于細(xì)菌細(xì)胞中，并常用于DNA重組，用于外源基因的克隆和表達(dá)。質(zhì)粒的分類與構(gòu)成克隆載體；表達(dá)載體原核質(zhì)粒；真核質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)成-復(fù)制起始位點(diǎn)-多克隆位點(diǎn)（含多個(gè)內(nèi)切酶位點(diǎn)，用于外源基因插入）-選擇性標(biāo)記（抗性基因）

1.氨芐青霉素抗性，新霉素抗性。2.多克隆位點(diǎn)C端含有myc表位標(biāo)簽和His6標(biāo)簽。Myc標(biāo)簽和His6標(biāo)簽與外源蛋白融合表達(dá)，可以用以親和層析分離和westernblot3.Pcmv巨細(xì)胞皰疹病毒啟動(dòng)子4.BGHpA,牛生長(zhǎng)因子polyA5.SV40猴空泡病毒SV40pA猴空泡病毒polyA7.核糖體結(jié)合位點(diǎn)：5300-5304bp6.pUCori復(fù)制起始位點(diǎn)f1ori噬菌體復(fù)制位點(diǎn)，能產(chǎn)生單鏈DNA，可用于測(cè)序

T7啟動(dòng)子，比大腸桿菌RNA聚合酶啟動(dòng)子強(qiáng)5倍pCDNA3.1/myc-His-IFT57重組質(zhì)粒:6475bppCDNA3.1/myc-His：5497bp(講義上錯(cuò)誤)IFT57基因（intraflagellartransport57，鞭毛內(nèi)運(yùn)輸?shù)鞍?：1270bp酶切位點(diǎn)：BamHI:G^GATCC920bpEcoRI:G^AATTC941bp質(zhì)粒提?。簤A裂解法

基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。染色體DNA：氫鍵斷裂變性。質(zhì)粒DNA：大部分氫鍵斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離。（不完全變性）質(zhì)粒DNA：復(fù)性，溶于溶液中染色體DNA：不能復(fù)性；形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。pH=12.6（堿性）

NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來離心溶菌酶可破壞菌體細(xì)胞壁，十二烷基硫酸鈉（Sodiumdodecylsulfate,SDS）可使細(xì)胞壁裂解。細(xì)菌經(jīng)溶菌酶和陰離子去污劑（SDS）處理后，細(xì)菌DNA纏繞附著在細(xì)胞壁碎片上，離心時(shí)易被沉淀出來，而質(zhì)粒DNA則留在上清液中。再經(jīng)酒精沉淀、洗滌處理，可得到質(zhì)粒DNA。提取的質(zhì)粒可有三種結(jié)構(gòu)：線形、開環(huán)、閉環(huán)超螺旋。溶液Ⅰ—溶菌液：50mM葡萄糖，25mMTris-Cl(pH8.0)，10mMEDTA，2mg/ml溶菌酶。溶液Ⅱ—NaOH-SDS液：0.2NNaOH，1%SDS。溶液Ⅲ—3mol/LNaAc（pH4.8）溶液：5MKAC10ml，冰醋酸11.5ml，水28.5ml。質(zhì)粒抽提：即去除RNA，將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組DNA分開，去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)，以得到相對(duì)純凈的質(zhì)粒。如何去除RNA

使用RNase消化(抽提中或者抽提后)。經(jīng)過RNase消化后，RNA變得比較小了，其殘留對(duì)酶切反應(yīng)幾乎沒有影響。Theprinciplesofplasmidextraction如何將質(zhì)粒與細(xì)菌基因組DNA分開

利用NaOH/SDS完全裂解細(xì)菌，讓質(zhì)粒和細(xì)菌基因組DNA都從細(xì)菌中出來，再利用質(zhì)粒和基因組DNA在變性/復(fù)性過程中的不同表現(xiàn)，將質(zhì)粒與基因組DNA分開。去除蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)

基本上是與去除細(xì)菌基因組同時(shí)實(shí)現(xiàn)的。但是，依據(jù)不同的細(xì)菌，不同的培養(yǎng)條件，以及操作時(shí)的精細(xì)程度等，雜質(zhì)的殘留量會(huì)不同。所以，通常需要使用苯酚做更進(jìn)一步的純化。提取步驟10000g離心1min1.5ml菌液重復(fù)3次沉淀250ulP1吹打250ulP2350ulP3溶液清亮粘稠白色沉淀12000g離心10min上清500ul平衡液BL12000g離心1minCP3柱600ulPW12000g離心1min重復(fù)1次PWCP3柱開蓋2-5min50ulEB靜置2min12000g離心2minpcDNA3.1/myc-His質(zhì)粒的提?。A(yù)先過夜搖好菌液）1、吸取1.5ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌于Ep管中，10,000rpm離心1分鐘，小心吸棄上清重復(fù)兩次操作，共獲得4.5ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌。2、加入250ul溶液P1（含RNaseA）于Ep管中，移液槍吹打懸浮細(xì)菌。3、加入250ul溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)混合6次（2-5分鐘）。4、加入350ul溶液P3，輕輕混合6次，室溫靜置2分鐘。5、12,000rpm離心10分鐘，小心吸取上清加入吸附柱中。(可選步驟：吸附柱實(shí)驗(yàn)前加500ulBL平衡液，12,000rpm離心1分鐘后倒棄收集管內(nèi)液體)pcDNA3.1/myc-His質(zhì)粒的提取（預(yù)先過夜搖好菌液）6、12,000rpm離心1分鐘，棄流出液。7、加入600ul溶液PW，12,000rpm離心1分鐘，棄流出液。(重復(fù)1次)8、12,000rpm離心2分鐘，徹底去除殘留的PW。9、將吸附柱置于一干凈的1.5mlEp管中，在柱的中央加入30-50ulEB（pH>7.0），室溫靜置1分鐘。（EB在60-70℃水浴預(yù)熱，使用效果更好10、10,000rpm離心1分鐘，洗脫質(zhì)粒DNA待用。TheconcentrationandpurityofPlasmidPlasmid/dsDNA:1OD260=50ug/ml

100%DNA:OD260/OD280=1.8100%RNA:OD260/OD280=2.0Question:

OD260/OD280<1.8?OD260/OD280>1.8?DL5KbMarkerABCA:cleavageplasmid5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bpPlasmidconformationvariationleadstodifferentmigrationB:linearplasmidC:superhelixplasmid反應(yīng)物

體積（μl)bufferMC2質(zhì)粒DNA15.8(μl)BamHI1EcoRI1BSA0.2在一個(gè)潔凈的0.2ml離心管中混勻下列反應(yīng)物：

混合后37℃水浴1h質(zhì)粒DNA的酶切分析操作三

、瓊脂糖凝膠電泳膠濃度（％）線性DNA分子大?。╧b）0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.4～61.50.2～42.00.1～3本次電泳使用1.0%瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠濃度與DNA分子的有效分離范圍MarkerABCD6000bp5000bp2000bp1000bp750bp

AgarosegelelectrophoresisidentificationBamHIEcoRIpcDNA3.1/myc-HisA5.5kbInsertfragment:1270bp瓊脂糖凝膠電泳上樣1：DNAMarker（10

l）2：提取的質(zhì)粒DNA（10

l）3：質(zhì)粒DNA酶切產(chǎn)物（20

l）+-1234每組上2個(gè)樣品LoadingBuffer

上樣緩沖液EDTA甘油……………增大溶液密度溴酚藍(lán)…………指示劑二甲苯胺藍(lán)……指示劑組成0.5TBE,