（高清版）GBT 38490-2021 微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化測定 微流控芯片法

微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化測定微流控芯片法2021-12-31發(fā)布2022-07-01實(shí)施國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口。本文件起草單位：清華大學(xué)、洛陽華清天木生物科技有限公司、中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院。1微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化測定微流控芯片法本文件規(guī)定了用微流控芯片法測定微生物高通量適應(yīng)性進(jìn)化的方法。本文件適用于利用微流控芯片法對不產(chǎn)生表面活性劑的單細(xì)胞形態(tài)可培養(yǎng)微生物的高通量適應(yīng)性進(jìn)化的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。適應(yīng)性進(jìn)化adaptiveevolution在實(shí)驗(yàn)室條件下通過對微生物在某一特定環(huán)境下進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，來模擬微生物對環(huán)境的長期適應(yīng)過程。適合度fitness生物體或生物群體對環(huán)境適應(yīng)的量化特征，是評估生物所具有的各種特征的適應(yīng)性，以及在進(jìn)化過程中繼續(xù)往后代傳遞能力的指標(biāo)。4原理在微生物培養(yǎng)芯片上生成培養(yǎng)基包裹菌體的微液滴，通過液滴在芯片主管道中的往復(fù)運(yùn)動(dòng)使微生物在芯片上生長繁殖，通過液滴分割融合操作實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的不斷補(bǔ)充和更換，實(shí)現(xiàn)微生物連續(xù)傳代，以實(shí)現(xiàn)微生物對特定培養(yǎng)條件的適應(yīng)性進(jìn)化，獲得生長速率提高或者對特定環(huán)境獲得耐受性提高的菌株。5試劑和材料除非另有規(guī)定，僅使用分析純試劑。25.2培養(yǎng)基根據(jù)不同菌株的需求配置相應(yīng)的培養(yǎng)基，高溫高壓滅菌后置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3油相配制含10g/L司盤-80的礦物油作為液滴生成的油相，混合均勻，室溫保存?zhèn)溆谩?儀器設(shè)備6.1微生物微液滴培養(yǎng)儀。6.2微生物培養(yǎng)芯片。7適應(yīng)性進(jìn)化操作步驟7.1菌體準(zhǔn)備與培養(yǎng)從凍存管中蘸取菌液涂布于固體培養(yǎng)基上活化，在菌體最適生長條件下培養(yǎng)，直至固體培養(yǎng)基上出現(xiàn)便于挑取的單菌落。在無菌條件下挑取固體培養(yǎng)基上單菌落放入相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床在最適條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期。7.2微生物培養(yǎng)芯片安裝及初始化操作如下：a)使用0.22μm的濾膜過濾礦物油，油相進(jìn)樣瓶在121℃下高溫高壓滅菌15min。用無菌針管吸取過濾后的礦物油沖洗微生物培養(yǎng)芯片內(nèi)部2次～3次。將盛有60mL～80mL過濾后的礦物油的油相進(jìn)樣瓶和沖洗后的微生物培養(yǎng)芯片置于紫外燈下照射超過1h后，安裝至微生物微液滴培養(yǎng)儀相應(yīng)位置。b)設(shè)定油水檢測激光光壓值，設(shè)定合適的培養(yǎng)溫度，進(jìn)行初始化操作。初始化時(shí)間應(yīng)大于6h。7.3樣品準(zhǔn)備準(zhǔn)備三個(gè)試劑進(jìn)樣瓶并編號A、B、C,清洗后在121℃下高溫高壓滅菌15min。準(zhǔn)備新鮮培養(yǎng)基和含一定濃度(根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而定)脅迫因子的培養(yǎng)基各8mL～10mL;準(zhǔn)備用無菌培養(yǎng)基稀釋50倍的生長到對數(shù)生長中后期的菌液3mL～5mL。用無菌針管先向三個(gè)試劑進(jìn)樣瓶側(cè)管注入4mL～8mL油相。注射完畢旋轉(zhuǎn)進(jìn)樣瓶，讓油相浸濕整個(gè)進(jìn)樣瓶內(nèi)部，以同樣方式向A瓶注入菌液約3mL～4mL,向B瓶和C瓶分別注入新鮮培養(yǎng)基和含脅迫因子的培養(yǎng)基6mL～8mL,最后注入油相將進(jìn)樣瓶裝滿；再將試劑進(jìn)樣瓶對應(yīng)安裝進(jìn)微生物微液滴培養(yǎng)儀中。再次初始化排出試劑進(jìn)樣瓶中的空氣，時(shí)間應(yīng)不少于10min。7.4傳代條件設(shè)置和液滴生成選擇“適應(yīng)性進(jìn)化”功能，設(shè)定所需生成液滴的數(shù)量和菌體濃度檢測波長。設(shè)定傳代方式。傳代方式有兩種：一是根據(jù)細(xì)菌光密度(opticaldensity,OD)設(shè)定，即菌株生長至GB/T38490—2021所設(shè)定的OD值后進(jìn)行傳代；二是按時(shí)間傳代，即培養(yǎng)菌株至所設(shè)定的時(shí)間后進(jìn)行傳代?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)定傳代方式及相應(yīng)參數(shù)。設(shè)定脅迫因子濃度梯度。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)定在每次傳代過程中所要施加的脅迫因子濃度梯度(最多可設(shè)置8個(gè)梯度)。運(yùn)行液滴生成功能，微生物微液滴培養(yǎng)儀自動(dòng)生成液滴，液滴的體積為2μL。7.5菌體芯片培養(yǎng)和生長狀況監(jiān)測液滴生成后，運(yùn)行液滴培養(yǎng)功能，進(jìn)行菌體生長狀況監(jiān)測。7.6數(shù)據(jù)處理和結(jié)果計(jì)算7.6.1繪制菌體生長曲線根據(jù)液滴內(nèi)菌體生長狀況監(jiān)測數(shù)據(jù)，繪制不同傳代批次時(shí)菌體生長隨時(shí)間變化的曲線。7.6.2計(jì)算菌體的比生長速率比生長速率可按式(1)計(jì)算：μ——比生長速率，單位為每小時(shí)(h-1);t?——菌體對數(shù)生長后期所處的時(shí)間，單位為小時(shí)(h);t?——菌體對數(shù)生長前期所處的時(shí)間，單位為小時(shí)(h);X?——t?時(shí)刻微生物細(xì)胞量，以微生物濁度(OD)計(jì)；X?——t?時(shí)刻微生物細(xì)胞量，以微生物濁度(OD)計(jì)。根據(jù)第一代的微生物生長隨時(shí)間變化的曲線，觀察對數(shù)期，選擇對數(shù)期內(nèi)的曲線上兩點(diǎn)(t?,X?)和(t?,X?),利用式(1)計(jì)算得到適應(yīng)性進(jìn)化前菌體的比生長速率μ(0)。根據(jù)第n次傳代后的微生物生長隨時(shí)間變化的曲線，觀察對數(shù)期，選擇對數(shù)期內(nèi)的曲線上兩點(diǎn)(t?,X?)和(t?,X?),利用式(1)計(jì)算得到適應(yīng)性進(jìn)化n代后菌體的比生長速率μ(n)。7.6.3計(jì)算菌體適應(yīng)性進(jìn)化的適合度菌體適應(yīng)性進(jìn)化的適合度可由菌體比生長速率的增長率來表示，按式(2)計(jì)算： (2)R(n)——傳代培養(yǎng)第n代后菌體比生長速率的增長率；μ(n)——傳代培養(yǎng)第n代后菌體的比生長速率；μ(0)——初始菌體的比生