細(xì)菌基因組DNA的提取-1

實驗：細(xì)菌基因組DNA的提取制作人：蔡甘露（113516229）于妍（113516230）楊開莉（113516220）杜輝（113516222）主講人：杜輝1精選2021版課件目錄一、實驗?zāi)康亩?、實驗原理三、儀器、試劑四、實驗方法和步驟五、實驗注意事項六、DNA提取常見問題七、問題與討論2精選2021版課件一、實驗?zāi)康膶W(xué)會細(xì)菌基因組DNA的提取方法觀察提取出來的DNA物質(zhì)3精選2021版課件二、實驗原理DNA在生物體內(nèi)是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物的形式存在，因此提取出脫氧核糖核蛋白復(fù)合物后，必須將其中蛋白質(zhì)去除。在堿性條件下，用表面活性劑SDS將細(xì)菌細(xì)胞壁破裂，然后用高濃度的NaCl沉淀蛋白質(zhì)雜質(zhì)，經(jīng)過氯仿抽提進(jìn)一步去掉蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，經(jīng)乙醇沉淀，得到較純的DNA。4精選2021版課件三、儀器、試劑1、儀器

離心管、離心機、試管、吸量管2、試劑（1）活材料：大腸桿菌（E.coli）或枯草桿菌（Bacillussubtilis）（2）培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基（3）溶菌酶：100μg/ml（4）裂解液：40mmol/Ltris-HCl,pH8.0,20mmol/L乙酸鈉，1mol/LEDTA，1%SDS5精選2021版課件（5）1%SDS（十二烷基硫酸鈉）：1gSDS溶于100ml蒸餾水，滅菌后-4℃保存（6）mol/LNaCl：稱取292.5gNaCl，溶于1000ml蒸餾水，滅菌后-4℃保存。（7）無水乙醇及70%乙醇（8）超純水（9）TE緩沖液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA-Na2（pH：8.0）（10）飽和酚（11）氯仿：異戊醇（25：1）6精選2021版課件四、實驗方法和步驟1、DNA提取的一般方法破碎細(xì)胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中7精選2021版課件四、實驗方法和步驟2、DNA提取的實驗步驟菌體培養(yǎng)37℃、16—18h菌體收集12000r/min、30sNaCl充分混勻12000r/min，10min棄上清液200μL裂解緩沖液轉(zhuǎn)移上清置新離心管加Tris飽和苯酚混勻12000rmin，3min取水層加氯仿混勻12000r/min、3min取上層清液加無水乙醇12000r/min、3min棄上清沉淀加400μL70%乙醇洗兩次真空干燥溶解DNA-20℃冰箱8精選2021版課件五、實驗注意事項1、材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低。2、采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔。3、離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間。4、沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等。5、晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）。9精選2021版課件1、DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)2、DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)3、DNA中殘留有金屬離子1、重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)2、重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)3、增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）六、DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)原因?qū)Σ?0精選2021版課件1、材料不新鮮或反復(fù)凍融2、未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性3、提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷4、外源核酸酶污染5、反復(fù)凍融問題二：DNA降解對策

原因1、盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融2、液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液3、在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量4、細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔5、所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌6、將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融11精選2021版課件1、簡要敘述酚氯仿抽提ＤＮＡ體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因。

酚氯仿抽提DNA后，會使溶液分層，上層為水相，含有DNA；中間為蛋白（有時看不到）；下層為有機相。原因是酚氯仿可以使蛋白質(zhì)變性，從而從溶液中析出，但是蛋白密度會小于酚氯仿，所以離心后它分布在中間；而DNA溶于水而不溶于有機相。2、沉淀ＤＮＡ?xí)r為什么要用無水乙醇？

是因為D