PCR基本原理及熒光PCR

PCR的根本原理及熒光PCR聚合酶鏈反響〔polymerasechainreaction,PCR〕,又稱無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)。PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長(zhǎng)GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造1971年，Khorana提出：經(jīng)過(guò)DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過(guò)程便可克隆tRNA基因。但由于測(cè)序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了……PCR技術(shù)簡(jiǎn)史DNA的復(fù)制核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想聚合酶鏈反響的創(chuàng)造1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本原理是在試管中模擬細(xì)胞內(nèi)的DNA復(fù)制最初采用E-coliDNA聚合酶進(jìn)行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過(guò)程耗時(shí)，費(fèi)力，且易出錯(cuò)耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進(jìn)行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美國(guó)《Science》雜志列PCR為十余項(xiàng)重大科學(xué)創(chuàng)造之首,比喻1989年為PCR爆炸年,Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。聚合酶鏈反響〔polymerasechainreaction,PCR〕,又稱無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)。是一種特定的核酸片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法。非傳統(tǒng)克隆模式，無(wú)需活細(xì)胞。高效率，在數(shù)小時(shí)內(nèi)可擴(kuò)增107-108倍。廣泛應(yīng)用于病毒DNA和RNA的檢測(cè)。

PCR的原理該技術(shù)是在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促合成反響。DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，借助一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)合成，通過(guò)一個(gè)或兩個(gè)人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板中的一段互補(bǔ)序列結(jié)合，形成局部雙鏈。在適宜的溫度和環(huán)境下，DNA聚合酶將脫氧單核苷酸加到引物3′-OH末端，并以此為起始點(diǎn)，沿模板5′→3′方向延伸，合成一條新的DNA互補(bǔ)鏈。PCR反響的根本成分模版：DNA或者RNA，當(dāng)模版為RNA時(shí)，需逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再進(jìn)行反響。引物：與待擴(kuò)增靶DNA序列互補(bǔ)的寡核苷酸片段。是PCR設(shè)計(jì)的關(guān)鍵！引物的長(zhǎng)度18-40bp、20-40bp、擴(kuò)增跨度200-500bp、組成(A,T,G,C隨機(jī)分布)、濃度0.1-1umol/L。PCR反響的根本成分耐熱DNA聚合酶:TaqDNA聚合酶其他DNA聚合酶三磷酸脫氧核苷酸〔dNTPs〕：是PCR反響的合成原料。濃度50-2001umol/L。反響緩沖體系：10-501mmol/LTris-HCL。Mg2+、TaqDNA聚合酶活性與Mg2+濃度有關(guān)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR反響體系4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/LPCR反響根本步驟

變性--退火--延伸模板DNA的高溫變性：94℃左右，模板DNA解鏈為單鏈。模板DNA與引物的低溫退火(復(fù)性)：45℃-65℃，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合。引物的適溫延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反響原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保存復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保存復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保存復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）PCR反響步驟適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍94℃變性45-65℃退火XX℃延伸PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)1234522557294時(shí)間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)1~3步25~30輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬(wàn)倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)45-65℃引物1引物2DNA引物PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃引物1引物2DNA引物Taq酶Taq酶PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)95℃第1輪結(jié)束第2輪開(kāi)始PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)72℃第2輪結(jié)束PCR的根本原理PCR反響條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增reverseprimerforwardprimer3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'5'5'3'鏈?zhǔn)椒错懙难┍佬?yīng)3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'3'5'5'3'5'5'3'常見(jiàn)的PCR技術(shù)原位PCR逆轉(zhuǎn)錄PCR反向PCR多重PCR免疫PCR巢式PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR〔real-timequantitativePCR〕1996年由美國(guó)AppliedBiosystems(ABI)公司創(chuàng)造。定義：在PCR反響體系中參加熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反響的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析。無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反響實(shí)時(shí)檢測(cè)。熒光定量PCR與常規(guī)PCR的比照優(yōu)勢(shì)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反響中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。

如何對(duì)起始模板定量？通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析三個(gè)概念：擴(kuò)增曲線、熒光閾值、Ct值(cyclethreshold)實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理----擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線圖：

橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基團(tuán)熒光檢測(cè)元件實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-----熒光閾值熒光信號(hào)閾值〔threshold〕：前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)〔baseline〕，即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值熒光域值的缺省設(shè)置是3～15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)差的10倍手動(dòng)設(shè)置：原那么要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于0.99真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)域值實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理-------Ct值Ct值的定義：PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。C(t)value實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---Ct值的重現(xiàn)性橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量Ct值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定；Ct值那么極具重現(xiàn)性實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反響：X=X0*2n非理想的PCR反響：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反響的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率

實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物到達(dá)閾值線時(shí):XCt=X0(1+Ex)Ct=M(1)XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)到達(dá)閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量.在閾值線設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得:lgM=lgX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:lgX0=-Ct×lg(1+Ex)+lgM(3)Lg濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品中所含的模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------標(biāo)準(zhǔn)曲線模板DNA量越多，熒光到達(dá)域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小。Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，通過(guò)起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理---------定量原理理想的PCR反響：X=X0*2n非理想的PCR反響：X=X0(1+Ex)nn：擴(kuò)增反響的循環(huán)次數(shù)X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0：初始模板量Ex：擴(kuò)增效率

原因？Taq酶、引物、模版等PCR要素消耗PCR擴(kuò)增效率越來(lái)越低產(chǎn)物增長(zhǎng)速度逐漸減慢最終到達(dá)平臺(tái)期熒光定量PCR中熒光產(chǎn)生的機(jī)制非探針類探針類染料染色SYBR?GreenI溴乙錠(EthidiumBromide)探針標(biāo)記TaqManTM

TaqManMGBDual-oligoFRETpairs分子信標(biāo)(Molecularbeacons)ScorpionsTM/AmplifluorTM探針?lè)ㄐ〗Y(jié)NoBlots!NoGels!既靈敏又特異：PCR與分子雜交的結(jié)合

雙倍放大：PCR放大與熒光放大的結(jié)合與DNA結(jié)合時(shí)發(fā)光游離時(shí)不發(fā)光SYBRGreenI染料法SYBRGreenI是一種DNA小溝結(jié)合染料在PCR過(guò)程中染料與DNA結(jié)合發(fā)光聚合完成聚合開(kāi)始SYBRGreenI熒光染料染料法小結(jié)本錢(qián)低 不需要探針適合初步篩查先用SYBR篩查，再用探針?lè)ň_定量少數(shù)關(guān)鍵樣品無(wú)模板特異性不能分辨主帶與雜帶，給出的是總信號(hào)不能做多重檢測(cè)每孔只能檢測(cè)一個(gè)目標(biāo)基因靈敏度低適合于5000拷貝以上的基因定量多重?zé)晒舛吭硗粯颖?，多?duì)引物，分別擴(kuò)增不同的靶基因不同的探針識(shí)別不同的靶基因不同的探針標(biāo)記不同的顏色。特點(diǎn)一次提取DNA/RNA、一次反響得出多個(gè)定量結(jié)果信號(hào)之間要保證互不干擾多色熒光技術(shù)熒光定量需要ROX校正和IPC校正檢材和對(duì)照可以在同一管中定量?jī)x器須有多熒光檢測(cè)能力

推薦的4色組合

FAM

目的基因

VIC

第二個(gè)目的基因或者IPCTAMRA

淬滅基團(tuán)

ROX

參比熒光熒光染料功能分類Reporterdye:

6-FAM

、VIC、TET、NEDQuencherdye:TAMRA(TaqMan探針)DarkQuencher(MGB探針)Referencedye:ROX

-passiveinternalreferenceforsignalnormalisation-allowsrelative(notabsolute)fluorescencetobemeasured-criticalforprecision7000：4色熒光7900：4色熒光FAM?/SYBR?GreenI

報(bào)告熒光1/染料VIC?/JOE

報(bào)告熒光2NED/TAMRA?

報(bào)告/淬滅熒光ROX?

參比熒光FAM?/SYBR?GreenI 報(bào)告熒光1/染料VIC?/JOE

報(bào)告熒光2TAMRA?

淬滅熒光ROX?

參比熒光FAM?/SYBR?GreenIVIC?/JOE?TAMRA?/NED?ROX?(參比熒光passivereference)7300：4色熒光5片激發(fā)濾色片、5片發(fā)射濾色片F(xiàn)AM?,SYBR?GreenIVIC?,JOE?

NED?,TAMRA?,CY3Dye?ROX?(passivereference),TexasRed?CY5Dye?增加熒光無(wú)須硬件變動(dòng)：多重?zé)晒饨馕鏊惴ㄜ浖?500：5色熒光熒光PCR核酸提取核酸制備的一般原那么核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)核酸制備的一般步驟核酸樣品的保存核酸制備的一般原那么別離純化核酸總的原那么：①應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；②排除其它分子的污染。核酸純化應(yīng)到達(dá)的要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；②其它生物大