PCR引物設(shè)計及Primer-Premier-5.0使用介紹

PCR引物設(shè)計及相關(guān)軟件使用主要內(nèi)容PCR介紹引物設(shè)計原理引物設(shè)計原那么PrimerPremier5.0介紹舉例說明引物的設(shè)計PCR介紹1、什么是PCR聚合酶鏈反響(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期開展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出優(yōu)點；能在一個試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內(nèi)擴(kuò)增至十萬乃至百萬倍;可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細(xì)胞中擴(kuò)增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。引物設(shè)計是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。使用不適宜的PCR引物容易導(dǎo)致實驗失?。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶〔如形成引物二聚體帶〕，不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計大都通過計算機(jī)軟件進(jìn)行。可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁，得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機(jī)上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。引物設(shè)計原理引物設(shè)計的目的是為了找到一對適宜的核苷酸片段，使其能有效地擴(kuò)增模板DNA序列。引物設(shè)計總體上包含三個程序：序列下載，同源性比較，引物設(shè)計篩選。引物設(shè)計的原那么1.引物長度一般在15~30堿基之間。

引物長度〔primerlength〕常用的是18-27bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反響；引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的〔不容易引起錯配〕引物設(shè)計的原那么2.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。GC含量〔composition〕過高或過低都不利于引發(fā)反響。上下游引物的GC含量不能相差太大。假設(shè)按公式Tm=4〔G+C〕+2〔A+T〕估計引物的Tm值，那么有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最正確。引物設(shè)計的原那么3.引物3′端要避開密碼子的第3位。

如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡并，會影響擴(kuò)增的特異性與效率。4.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。

引物3′端錯配時，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為T時，錯配的引發(fā)效率大大降低，G、C錯配的引發(fā)效率介于A、T之間，所以3′端最好選擇T。引物設(shè)計的原那么引物設(shè)計的原那么5.堿基要隨機(jī)分布。

引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否那么容易導(dǎo)致錯誤引發(fā)〔Falsepriming〕。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過3個連續(xù)的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。引物設(shè)計的原那么7.引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列。

引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否那么引物自身會折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)〔Hairpin〕使引物本身復(fù)性。這種二級結(jié)構(gòu)會因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補(bǔ)。兩引物之間也不應(yīng)具有互補(bǔ)性，尤其應(yīng)防止3′端的互補(bǔ)重疊以防止引物二聚體〔Dimer與Crossdimer〕的形成。引物設(shè)計的原那么引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)如果不可防止的話，應(yīng)盡量使其△G值不要過高〔應(yīng)小于4.5kcal/mol〕。否那么易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反響不能正常進(jìn)行。引物設(shè)計的原那么7.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。

引物的5′端決定著PCR產(chǎn)物的長度，它對擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。通常應(yīng)在5'端限制酶位點外再加1-2個保護(hù)堿基

引物的延伸是從3′端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結(jié)構(gòu)可能。引物設(shè)計的原那么8.擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級結(jié)構(gòu)。

某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時最好避開二級結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)軟件〔比方RNAstructure〕可以預(yù)測估計mRNA的穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。引物設(shè)計的原那么9.引物應(yīng)具有特異性。

引物設(shè)計完成以后，應(yīng)對其進(jìn)行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性，就可以進(jìn)行下一步的實驗了。值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計難度不一。有的模板本身條件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分適宜的引物；用作克隆目的的PCR，因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。

PrimerPremier5.0簡介主要功能:1、即引物設(shè)計2、限制性內(nèi)切酶位點分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析PrimerPremier5.0使用介紹PreimerPremier啟動界面Loadsequence根本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8種密碼子偏好Chooseafunction引物設(shè)計界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer引物搜索選項設(shè)定引物類型搜索模式5’引物位置范圍3’引物位置范圍產(chǎn)物大小范圍引物長度搜索結(jié)果28對引物引物分值100分為總分值每對引物的信息雙擊選中一對引物引物信息回到主窗口引物及產(chǎn)物信息是否出現(xiàn)hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer一對理想的