GB∕T 39104.1-2020 紡織品 抗真菌性能的測(cè)定 第1部分：熒光法

紡織品抗真菌性能的測(cè)定Textiles—Determinationofantifun國家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I本部分為GB/T39104的第1部分?！獙SO13629-1:2012第10章內(nèi)的懸置段內(nèi)容調(diào)整為10.1,其后條號(hào)順延；●增加引用了GB/T20944.2—2007(見——明確了ISO13629-1:2012的8.5.1中SDB培養(yǎng)基配方純水用量為最終定容至1000mL;——明確了7.20中血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)單位為“CFU/mL”;——將8.4.2中腺嘌呤核苷-5'-三磷酸酯二鈉鹽三水合物的分子式調(diào)整為“C?H?N?Na?O??P?·Ⅱ織科技有限公司、奧譜天成(廈門)光電有限公司、上海愛麗紡織技術(shù)檢驗(yàn)有限公司、晉江中紡標(biāo)檢測(cè)有Ⅲ由抗菌整理紡織品制成的特殊產(chǎn)品在各領(lǐng)域中的應(yīng)用逐年增加，而且這些紡織品無疑有助于防止紡織材料變質(zhì)，并改善環(huán)境和生活質(zhì)量?；谝陨弦蛩?，ISO/TC38/WG23在2007年制定了ISO20743,并繼續(xù)開展紡織產(chǎn)品抗真菌性能測(cè)試方法系列國際標(biāo)準(zhǔn)的研究。本部分采用ATP熒光法作為抗真菌性能的定量分析方法。熒光法的特點(diǎn)如下：——與菌落計(jì)數(shù)法相比誤差極??；——簡(jiǎn)化了試驗(yàn)操作。GB/T39104的其他部分為：——第2部分：平皿計(jì)數(shù)法。紡織品抗真菌性能的測(cè)定GB/T39104的本部分規(guī)定了通過檢測(cè)酶反應(yīng)[三磷酸腺苷(ATP)法]所產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度測(cè)定紡織品抗真菌性能的定量試驗(yàn)方法。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T20944.2—2007紡織品抗菌性能的評(píng)價(jià)第2部分：吸收法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。用于驗(yàn)證試驗(yàn)真菌生長條件的織物。抑制或減緩真菌生長或減少真菌數(shù)量的助劑。抑制或緩和真菌生長或降低真菌數(shù)量的整理。在含陰離子表面活性劑的無菌水中均勻分散有真菌孢子的液體。三磷酸腺苷adenosinetriphosphate;ATP活真菌中存在的一種多功能核苷酸。抗真菌性antifungala抑制或減緩真菌生長的性能，用對(duì)照樣和試樣中ATP的對(duì)數(shù)所表示的增長值之差來表征。2測(cè)定真菌細(xì)胞中ATP數(shù)量的方法。4原理將試樣和對(duì)照樣分別用試驗(yàn)真菌孢子懸液接種，并在25℃條件下培養(yǎng)42h。通過比較試樣與對(duì)照樣上真菌細(xì)胞內(nèi)ATP熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果，對(duì)真菌增長值或抗真菌性能進(jìn)行定量測(cè)定。本方法需要使用真菌，應(yīng)由經(jīng)過微生物學(xué)技術(shù)培訓(xùn)和具有經(jīng)驗(yàn)的人員進(jìn)行試驗(yàn)。應(yīng)遵循國家有關(guān)的法規(guī)、條例以及與適當(dāng)?shù)陌踩A(yù)防措施相關(guān)的推薦性規(guī)范。6試驗(yàn)真菌試驗(yàn)用真菌菌株應(yīng)從附錄A的表A.1中選取。經(jīng)有關(guān)方同意后可使用加入世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)(WFCC)的其他菌種保藏機(jī)構(gòu)提供的等效真菌菌真菌菌株保藏編號(hào)和來源應(yīng)在報(bào)告中說明。7儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器具及下列儀器。7.2培養(yǎng)皿：內(nèi)徑約90mm和55mm～60mm。7.3干燥滅菌器：溫度能保持在160℃~180℃。7.4高壓滅菌鍋：溫度能保持在(121±2)℃(壓強(qiáng)相當(dāng)于103kPa)。7.5二級(jí)生物安全柜：或其他等效設(shè)備。7.6鉑接種環(huán)：環(huán)直徑為2mm～4mm。7.7L型鉑接種鉤。7.8培養(yǎng)箱：溫度能保持在20℃~37℃,允差為±2℃。7.9螺口玻璃瓶：容量為30mL,帶有聚四氟乙烯或硅橡膠墊片和聚丙烯蓋。7.10玻璃棒：直徑為5mm～18mm,質(zhì)量為1g～50g。7.11玻璃漏斗。7.12移液管：容量為0.05mL、0.1mL、0.2mL、1mL、5mL和10mL,允差為5.0%。7.14錐形瓶：容量為100mL～57.15鑷子。7.17試管振蕩器。7.18離心機(jī)：離心加速度約為2000×g。37.20血球計(jì)數(shù)板：能計(jì)測(cè)1×10?CFU/mL～3×10?CFU/mL。7.21顯微鏡：放大倍數(shù)為200倍。7.22超聲波清洗機(jī)：試驗(yàn)用緊湊型，頻率約為30kHz～50kHz。7.23光度計(jì)：測(cè)試波長為300nm～650nm,在8.4和第11章規(guī)定的分析條件下能測(cè)定濃度為7.25冰箱：溫度能保持在2℃~10℃。試管、玻璃瓶、燒瓶、移液管以及鑷子應(yīng)用堿性或中性洗滌劑小心清洗、沖洗并干燥滅菌器或高壓蒸汽滅菌器進(jìn)行處理。8試劑和培養(yǎng)基試驗(yàn)所用試劑應(yīng)是分析純的和/或是適用于微生物試驗(yàn)用的。宜使用現(xiàn)有商業(yè)化的脫水產(chǎn)品制備培養(yǎng)基，并嚴(yán)格按照相關(guān)產(chǎn)品制造商的使用說明進(jìn)行操作。用于制備微生物培養(yǎng)基和試劑的分析級(jí)純水，用蒸餾、離子交換、超濾和/或反滲(RO)裝置過濾的8.3陰離子表面活性劑琥珀辛酯磺酸鈉，用于制備孢子懸液。按8.4.2～8.4.8規(guī)定配制試劑和緩沖液?？捎媒?jīng)過適當(dāng)驗(yàn)證的商業(yè)試劑代替。腺嘌呤核苷-5'-三磷酸酯二鈉鹽三水合物60.5mg純水(8.2)100mL(最終定容至)將配制好的標(biāo)準(zhǔn)原液放入密封裝置中并在不高于一20℃的條件下冷藏，保質(zhì)期6個(gè)月。N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸1117mg乙二胺四乙酸二鈉鹽乙酸鎂(四合水)DL-二硫蘇糖醇4蔗糖925mg純水250mL(最終定容至)在8.4和第11章規(guī)定的試驗(yàn)條件下，ATP熒光劑應(yīng)能使光度計(jì)(7.23)檢測(cè)濃度為1×10-8mol/L~熒光素酶0.7mgD-熒光素12.6mg牛血清白蛋白56mg緩沖液(見8.4.3)30mL一次完全溶解，在使用前置于室溫中15min。制備后在3h內(nèi)使用。8.4.5ATP萃取劑ATP萃取劑應(yīng)具有從培養(yǎng)真菌中萃取細(xì)胞內(nèi)的ATP的能力，萃取率不低于80%。N-[三(羥甲基)甲基]甘氨酸45mg苯扎氯銨，10%水溶液0.2mLpH(使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH)12.0±0.5如果在萃取液中使用除上述成分的其他試劑應(yīng)在報(bào)告中記錄。當(dāng)在SDB(8.5.2)中加入其1/10體積的ATP消除劑時(shí)，應(yīng)在15min內(nèi)將培養(yǎng)基中的ATP濃度降低到10~11mol/L以下。制備后在8h內(nèi)使用。成分如下：三磷酸腺苷雙磷酸酶(EC:)4.6IU/mL腺苷酸脫氨酶(EC:或7)46IU/mL蔗糖37mg牛血清白蛋白20mg0.05mol/L2-嗎啉乙磺酸一水合物緩沖液10mLpH6.0±0.5如果使用其他消除劑，應(yīng)在報(bào)告中記錄其成分。8.4.7生理鹽水溶液將8.5g氯化鈉加入盛有1000mL純水的燒瓶中。使其完全溶解并根據(jù)蒸汽壓力滅菌的需要分裝到試管中。8.4.8含陰離子表面活性劑的無菌水將50mg陰離子表面活性劑溶解到純水中，定容至1000mL,并根據(jù)高壓蒸汽滅菌的需要分裝到試管中。8.5培養(yǎng)基使用按8.5.2～8.5.5制備的培養(yǎng)基。經(jīng)驗(yàn)證后可用商業(yè)培養(yǎng)基代替。5對(duì)于制備后不立即使用的培養(yǎng)基，宜在5℃~10℃條件中儲(chǔ)存，保質(zhì)期1個(gè)月。1000mL(最終定容至)將馬鈴薯洗凈去皮，去除每個(gè)芽周圍約10mm的部分，盡量減少瑕疵，并將其切成10mm的塊狀。取200g馬鈴薯在1000mL純水中沸煮1h。用多層紗布(7.1)過濾，取濾液加入純水，定容至1000mL。加入20g葡萄糖和15g～20g瓊脂，待固體充分溶解后放入高壓滅菌鍋(7.4)中滅菌。將10mL完全溶解并預(yù)熱后的PDA(8.5.3)倒入試管中。用棉塞封口并用蒸汽滅菌。將滅菌后的試管放置在與試驗(yàn)臺(tái)平面呈15°傾角的斜面上，并使試管內(nèi)的物體凝固。當(dāng)固化瓊脂中無流動(dòng)液體時(shí)，再次溶解并固化以備使用。純水1000mL(最終定容至)按照供應(yīng)商說明進(jìn)行。9真菌的保存與使用在二級(jí)生物安全柜(7.5)或其他等效設(shè)備中對(duì)試驗(yàn)真菌與孢子進(jìn)行傳代培養(yǎng)和操作：——在傳代培養(yǎng)前后對(duì)棉塞及試管頸部進(jìn)行火焰滅菌或化學(xué)滅菌?！稳≡季系囊徊糠志?，以直線或曲線的形式(見圖1)將孢子分散在斜面培養(yǎng)基底部的冷凝水中并涂抹到斜面培養(yǎng)基頂部。——每次對(duì)不同類型的真菌進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，使用經(jīng)火焰滅菌后的鉑接種環(huán)(7.6)或L型鉑接種鉤——將傳代培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基在25℃±2℃條件下的培養(yǎng)箱(7.8)中放置至少8d,并確認(rèn)在5℃~10℃條件下保存前已經(jīng)產(chǎn)生足夠的孢子。——在3個(gè)月內(nèi)，將傳代培養(yǎng)的真菌轉(zhuǎn)移到新斜面培養(yǎng)基中，以便進(jìn)一步培養(yǎng)和保存?！?個(gè)月傳代一次。傳代培養(yǎng)的真菌菌落傳代次數(shù)最多應(yīng)不超過5次。不要使用超過3個(gè)月的真菌做進(jìn)一步傳代培養(yǎng)。6圖1斜面培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)示意圖9.2真菌的使用為制備第10章中規(guī)定的孢子懸液中的真菌，將9.1中保藏的真菌轉(zhuǎn)移到平板培養(yǎng)基上，在25℃±2℃條件下培養(yǎng)至少8d。當(dāng)培養(yǎng)后的真菌不立即使用時(shí)，將其放置在5℃~10℃條件下保存并在7d內(nèi)使用。10孢子懸液10.1通用孢子懸液的制備和調(diào)節(jié)過程見圖2。3456圖2孢子懸液的調(diào)節(jié)步驟7——用短巴斯德吸管(7.13)或等效裝置吸取0.5mL含陰離子表面活性劑的無菌水(8.4.8)(步驟1);——分5次將其分散到瓊脂平板中心的孢子中，緩慢清洗表面(步驟2)。10.3從培養(yǎng)基中收集和分散孢子懸液——用短巴斯德吸管(7.13)或類似裝置吸取10.2中孢子懸液；——將其移入約5mL含陰離子表面活性劑的無菌水(8.4.8)中；——吸吹100次或用試管振蕩器攪拌或用低超聲波清洗5min,以便孢子能充分分散；——目測(cè)懸液出現(xiàn)輕微渾濁(步驟3)。用帶有紗布(7.1)或玻璃棉的漏斗或其他裝置進(jìn)行過濾(步驟4)。10.5使用離心分離和再懸浮去除上清液——過濾后，在25℃±2℃條件下以2000×g加速度離心分離5min,當(dāng)離心機(jī)(7.18)無控溫裝置時(shí)可在室溫下進(jìn)行；——加入5mL含陰離子表面活性劑的無菌水(8.4.8);——充分吸吹使孢子分散或使用試管振蕩器攪拌，或用低超聲波清洗5min,以便于孢子能充分分散(步驟5)。用血球計(jì)數(shù)板檢驗(yàn)以下項(xiàng)目：a)孢子數(shù)量及形態(tài)：確保孢子數(shù)量為1×10?CFU/mL～3×10?CFU/mL,且90%以上為無菌絲b)當(dāng)孢子數(shù)量較多時(shí)：用含陰離子表面活性劑的無菌水(8.4.8)稀釋懸液，使孢子數(shù)量降至1×10?CFU/mL～3×10?CFU/mL,并再次檢查孢子數(shù)量；c)當(dāng)孢子數(shù)量不足時(shí)：重復(fù)離心分離去除上清液，并用含陰離子表面活性劑的無菌水(8.4.8)調(diào)節(jié)孢子數(shù)量至1×10?CFU/mL～3×10?CFU/mL,再次檢查孢子數(shù)量；d)對(duì)于12.1.3中的轉(zhuǎn)移法，孢子數(shù)量應(yīng)調(diào)節(jié)至1×10?CFU/mL～3×10?CFU/mL,該濃度的孢子懸液應(yīng)用于試驗(yàn)。——用含5%SDB的陰離子表面活性劑溶液將孢子懸液濃度調(diào)至1×10?CFU/mL～3×10?CFU/mL8ATP校準(zhǔn)曲線的制作過程如下(曲線應(yīng)在試驗(yàn)當(dāng)天繪制):a)用純水稀釋8.4.2中的ATP標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，以制備準(zhǔn)確濃度分別為1×10-8mol/L、1×10-7mol/L和1×10-6mol/L的3個(gè)稀釋度；b)按以下步驟制備初次稀釋ATP試劑：從每個(gè)稀釋原液中取0.1mL轉(zhuǎn)移到不同的塑料試管，d)ATP稀釋樣的測(cè)試準(zhǔn)備：從二次稀釋ATP試劑中取0.1mL加入到兩個(gè)塑料試管中以備水和0.05mLATP消除劑加入塑料試管f)按以下步驟制備空白樣2:取0.1mL空白樣1轉(zhuǎn)移到試管中，加入0.4mL生理鹽水并搖勻；g)空白試驗(yàn)的準(zhǔn)備：將0.1mL空白樣2轉(zhuǎn)移到2個(gè)塑料試管中以備空白試驗(yàn)用；h)將0.1mLATP萃取劑分別加入g)制備的2個(gè)盛有空白樣2的塑料試管中并搖勻；i)加入0.1mLATP熒光劑并用試管振蕩器攪拌5s;1)加入0.1mLATP熒光劑并用試管振蕩器攪拌5s;——系數(shù)A可由m)中所測(cè)得的二次稀釋ATP試劑熒光強(qiáng)度的均值除以相應(yīng)的ATP濃度(mol/L)所得3個(gè)數(shù)值的平均值獲得；——系數(shù)B通過式(1)在Y=0時(shí)，代入系數(shù)A并將空白樣2熒光強(qiáng)度的均值代入X計(jì)算 (1)9必要時(shí)，按GB/T20944.2—2007的10.1方法洗滌試樣，洗滌后，用水漂洗試樣以去除洗滌劑。若使用其他未提及的方法應(yīng)在報(bào)告中說明。從樣品上裁取代表性試樣，并裁剪為合適尺寸，稱取0.20g±0.03g作為1個(gè)試樣。分別取6個(gè)對(duì)照樣和6個(gè)試樣。根據(jù)試樣的特性選取下列方法之一將各試樣分別放入不同的螺口玻璃瓶(7.9):a)如果試樣是易卷曲的紡織品，或具有絮片、羽絨，在螺口玻璃瓶(7.9)的試樣上放置一根玻璃b)如果為紗線試樣，將紗線捋成一束，并在螺口玻璃瓶(7.9)的試樣上放置一根玻璃棒；c)如果為地毯或具有類似結(jié)構(gòu)的樣品，剪取樣品上的起絨部分作為試樣，并在螺口玻璃瓶(7.9)的試樣上放置一根玻璃棒。必要時(shí)，如對(duì)于被污染的試樣，按以下步驟用高壓滅菌鍋(7.4a)用鋁箔包覆裝有試樣的螺口玻璃瓶(7.9)頂部；b)將覆有鋁箔的螺口玻璃瓶(7.9)放入金屬籃中以備高壓滅菌用；c)用鋁箔包覆瓶蓋并放入金屬籃中；d))將瓶蓋和裝有試樣的螺口玻璃瓶(7.9)放入高壓滅菌鍋(7.4),于121℃(103kPa)滅菌e)滅菌后，在無菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)取掉鋁箔，將裝有試樣的螺口玻璃瓶(7.9)放入二級(jí)生物安全柜(7.5)或其他無空氣污染風(fēng)險(xiǎn)的地方干燥至少60min;f)蓋緊瓶蓋。分別準(zhǔn)確移取0.2mL10.7中制備的1×10?CFU/mL～3×10?CFU/mL的孢子懸液，分散接種在確保孢子懸液均勻分布在試樣上的不同部位，用玻璃棒按壓使孢子懸液被充分吸收。接種完成后立即按第13章規(guī)定測(cè)定試樣的熒光強(qiáng)度。等。樣品宜足夠大(至少0.5m2)以滿足重復(fù)性試驗(yàn)的需求。試樣宜取自同一批且避開布邊或起梗制備6個(gè)對(duì)照樣和6個(gè)試樣，其中3個(gè)用于轉(zhuǎn)移后立即使用，3個(gè)用于接種培養(yǎng)后。將每個(gè)試樣放置在瓊脂表面并用200g不銹鋼圓柱體壓60s±5s。取下不銹鋼圓柱體和試樣并將按中規(guī)定將孢子懸液接種到試樣上，在25℃±2℃條件中培養(yǎng)42h±2h。按轉(zhuǎn)移后，在25℃±2℃的濕度箱中培養(yǎng)42h±2h。熒光強(qiáng)度測(cè)定的準(zhǔn)備過程如下(見圖3):圖3熒光強(qiáng)度測(cè)定準(zhǔn)備過程a)將0.1mLATP消除劑加入12.2.1制備的試樣中，并加入4.7mL生理鹽水(步驟6);b)蓋緊瓶蓋并混勻。手工搖晃30次或使用試管振蕩器振蕩5次，每次5s。在室溫中靜置20min(步驟7);c)加入5.0mLATP萃取劑(步驟8);d)蓋緊瓶蓋并混勻。手工搖晃30次或使用試管振蕩器振蕩5次，每次5s。在室溫中靜置10min(步驟9);e)搖勻，將0.2mLd)中制備的溶液分別轉(zhuǎn)移到兩個(gè)塑料試管中(步驟10);f)將0.1mLATP熒光劑分別加入到e)中制備的樣液中，用試管振蕩器攪拌5s,隨后立即用光度計(jì)(7.23)測(cè)定熒光強(qiáng)度(步驟11);g)測(cè)定兩個(gè)試樣的熒光強(qiáng)度。13.2轉(zhuǎn)移法具體過程如下：a)將0.1mLATP消除劑加入12.2.2制備的試樣中，并加入(4.9-mp)mL生理鹽水(見);b)用吸管吸吹約30次使其混勻，傾斜培養(yǎng)皿以便于移液，在室溫中靜置20min;c)加入5.0mLATP萃取劑；d)用吸管吸吹約30次使其混勻，傾斜培養(yǎng)皿以便于移液，在室溫中靜置10min;e)通過吸吹的方式混勻，吸取0.2mLd)溶液分別轉(zhuǎn)移到兩個(gè)塑料試管中；當(dāng)所用對(duì)照樣的真菌增長值小于1.5時(shí)，宜使用100%棉織物進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。lgC?——3個(gè)對(duì)照樣接種并培養(yǎng)42h±2h后的ATP量均值的對(duì)數(shù)。 lgC?——3個(gè)對(duì)照樣接種并培養(yǎng)42h±2h后的ATP量均值的對(duì)數(shù)；lgT?——3個(gè)試樣樣接種并培養(yǎng)42h±2h后的ATP量均值的對(duì)數(shù)。i)每塊試樣的抑菌值A(chǔ)。;(規(guī)范性附錄)A.1總則試驗(yàn)用真菌菌株應(yīng)與表A.1中一致，由世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)(WFCC)成員提供。A.2菌株列表表A.1真菌菌株由世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)(WFCC)成員提供。表A.1試驗(yàn)用真菌菌株菌株類型拉丁名菌株編號(hào)國內(nèi)保藏號(hào)/getinfo.htm?sid=WDCM0/getinfo.htm?sid=WDCM0芽枝狀枝孢菌/getinfo.htm?sid=WDCM0/getinfo.htm?sid=WDCM0注2:參考WDCM及其網(wǎng)址：http://refs.wdcm.erg/search.htm.(WDCM代表世界微生物數(shù)(資料性附錄)抗真菌效果表B.1給出了抗真菌效果的評(píng)價(jià)示例。表B.1抗真菌效果示例抑菌值A(chǔ)?？拐婢Чf明中等抗真菌[3]ISO846:1997Plastics—Evaluationo[4]ISO3801:1977Textiles—Wguidanceformicrobiologicalexaminationsmicroorganisms—Soilburialtest—Part1:Assessmentofrot-retardantfinis[8]ISO11721-2:2003Textiles—Determinationofresismicroorganisms—Soilburialtest—Part2:Identificationoflon