淡水生物監(jiān)測(cè) 環(huán)境DNA定量PCR法（征求意見(jiàn)稿）

1淡水生物監(jiān)測(cè)環(huán)境DNA定量PCR法GB/T19495.5-2018轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)紿J710.8生物多樣性觀(guān)測(cè)技術(shù)導(dǎo)則淡水底棲大型無(wú)脊椎動(dòng)物SN/T4278—2015國(guó)境口岸醫(yī)學(xué)媒介昆蟲(chóng)DNA條形3.13.23.33.4在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，與受試樣品平行進(jìn)行的，用確定不含DNA的樣品代替受試樣品進(jìn)行的對(duì)照反應(yīng)，用3.524,6擴(kuò)增引物和探針。5.2實(shí)驗(yàn)室分析設(shè)備5.2.4超微量紫外分光光度計(jì)：測(cè)量體積5.3.8PCR管、96孔板等類(lèi)似的PCR反應(yīng)容器：無(wú)DNA和生物殘包括環(huán)境DNA樣品采集、環(huán)境DNA提取、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備、定量PCR擴(kuò)增、結(jié)果分析與計(jì)算、質(zhì)量控制3水+++++），入無(wú)水乙醇，確保樣品中最終的乙醇濃度≥80%，常46.2.3.2同一采樣點(diǎn)沉積物采集宜盡量涵蓋各類(lèi)小按照DB32/T4178的規(guī)定從不同自然基質(zhì)（如粗礫石、鵝卵石以及樹(shù)木殘干等）表面刮取一定面積6.3.1.1濾膜樣品（水樣或混合浮游動(dòng)物組織樣品）：利用研磨珠和裂解液將濾膜振蕩破碎，必要時(shí)6.3.1.4混合大型底棲無(wú)脊椎動(dòng)物組雜質(zhì)，可采用離心柱法或磁珠法等常規(guī)分子生物學(xué)操作純化DNA，操作步驟見(jiàn)GB/T4樣本DNA濃度應(yīng)不低于1ng/μL，最佳濃度范圍為10ng/μL～100ng/μL，6,4標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備將含有目標(biāo)物種或生物類(lèi)群的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子DNA溶液進(jìn)行梯度稀釋。為便于后續(xù)計(jì)算，可先稀釋至5關(guān)系制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即以DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)作為橫坐標(biāo)，Ct值作為縱坐標(biāo)作圖，并獲得標(biāo)準(zhǔn)曲定量PCR預(yù)混液。每個(gè)DNA樣品3個(gè)重復(fù)。體系配制應(yīng)按照單次實(shí)驗(yàn)所DNA模板--定量PCR反應(yīng)程序見(jiàn)表3。不同定量PCR平臺(tái)對(duì)除退火延伸外步驟中的溫度和時(shí)間要求不同，可做相設(shè)置PCR反應(yīng)熒光信號(hào)收集條件,應(yīng)與探針標(biāo)記的報(bào)告基團(tuán)一致。具體設(shè)置方法可參照儀器使用說(shuō)實(shí)驗(yàn)設(shè)立以下對(duì)照:a)陽(yáng)性對(duì)照，為目標(biāo)物種或生物類(lèi)群基因組DNA，或含有上述片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)66.6結(jié)果分析與計(jì)算）；Copy=··················時(shí)，相應(yīng)的不含目標(biāo)物種的基因組DNA，或混合樣品；無(wú)DNA提取每個(gè)點(diǎn)位應(yīng)至少設(shè)置3個(gè)生物重復(fù)樣品，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求和實(shí)驗(yàn)條件適當(dāng)設(shè)置DNA提取、定量PCR擴(kuò)7檢出的物種所占比例，即假陰性率（FN）。假陰性率不應(yīng)超過(guò)1··················································存在的物種所占比例，即假陽(yáng)性率（FP）。假陽(yáng)性率不應(yīng)超過(guò)10·················································7.2質(zhì)量保證廢棄物的分類(lèi)、收集、存放和集中處理應(yīng)按照GB19489和S在處理之前應(yīng)采用高壓滅菌、消毒或焚燒等方式滅活，對(duì)含核酸8監(jiān)測(cè)單位：采樣人：氣溫(℃):水溫(℃):電導(dǎo)率(μS/cm混合大型底棲無(wú)脊采樣工具：□抓斗式采泥器□彼得森采樣器9B.1.1制定合理的采樣操作程序，在確定的采樣時(shí)間、采樣點(diǎn)、采樣層次，用符合質(zhì)量要求的統(tǒng)一設(shè)B.1.3合理安排各類(lèi)生物樣品采集順序，盡量避免生物類(lèi)群在采集前受到較B.1.4正確填寫(xiě)樣品標(biāo)簽，包括樣B.1.5及時(shí)在現(xiàn)場(chǎng)處理樣品。受生物活動(dòng)影響，隨時(shí)a)應(yīng)全程佩戴無(wú)菌實(shí)驗(yàn)手套，采集下b)采樣和前處理過(guò)程宜采用一次性無(wú)菌裝置或耗材。對(duì)于重復(fù)使用裝置和耗材，應(yīng)選用漂白劑g)過(guò)濾水樣前，每個(gè)樣品的過(guò)濾器接觸面應(yīng)使用漂白劑消毒不少于1分鐘，并用蒸餾水B.3.1應(yīng)根據(jù)采樣記錄或登記表核對(duì)清點(diǎn)樣品，以免有誤B.3.2樣品運(yùn)輸應(yīng)按照要求的貯存溫度執(zhí)行，必要時(shí)需準(zhǔn)備冷B.3.3運(yùn)輸中應(yīng)仔細(xì)保管樣品，以確保樣品無(wú)破損、無(wú)污染。應(yīng)避免強(qiáng)光照射及強(qiáng)烈C.1.1DNA提取實(shí)驗(yàn)室和PCR實(shí)驗(yàn)室須在物理空C.1.3每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備專(zhuān)用的實(shí)驗(yàn)工作服，并定C.2.1實(shí)驗(yàn)人員不應(yīng)在同一天進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)C.2.3確保所有的實(shí)驗(yàn)耗材和試劑在保質(zhì)期內(nèi)，在正C.2.6實(shí)驗(yàn)操作前，移液槍?xiě)?yīng)選用75%的酒精消毒或紫外線(xiàn)消毒30C.2.7實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)全程穿著實(shí)驗(yàn)服，并佩戴一次性無(wú)菌實(shí)驗(yàn)手C.2.8實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，移液槍不得接觸任何盛放樣品或試劑的容器C.2.9同一耗材（例如1.5mL離心管、移液槍頭等）不C.2.11懷疑或確定產(chǎn)生交叉污染的樣品、試劑或耗材，不得繼續(xù)使C.3.1實(shí)驗(yàn)操作前，應(yīng)用1.5%的漂白劑擦C.3.5準(zhǔn)確記錄陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和實(shí)驗(yàn)樣