HYT 147.5-2013 海洋監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程 第5部分：海洋生態(tài)（正式版）

海洋監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程第5部分：海洋生態(tài)Codeofpracticeformarinemonitoringtechnology—2013-04-25發(fā)布I前言 V 12規(guī)范性引用文件 3術(shù)語(yǔ)和定義 14浮游病毒總數(shù)——染色計(jì)數(shù)法 25沉積物中病毒總數(shù)——染色計(jì)數(shù)法 46弧菌總數(shù)——平板計(jì)數(shù)法 67腸球菌——最大可能數(shù)法(MPN)和濾膜法 68糞大腸菌群——測(cè)試片法 6 10分級(jí)初級(jí)生產(chǎn)力——1C同位素法 11赤潮甲藻孢囊——光學(xué)顯微鏡法 12微微型浮游植物——熒光顯微鏡計(jì)數(shù)法 13微型浮游生物——顯微鏡個(gè)體計(jì)數(shù)法 2014小型浮游生物——顯微鏡個(gè)體計(jì)數(shù)法 2415魚類浮游生物——體視顯微鏡計(jì)數(shù)法 2416珍稀瀕危動(dòng)物調(diào)查——調(diào)訪觀測(cè)法 2717濱海濕地植物——野外勘查法 18腹瀉性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA) 19麻痹性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA) 20麻痹性貝毒——高效液相法(HPLC) 21記憶缺失性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA) 22神經(jīng)性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA) 23金黃色葡萄球菌——測(cè)試片法 24沙門氏菌——微孔板試劑盒法 25李斯特菌——測(cè)試片法 4226真菌——測(cè)試片法 4527海水中副溶血弧菌——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 28海水中創(chuàng)傷弧菌——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 29海水中河流弧菌——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 30海水中溶藻弧菌——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 31海水中哈氏弧菌——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 32海水中霍亂弧菌——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 Ⅱ33海水中鰻弧菌——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 34海水中甲肝病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法 35海水中諾如病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法 36海水中星狀病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法 37海水中輪狀病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法 38海水中腺病毒——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 39海水中腸道病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法 40蝦類桃拉病毒——反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法 41蝦類白斑綜合征病毒——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 6042魚類淋巴囊腫病毒——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 43魚類虹彩病毒——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 44貝類帕金蟲——雷氏液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)(RFTM)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 6145貝類單孢子蟲——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法 46微生物分子鑒定——限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)法 47糞便污染源微生物示蹤監(jiān)測(cè)——重復(fù)性基因外回文序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(REP-PCR)法 48赤潮藻種分子鑒定——熒光原位雜交(FISH)法 6849海洋污染物生物毒性檢驗(yàn)——發(fā)光細(xì)菌法 7050海洋污染物生物毒性檢驗(yàn)——藻類檢驗(yàn)法 7351海洋污染物生物毒性檢驗(yàn)——多毛類檢驗(yàn)法 52海洋污染物生物毒性檢驗(yàn)——軟體動(dòng)物檢驗(yàn)法 53海洋污染物生物毒性檢驗(yàn)——甲殼類檢驗(yàn)法 54海洋污染物生物毒性檢驗(yàn)——棘皮類檢驗(yàn)法 55海洋污染物生物毒性檢驗(yàn)——魚類檢驗(yàn)法 56海洋沉積物生物毒性檢驗(yàn)——端足類檢驗(yàn)法 附錄A(規(guī)范性附錄)記錄表 附錄B(資料性附錄)生理鹽水和細(xì)菌、真菌計(jì)數(shù)表 附錄C(規(guī)范性附錄)被檢樣品中細(xì)菌最可能數(shù)(MPN)表 附錄D(規(guī)范性附錄)浮游生物樣品編號(hào)、生物量測(cè)定、計(jì)數(shù) 附錄E(規(guī)范性附錄)比色卡 附錄F(規(guī)范性附錄)沙門氏菌確認(rèn)檢驗(yàn)流程圖 附錄G(規(guī)范性附錄)單核細(xì)胞增生李斯特菌確認(rèn)檢驗(yàn)流程 附錄H(資料性附錄)PCR法檢測(cè)7種弧菌電泳模擬圖 附錄I(資料性附錄)PCR、RT-PCR法檢測(cè)10種病毒電泳模擬圖 附錄J(資料性附錄)受試生物——日本大螯蜚 圖1糞大腸菌群測(cè)試片直接計(jì)數(shù)法檢測(cè)程序 8圖2糞大腸菌群測(cè)試片MPN計(jì)數(shù)法檢測(cè)程序 Ⅲ圖3文昌魚年齡結(jié)構(gòu)模式圖 圖4金黃色葡萄球菌測(cè)試片直接計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序 圖5金黃色葡萄球菌測(cè)試片MPN計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序 39圖6微孔板試劑盒法快速檢測(cè)沙門氏菌流程 40圖7單核細(xì)胞增生李斯特菌測(cè)試片檢驗(yàn)程序 44圖8霉菌與酵母菌的檢驗(yàn)程序 46圖E.1沙門氏菌微孔板試劑盒檢測(cè)法結(jié)果判讀比色卡 圖F.1沙門氏菌確認(rèn)檢驗(yàn)流程圖 圖G.1單核細(xì)胞增生李斯特菌確認(rèn)檢驗(yàn)流程 圖H.1PCR法檢測(cè)7種弧菌電泳模擬圖 圖I.1PCR、RT-PCR法檢測(cè)10種病毒電泳模擬圖 表1水樣采集層次 表2各種網(wǎng)具規(guī)格及適用對(duì)象 25表3植物群落樣地描述調(diào)查表 表4各類麻痹性貝毒檢出限參考表 表5用于熒光原位雜交試驗(yàn)的探針情況 表6氯化汞工作液稀釋配制系數(shù) 71表A.1浮游病毒及微微型浮游生物海上采樣記錄表 表A.2浮游或沉積物病毒直接計(jì)數(shù)記錄表 表A.3葉綠素采樣記錄表 98表A.4葉綠素(萃取熒光法)測(cè)定記錄表 99表A.5初級(jí)生產(chǎn)力粒度分級(jí)采樣、過(guò)濾、測(cè)定記錄表 表A.6微微型光合浮游生物細(xì)胞數(shù)量記錄表 表A.7微型浮游生物海上采樣記錄表 表A.8微型浮游生物樣品登記表 表A.9水樣浮游生物標(biāo)本個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)記錄表 表A.10微型浮游生物標(biāo)本個(gè)數(shù)計(jì)數(shù)記錄表 表A.11微型浮游生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)表 表A.12微型浮游生物種類名錄 表A.13魚類浮游生物海上采集記錄表 表A.14魚類浮游生物標(biāo)本登記表 表A.15魚類浮游生物計(jì)數(shù)記錄表 表A.16魚類浮游生物數(shù)量統(tǒng)計(jì)表 表A.17海洋珍稀瀕危游泳動(dòng)物觀測(cè)記錄表 表A.18海洋珍稀瀕危游泳動(dòng)物觀測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表 表A.19珍稀瀕危海鳥類樣點(diǎn)觀測(cè)記錄表 表A.20珍稀瀕危海鳥類樣帶觀測(cè)記錄表 表A.21文昌魚現(xiàn)場(chǎng)采樣記錄表 表A.22文昌魚種群結(jié)構(gòu)室內(nèi)分析記錄表 表A.23濱海濕地植物調(diào)查記錄表 表A.24海水中病原性弧菌檢測(cè)記錄表 表A.25海洋病毒記錄表 表A.26魚類淋巴囊腫病毒檢測(cè)記錄表 表A.27生物毒性檢驗(yàn)現(xiàn)場(chǎng)采樣記錄表 表A.28發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)定試驗(yàn)記錄表 表A.29發(fā)光細(xì)菌法測(cè)定環(huán)境毒性的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 表A.30藻類毒性試驗(yàn)記錄表 表A.31百分率與概率單位換算表 表A.32藻類毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)換算登記表 表A.33海洋生物毒性試驗(yàn)記錄表 表A.34海洋生物毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)換算登記表 表A.35端足類毒性試驗(yàn)生物結(jié)果記錄表 表A.36端足類毒性試驗(yàn)物理結(jié)果記錄表 表A.37端足類毒性試驗(yàn)生物結(jié)果統(tǒng)計(jì)表 表B.1細(xì)菌(真菌)測(cè)試片直接計(jì)數(shù)表 表C.1被檢樣品中細(xì)菌最可能數(shù)(MPN)表 V——第1部分：海水；——第2部分：沉積物；——第3部分：生物體；——第4部分：海洋大氣；——第5部分：海洋生態(tài)；——第6部分：海洋水文、氣象與海冰；——第7部分：衛(wèi)星遙感技術(shù)方法。本部分為HY/T147的第5部分。本部分按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本部分由國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心提出。本部分由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本部分起草單位：國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、國(guó)家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、國(guó)家海洋局東海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心、國(guó)家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心。1海洋監(jiān)測(cè)技術(shù)規(guī)程第5部分：海洋生態(tài)1范圍HY/T147的本部分規(guī)定了海洋生物生態(tài)的樣品采集、試驗(yàn)、分析、資料整理等方法的技術(shù)要求。本部分適用于近岸、近海、遠(yuǎn)海海域的生物生態(tài)的監(jiān)測(cè)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB3097海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)GB4789.30—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)GB4789.38食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)GB/T12763.1海洋調(diào)查規(guī)范第1部分：總則GB/T12763.6—2007海洋調(diào)查規(guī)范第6部分：海洋生物調(diào)查GB17378.3海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第3部分：樣品采集、貯存與運(yùn)輸GB17378.5海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第5部分：沉積物分析GB17378.7—2007海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第7部分：近海污染生態(tài)調(diào)查和生物監(jiān)測(cè)GB18668海洋沉積物質(zhì)量GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)范第3部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。浮游生物plankton缺乏發(fā)達(dá)的運(yùn)動(dòng)器官，沒(méi)有或僅有微弱的運(yùn)動(dòng)能力，懸浮在水層中，常隨水流移動(dòng)的生物。包括浮游植物和浮游動(dòng)物兩大類。浮游生物依個(gè)體的大小可分為以下幾種類型：粒徑小于2μm的稱微微型浮游生物(picoplankton);粒徑為2μm～20μm的稱微型浮游生物(nanoplankton);粒徑為20μm~200μm的稱小型浮游生物(microplankton或netplankton);粒徑為200μm～2000μm的稱中型浮游生物(mesoplankton);粒徑為2000μm～20mm之間的，稱為大型浮游生物(macroplankton);粒徑大于20mm的稱巨型浮游生物(megaplankton)。此外，魚類浮游生物(ichthyoplankton)即為魚卵和仔稚魚。距離抽樣distancesampling利用不同距離和生境內(nèi)的鳥類辨識(shí)技術(shù)，在一定范圍或距離內(nèi)估算鳥類數(shù)量，收集生態(tài)種群數(shù)據(jù)。2抽樣方法包括樣點(diǎn)法和樣帶法。在一定時(shí)間內(nèi)，觀察者于固定的觀察點(diǎn)對(duì)鳥類進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)的方法，可以用于估計(jì)鳥類種群的相對(duì)密度，也可與距離估測(cè)結(jié)合計(jì)算絕對(duì)密度。該方法適用于調(diào)查高度可見(jiàn)的、鳴叫的以及在廣闊生境中的在一定時(shí)間內(nèi)，觀察者沿固定的線路行進(jìn)，并對(duì)線路兩側(cè)所見(jiàn)到的鳥類進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)的方法，行進(jìn)方式在陸地上可以是沿樣帶行走、駕車，在海上可行船，或在空中飛行。該方法適用于調(diào)查高度開(kāi)放生境中的鳥類，也適用于調(diào)查離開(kāi)海岸的海鳥和水鳥。微生物源示蹤microbialsourcetracking以某些具有代表性的微生物作為示蹤因子，對(duì)環(huán)境樣品中的污染物質(zhì)進(jìn)行跟蹤溯源的監(jiān)測(cè)技術(shù)。將獨(dú)有的基因片段作為特異性的指紋標(biāo)記，用以判斷基因來(lái)源而構(gòu)建的比對(duì)用數(shù)據(jù)庫(kù)。沉積物毒性檢驗(yàn)sedimenttoxicit通過(guò)將試驗(yàn)生物直接暴露于沾污沉積物的方法來(lái)確定沉積物中污染物質(zhì)的生物效應(yīng)。在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)在清潔沉積物或海水中按一定濃度加入一種或幾種具有潛在毒性化學(xué)物質(zhì)的過(guò)程。沉積物毒性檢驗(yàn)試驗(yàn)中加入試驗(yàn)容器里面固相沉積物上面的試驗(yàn)海水。4浮游病毒總數(shù)——染色計(jì)數(shù)法4.1適用范圍本方法適用于海水中浮游病毒的豐度檢測(cè)。4.2方法原理熒光染料SYBRGreenI與病毒核酸嵌合，在熒光顯微鏡藍(lán)色光激發(fā)下呈針扎狀、亮綠色。根據(jù)顆粒大小分辨浮游病毒。4.3儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)落射熒光顯微鏡；3e)離心管：5mL～15mL,用5%HCl溶液浸泡1d以上，經(jīng)0.02μm濾膜過(guò)濾的蒸餾水漱洗并高壓滅菌；f)無(wú)色指甲油。4.4試劑及其配制試劑及其配制要求如下：a)戊二醛溶液：市售分析純級(jí)；b)SYBRGreenI:市售，冷凍暗保存；c)10%p-苯二胺儲(chǔ)備液：避光冷凍保存；d)PBS甘油儲(chǔ)備液：將50%的PBS(8.5gNaCl,2.2gNa?HPO?,0.15gNaH?PO?,1000mL蒸餾水，pH值為7.5)和體積分?jǐn)?shù)為50%的甘油混合，冷藏保存。4.5樣品采集與處理樣品采集詳細(xì)信息記錄于表A.1。取水樣15mL～50mL置于滅菌離心管中，加固定劑戊二醛溶液至終濃度為0.5%;避光冷藏保存，應(yīng)在7d內(nèi)分析；超低溫(一80℃)避光保存，宜在30d內(nèi)分析完畢。4.6分析步驟分析步驟如下：a)濾器裝配：長(zhǎng)期未用的濾器應(yīng)先裝好濾器和抽濾裝置，用經(jīng)0.02μm濾膜過(guò)濾的高壓滅菌蒸餾水加滿濾筒并抽濾清洗2次～3次(當(dāng)天使用的濾器，在各個(gè)樣品測(cè)定前用同樣方法清洗一次，清洗時(shí)不應(yīng)取下襯墊濾膜);卸下濾筒在襯墊濾膜上放置氧化鋁濾膜，裝配好濾筒。b)配制染色劑：取出SYBRGreenI,用經(jīng)0.02μm濾膜過(guò)濾的無(wú)菌去離子水按1:10稀釋，操作應(yīng)在弱光環(huán)境中進(jìn)行，未用完的染色劑應(yīng)立即避光冷凍保存。c)配制熒光保護(hù)劑工作液：取10%的p-苯二胺儲(chǔ)備液，化霜、搖勻后吸取10μL與990μLPBS甘油儲(chǔ)備液混合，制成工作液。d)加樣：加入0.1mL～2mL樣品(視野病毒數(shù)控制在200個(gè)以下),若樣品量少于1mL則應(yīng)加入經(jīng)0.02μm濾膜過(guò)濾的超純水稀釋至1mL,再加樣。e)抽濾：在負(fù)壓15kPa～20kPa條件下，把樣品抽濾至干。f)染色：用移液器吸取97.5μL經(jīng)0.02μm濾膜過(guò)濾的無(wú)菌去離子水，滴入干凈的無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿，再加入2.5μL10%的SYBRGreenI染色劑工作液(染色劑濃度為0.25%),取下氧化鋁濾膜，將膜的非載樣面放在培養(yǎng)皿的染色液上，冰浴、避光染色15min。g)制片：染色后，取出濾膜，吸干濾膜背面及邊緣的液滴，把濾膜緊貼于滅菌載玻片上(載樣面朝上),加30μL熒光保護(hù)劑，加上蓋玻片，濾膜上下兩面均不應(yīng)有氣泡，用無(wú)色指甲油密封蓋玻片四周，制片可冷凍保存30d。h)計(jì)數(shù)：在熒光顯微鏡藍(lán)色濾光片、油鏡下觀測(cè)，病毒顆粒呈針扎狀、亮綠色，細(xì)菌亦呈亮綠色，但其亮度強(qiáng)于病毒顆粒，且菌體比病毒顆粒大得多。隨機(jī)選取至少20個(gè)視野，計(jì)算病毒顆粒數(shù)。記錄總數(shù)不少于300個(gè)病毒顆粒。4.7記錄和計(jì)算將記錄和計(jì)算結(jié)果記入表A.2中。4 (1)4.8注意事項(xiàng)d)未用完的10%p-苯二胺儲(chǔ)備液應(yīng)立即冷凍保存，但累計(jì)凍、融不應(yīng)超過(guò)3次；如果儲(chǔ)備液呈棕見(jiàn)4.2。g)其他儀器設(shè)備見(jiàn)4.3。5c)加入經(jīng)0.02μm氧化鋁膜過(guò)濾的戊二醛滅菌海水溶液4mL(終濃度2%),冷藏保存直到c)用旋渦振蕩器振動(dòng)樣品1min,于1000r/min條件下離心1min;見(jiàn)4.6: (2)c)其他見(jiàn)4.8。66弧菌總數(shù)——平板計(jì)數(shù)法按《海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)范第3部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查》的要求執(zhí)行。7腸球菌——最大可能數(shù)法(MPN)和濾膜法按《海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)范第3部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查》的要求執(zhí)行。8糞大腸菌群——測(cè)試片法8.1適用范圍本方法包括直接計(jì)數(shù)法與最大可能數(shù)(mostprobablenumber,簡(jiǎn)稱MPN)計(jì)數(shù)法，當(dāng)兩種方法所獲結(jié)果發(fā)生矛盾時(shí)，以直接計(jì)數(shù)法為仲裁方法。8.2直接計(jì)數(shù)法大腸菌群測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的培養(yǎng)基，含有紫羅蘭紅膽汁(VRB)培養(yǎng)基、冷水可溶性凝膠和氯化三苯四氮唑(TTC)指示劑等，可增強(qiáng)大腸菌群菌落的計(jì)數(shù)效果。同時(shí)該培養(yǎng)基系統(tǒng)表面覆蓋的膠膜可截留發(fā)酵乳糖而產(chǎn)生的氣體，因此紅色菌落周圍有氣泡形成。44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h后計(jì)數(shù)周圍有氣泡的紅色菌落數(shù)，即為糞大腸菌群數(shù)，亦稱耐高溫大腸菌群數(shù)。8.2.2儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)超凈工作臺(tái)；b)恒溫培養(yǎng)箱：44.5℃±0.5℃;c)干熱滅菌箱；d)冰箱：2℃~5℃;e)高壓蒸汽滅菌器；g)天平或電子秤：感量0.1g;i)無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm;j)無(wú)菌試管：180mm×18mm;k)無(wú)菌采水瓶、擊開(kāi)式采水器；m)大腸菌群測(cè)試片壓板：1mL,5mL;n)移液器及其吸頭或無(wú)菌吸管1mL、10mL;o)75%酒精棉球；q)一次性無(wú)菌乳膠手套；7r)一次性無(wú)菌塑料袋；t)采集網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類、甲殼類的手撈網(wǎng)；u)滅菌玻璃研缽或均質(zhì)器(旋刀式或拍擊式);v)放大鏡、菌落計(jì)數(shù)器或菌落自動(dòng)判讀儀。8.2.3試劑和測(cè)試片試劑和測(cè)試片如下：a)生理鹽水：參見(jiàn)附錄B;b)高靈敏度大腸菌群測(cè)試片；c)大腸菌群測(cè)試片。8.2.4樣品采集與預(yù)處理8.2.4.1海水樣品海水樣品的采集和預(yù)處理如下：a)采集：根據(jù)需要使用擊開(kāi)式采水器和無(wú)菌采水瓶采取表層或其他水層海水樣品100mL~200mL,并立即冷藏保存，24h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)分析，細(xì)菌(真菌)計(jì)數(shù)表要求記錄采樣b)預(yù)處理：無(wú)菌移取海水樣品5mL至裝有45mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10-1稀釋樣品；依此類推，無(wú)菌移取10-1稀釋樣品5mL至裝有45mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10-2稀釋樣品。8.2.4.2沉積物樣品沉積物樣品的采集和預(yù)處理如下：a)采集：用無(wú)菌刀先刮去采泥器采取的表層沉積物表面，再用無(wú)菌勺根據(jù)需要挖取約100g~200g沉積物樣品并裝入無(wú)菌塑料袋中，擠出袋內(nèi)空氣，將袋口扎好，做好標(biāo)簽，再將此袋和做好的標(biāo)簽一起放入另一個(gè)無(wú)菌袋中。將外層袋內(nèi)空氣擠出、袋口扎好，冷藏保存，24h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)分析，細(xì)菌(真菌)計(jì)數(shù)表要求記錄采樣時(shí)間、現(xiàn)場(chǎng)水溫、鹽度等參見(jiàn)附錄B;b)預(yù)處理：用無(wú)菌不銹鋼勺無(wú)菌移取表層沉積物樣品5g至裝有45mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10-1稀釋樣品；再無(wú)菌移取10-1沉積物稀釋樣品5mL至裝有45mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10-2稀釋樣品；依此類推，可以制備生物樣品的采集和預(yù)處理程序如下：a)采集：1)采集貽貝、牡蠣等附著性貝類，首先將刮刀用酒精棉球消毒，然后用刮刀將貽貝或牡蠣從附著物上采集下來(lái)。再帶好一次性消毒手套隨機(jī)選取無(wú)機(jī)械損傷的活貝樣品于無(wú)菌塑料袋中，每個(gè)樣品根據(jù)需求和采集對(duì)象的規(guī)格，采集5個(gè)～30個(gè)(能剖出10g～80g鮮重貝肉)即可。擠出袋內(nèi)空氣，將袋口扎好，做好標(biāo)簽，再將此袋和做好的標(biāo)簽一起放入另一個(gè)無(wú)菌袋中。將外層袋內(nèi)空氣擠出、袋口扎好，冷藏保存，24h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)82)采集文蛤、雜色蛤、四角蛤蜊等底埋性貝類，首先將耙貝類耙子用酒精棉球消毒，耙取底埋貝類，然后再戴好一次性消毒手套將耙出的貝類樣品采集到無(wú)菌塑料袋中。把樣品裝入無(wú)菌袋中，做好標(biāo)簽、扎好袋口，做好記錄，樣品及時(shí)冷藏保存。3)采集浮筏養(yǎng)殖的海帶、裙帶菜等大型藻類樣品，首先將剪取樣品的剪刀用酒精棉球消毒，然后再戴好一次性消毒手套剪取大型藻類樣品并裝入無(wú)菌塑料袋中，做好標(biāo)簽、記錄，樣品及時(shí)冷藏保存。4)采集網(wǎng)箱養(yǎng)殖的魚類、甲殼類樣品，首先將撈取樣品的手抄網(wǎng)用紫外線消毒，然后再戴好一次性消毒手套撈取養(yǎng)殖的魚類、甲殼類樣品，并裝入無(wú)菌塑料袋中，做好標(biāo)簽、記錄，樣品及時(shí)冷藏保存。上述各種生物樣品采集的同時(shí)細(xì)菌(真菌)計(jì)數(shù)表要求記錄采樣時(shí)間、現(xiàn)場(chǎng)水溫、鹽度等參見(jiàn)附錄B。所有生物樣品都應(yīng)在24h內(nèi)送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)分析。b)預(yù)處理：無(wú)菌剖(剪)取生物樣品5g,并剪碎至無(wú)菌玻璃研缽中，無(wú)菌研磨成肉糜后加入45mL無(wú)菌生理鹽水，充分稀釋，制備成10-1稀釋樣品；再無(wú)菌移取10-1稀釋樣5mL至裝有45mL無(wú)菌生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶中，充分稀釋，制備成10-2稀釋樣；依此類推，可以制備10-3、10-4稀釋樣品。8.2.5檢驗(yàn)操作程序檢驗(yàn)操作程序如圖1所示。5g(5g(mL)(海水、沉積物、生物)樣品圖1糞大腸菌群測(cè)試片直接計(jì)數(shù)法檢測(cè)程序8.2.6接種和培養(yǎng)8.2.6.1大腸菌群測(cè)試片接種和培養(yǎng)根據(jù)所采集樣品性質(zhì)和檢測(cè)目的需要，選取1個(gè)～2個(gè)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋液平行接種93張測(cè)試片。將大腸菌群檢驗(yàn)測(cè)試片置于超凈工作臺(tái)上，揭開(kāi)上層膜，用移液器吸取樣品稀釋液1mL垂直滴加在測(cè)試片的中央處，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生；把壓板(平面底朝下)放置在上層膜中央處，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面上(切勿扭轉(zhuǎn)壓板),拿起壓板，靜置至少1min使培養(yǎng)基凝固；將測(cè)試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不應(yīng)超過(guò)20片，44.5℃±0.5℃培養(yǎng)8.2.6.2高靈敏度大腸菌群測(cè)試片接種和培養(yǎng)根據(jù)所采集樣品性質(zhì)和檢測(cè)目的需要，選取1個(gè)～2個(gè)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋液平行接種3張測(cè)試片。將高靈敏度大腸菌群測(cè)試片置于超凈工作臺(tái)上，揭開(kāi)上層膜，用移液器吸取樣品稀釋液5mL垂直滴加在測(cè)試片的中央處，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生，把壓板放置在上層膜中央處，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面上(不應(yīng)扭轉(zhuǎn)壓板),拿起壓板，靜置2min～5min使培養(yǎng)基凝固。將測(cè)試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不應(yīng)超過(guò)10片，44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。8.2.7菌落計(jì)數(shù)與判讀選擇菌落數(shù)在15個(gè)～150個(gè)之間的測(cè)試片，目視或使用放大鏡、菌落計(jì)數(shù)器以及自動(dòng)判讀儀來(lái)計(jì)數(shù)菌落數(shù)。在大腸菌群測(cè)試片上，紅色有氣泡的菌落確認(rèn)為糞大腸菌群。將測(cè)試片圓形面積內(nèi)的菌落數(shù)計(jì)為糞大腸菌群數(shù)，培養(yǎng)圓形面積邊緣上及邊緣以外的菌落不作計(jì)數(shù)。當(dāng)培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡、大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明糞大腸菌群的濃度較高，需要進(jìn)一步稀釋樣品來(lái)獲得準(zhǔn)確的糞大腸菌群數(shù)。在高靈敏度大腸菌群測(cè)試片上，紅色有氣泡的菌落被確認(rèn)為糞大腸菌群。當(dāng)糞大腸菌群大量產(chǎn)酸時(shí)，菌落周圍會(huì)產(chǎn)生粉紅色的菌暈使計(jì)數(shù)更加方便。當(dāng)培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡、大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明糞大腸菌群的濃度較高，需要進(jìn)一步稀釋樣品來(lái)獲得準(zhǔn)確的糞大腸菌群數(shù)。8.2.8結(jié)果報(bào)告3張大腸菌群測(cè)試片上菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為每克(或每毫升)樣品中糞大腸菌群數(shù)，以“CFU/g(mL)”表示；3張高靈敏度大腸菌群測(cè)試片上菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為每5g(或5mL)樣品中糞大腸菌群數(shù)，以“CFU/g(mL)”表示應(yīng)再除以5。所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)作報(bào)告。所有稀釋度的菌落數(shù)都大于150個(gè)時(shí)，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作報(bào)告，當(dāng)測(cè)試片上菌落數(shù)大于150個(gè)時(shí)，可計(jì)數(shù)1個(gè)或2個(gè)具有代表性的方格(1cm2)內(nèi)的菌落數(shù)，單個(gè)方格內(nèi)的菌落數(shù)乘以培養(yǎng)面積即為測(cè)試片上估算的菌落數(shù)(大腸菌群測(cè)試片培養(yǎng)面積為20cm2,高靈敏度大腸菌群測(cè)試片培養(yǎng)面積為60cm2)。所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15個(gè)，則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作報(bào)告。8.3MPN計(jì)數(shù)法8.3.1MPN法檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖2。24h±2h見(jiàn)8.2.4:選取3個(gè)稀釋度的樣品(海水樣品可包括原水樣),每個(gè)稀釋度接種3張測(cè)試片(如：海水樣品可取3個(gè)原水樣、3個(gè)10-1稀釋樣、3個(gè)10-2稀釋樣各1mL接種到大腸菌群測(cè)試片中)。將大腸菌群測(cè)試片箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不應(yīng)超過(guò)20片，44.5℃±0.5℃培養(yǎng)24h±2h。結(jié)果計(jì)算與判讀見(jiàn)8.2.7,根據(jù)糞大腸菌群陽(yáng)性測(cè)試片數(shù)，查M檢測(cè)過(guò)程中的所有培養(yǎng)物收集后，應(yīng)經(jīng)121℃高壓滅菌15min處理。所有廢棄物應(yīng)小心處置，并9分級(jí)葉綠素a——熒光法9.1適用范圍本方法適用于海洋生物生態(tài)監(jiān)測(cè)分級(jí)葉綠素a的樣品采集、分析及資料整理。9.2方法原理通過(guò)不同孔徑的濾膜把不同粒徑的浮游植物分別截留下來(lái)，對(duì)不同粒度的浮游植物進(jìn)行分級(jí)測(cè)量。粒級(jí)分為20μm～200μm(小型)、2μm～20μm(微型)和小于2μm(微微型)。葉綠素a的丙酮萃取液受藍(lán)光激發(fā)產(chǎn)生紅色熒光，過(guò)濾一定體積海水所得的浮游植物用90%丙酮提取其色素，使用熒光計(jì)測(cè)定提取液酸化前后的熒光值，計(jì)算出海水中葉綠素a的濃度。9.3一般規(guī)定9.3.1技術(shù)設(shè)計(jì)與要求技術(shù)設(shè)計(jì)內(nèi)容包括：監(jiān)測(cè)計(jì)劃編制及監(jiān)測(cè)項(xiàng)目、監(jiān)測(cè)要素、監(jiān)測(cè)站位、監(jiān)測(cè)方法、監(jiān)測(cè)時(shí)間、監(jiān)測(cè)頻率、監(jiān)測(cè)船只要求、監(jiān)測(cè)人數(shù)及其專業(yè)素質(zhì)、器材設(shè)備、預(yù)期成果等。葉綠素a分級(jí)監(jiān)測(cè)宜與化學(xué)、水文物理等同船、同站、同步監(jiān)測(cè)。9.3.2監(jiān)測(cè)方式分為大面觀測(cè)、斷面觀測(cè)和連續(xù)觀測(cè)等幾種。9.3.2.1樣品采集方法和種類采用采水器(瓶)采集葉綠素a樣品進(jìn)行測(cè)定。采集水層規(guī)定見(jiàn)表1。表1水樣采集層次測(cè)站水深范圍225表層、5、10、30、50、75、100、150、底層表層、5、10、30、50、75、100、注1:表層指海面下深度0.5m以內(nèi)的水層；注2:水深小于50m時(shí)，底層為離底2m的水層；注3:水深在50m～200m時(shí)，底層為離底5m的水層；注4:可根據(jù)調(diào)查的特殊需要，酌情增加200m以深的采水層次；注5:條件許可時(shí)，應(yīng)充分考慮躍層和采集葉綠素次表層最大值9.3.2.2監(jiān)測(cè)時(shí)間、監(jiān)測(cè)頻率和季節(jié)劃分受氣象、流系季節(jié)性影響的邊緣海應(yīng)每季度監(jiān)測(cè)一次；受氣候、水文季節(jié)性影響且物質(zhì)來(lái)源復(fù)雜的河口、港灣和沿岸海域，至少每月監(jiān)測(cè)一次，如有特殊需要可酌情增加監(jiān)測(cè)次數(shù)。在逐季、逐月調(diào)查中，各季、各月監(jiān)測(cè)的時(shí)間間隔應(yīng)基本相等。進(jìn)行河口、港灣監(jiān)測(cè)時(shí)，應(yīng)充分考慮潮期的影響。一般以3月～5月為春季，6月～8月為夏季，9月～11月為秋季，12月～翌年2月為冬季。在一年4次監(jiān)測(cè)中，亦可以5月、8月、11月和2月的調(diào)查分別代表春、夏、秋和冬四季的監(jiān)測(cè)。但在熱帶海域應(yīng)根據(jù)具體的海洋環(huán)境條件和監(jiān)測(cè)目的酌情調(diào)整監(jiān)測(cè)時(shí)間和監(jiān)測(cè)次數(shù)。9.3.2.3定位按GB/T12763.1中的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。9.3.3出海準(zhǔn)備海上所需物品，均應(yīng)計(jì)算實(shí)用量和備用量；儀器設(shè)備的安裝，工具器皿的存放等，應(yīng)以安全、方便為基本原則。9.3.4儀器設(shè)備9.3.5樣品采集9.3.5.1采樣要求9.3.5.1.1采樣位置現(xiàn)場(chǎng)采樣時(shí)，應(yīng)避開(kāi)監(jiān)測(cè)船的排污口。9.3.5.1.2海水樣品的采集采水器入水前應(yīng)檢查球蓋是否打開(kāi)，出水閥是否關(guān)閉，準(zhǔn)確放至預(yù)定水層。應(yīng)按GB/T12763.1有關(guān)規(guī)定進(jìn)行記錄。樣品采集、分析、鑒定和測(cè)定記錄表見(jiàn)表A.3和表A.4。9.3.6樣品分析應(yīng)按GB/T12763.1有關(guān)規(guī)定的具體要求處理。9.4技術(shù)要求和測(cè)定要素9.4.1技術(shù)要求9.4.1.1精密度葉綠素a濃度在0.5mg/m3水平時(shí)，重復(fù)樣品的相對(duì)誤差為±10%。9.4.1.2儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)熒光計(jì)：激發(fā)光波長(zhǎng)450nm,發(fā)射光波長(zhǎng)685nm;b)抽濾裝置：包括濾器、支架、抽濾瓶和真空泵；c)玻璃纖維濾膜：其截留效率相當(dāng)于0.65μm孔徑的聚碳酸酯微孔濾膜；d)冰箱。9.4.1.3.1丙酮：體積分?jǐn)?shù)為90%。9.4.1.3.2鹽酸：體積分?jǐn)?shù)為10%。用90%丙酮提取其葉綠素a,或者用90%丙酮溶解一定量的市售葉綠素a結(jié)晶，濃度約為p=1mg/L。9.4.1.3.6葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：用9.4.1.3.4中的標(biāo)準(zhǔn)葉綠素a溶液配制濃度不同的標(biāo)準(zhǔn)工9.4.1.3.7換算系數(shù)Fa的測(cè)定：上述不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在a)采水量：過(guò)濾海水的體積視監(jiān)測(cè)海區(qū)而定，富營(yíng)養(yǎng)海區(qū)可過(guò)濾50cm3~100cm3;中營(yíng)養(yǎng)海區(qū)可過(guò)濾200cm3~500cm3;寡營(yíng)養(yǎng)海區(qū)可過(guò)濾500cm3~1000cm3;接用0.65μm玻璃纖維濾膜過(guò)濾，另一份依次通過(guò)20μm篩絹(無(wú)抽濾負(fù)壓條件)、2μm核孔濾膜和0.65μm玻璃纖維濾膜三種規(guī)格b)每批樣品測(cè)定前后，以90%丙酮作對(duì)比液，測(cè)出各量程擋d)加1滴體積分?jǐn)?shù)為10%鹽酸于測(cè)定池中，30s后測(cè)定其熒光值R。;9.5.1.2按式(5)計(jì)算水柱葉綠素a的含量： (6)測(cè)試結(jié)果記入表A.4。等值線取值標(biāo)準(zhǔn)(單位為mg/m3):0.10,0.20,0.30,0.50,0.75,1.00,1.50,2,00,3.00,5.00,10.00。以上取值標(biāo)準(zhǔn)，可視具體情況增減。10.1適用范圍本方法適用于海水中的分級(jí)初級(jí)生產(chǎn)力的調(diào)查與監(jiān)測(cè)。把一定數(shù)量的放射性碳酸氫鹽H1*CO?-(或碳酸鹽1?CO?2-)加入到已知二氧化碳濃度的海水樣品中，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間培養(yǎng)，測(cè)定浮游植物細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)1?C活度，計(jì)算浮游植物光合作用速率。根據(jù)光合作用速率和粒徑分級(jí)方法，計(jì)算得到分級(jí)初級(jí)生產(chǎn)力。儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)水下光量子儀或透明度盤；b)液體閃爍計(jì)數(shù)儀、通風(fēng)櫥和振蕩器；c)樣品培養(yǎng)箱或培養(yǎng)瓶罩：用中性衰光材料，將光衰減為100%、50%、30%、10%、3%和1%;e)濾膜：直徑25mm、孔徑為0.65μm的玻璃纖維濾膜(GF/F);孔徑為2μm的聚碳酸脂核孔濾f)1mL～10mL移液器及配套的吸液頭；g)100mL～250mL培養(yǎng)瓶：2%稀鹽酸浸泡24h以上，經(jīng)蒸餾水清洗數(shù)次；h)5L無(wú)菌瓶；i)采水器：不透光且沒(méi)有銅制部件。10.4試劑及其配制試劑及其配制要求如下：a)過(guò)濾海水：用調(diào)查海區(qū)的海水，經(jīng)GF/F濾膜過(guò)濾，置于無(wú)菌瓶中備用；b)1“C工作溶液：用過(guò)濾海水稀釋NaH*CO?,使放射性濃度約為1.850kBq/mL;采集水樣應(yīng)使用不透光和沒(méi)有銅制部件的采水器，水樣避免陽(yáng)光直射。10.5.2采樣深度的確定采樣水層確定如下：a)真光層深度的確定：使用水下光量子儀，測(cè)定表層海水光強(qiáng)和1%表層光強(qiáng)值，得到真光層深b)當(dāng)真光層深度不大于3m時(shí)，僅采表層水樣；c)當(dāng)真光層深度大于3m、不大于10m時(shí)，采表層(100%)、10%和1%表層光強(qiáng)層次水樣；d)當(dāng)真光層深度大于10m時(shí)，采100%和光衰減至50%、30%、10%、3%和1%光強(qiáng)層次水樣； (7) (8)黑瓶，表層樣品和10%表層光強(qiáng)水體樣品還應(yīng)各分裝一個(gè)零時(shí)間培養(yǎng)瓶(或根據(jù)現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查情況選定),取相同體積的1*C工作溶液加至每個(gè)培養(yǎng)瓶。所加數(shù)量視樣品中浮游植物多少和培養(yǎng)時(shí)間而定。宜在水深小于200m,培養(yǎng)24h,加37kBq～370kBq,水深大于200m加370kBq～740kBq。培養(yǎng)時(shí)間宜在2h～24h之間。入0.5mL的0.5mol/L鹽酸，15min后加蓋。或在通風(fēng)櫥內(nèi)以濃鹽酸蒸汽熏蒸濾膜15min,放入閃爍瓶.過(guò)濾后的濾膜載物面朝上平鋪于閃爍瓶底，冷凍保存。在通風(fēng)櫥內(nèi)，每個(gè)閃爍瓶中加入0.5mL向裝有濾膜的閃爍瓶加入10mL閃爍液，在振蕩器上振蕩至少20min,將閃爍瓶置于液體閃爍計(jì)數(shù)儀內(nèi)使樣品暗適應(yīng)12h后測(cè)定放射性活度，并記錄p(C)=(0.067S-0.05)×0.96×12000 (9)式中：p(C)——海水中二氧化碳的總濃度(以C計(jì)),單位為毫克每立方米(mg/m3);b)直接測(cè)定海水中的二氧化碳濃度式中：Pv——海洋初級(jí)生產(chǎn)力(以C計(jì)),單位為a)小型浮游植物初級(jí)生產(chǎn)力是20μm孔寬的篩絹截留所測(cè)值；b)微型浮游植物初級(jí)生產(chǎn)力是孔徑2μm的核孔濾膜截留所測(cè)值減去a)的結(jié)果；c)微微型浮游植物初級(jí)生產(chǎn)力是GF/F濾膜截留所測(cè)值減去b)結(jié)果。Ps——水柱初級(jí)生產(chǎn)力，單位為毫克每平方米小時(shí)[mg/(m2·h)];將計(jì)算結(jié)果記錄在表A.5中。e)將水柱初級(jí)生產(chǎn)力單位mg/(m2·h)轉(zhuǎn)化為mg/(m2·d)時(shí)，根據(jù)各地實(shí)際(緯度和季節(jié))光12.2方法原理根據(jù)微微型浮游植物所含色素?zé)晒馓匦缘牟煌?，利用熒光顯微鏡的藍(lán)色(410nm～490nm)和綠色(510nm～560nm)濾光片可將微微型浮游植物分為單細(xì)胞的聚球藻藍(lán)細(xì)菌和微微型光合真核生物。12.3儀器及設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)落射熒光顯微鏡應(yīng)配備藍(lán)色和綠色濾光片；c)醋酸纖維濾膜，直徑25mm,孔徑0.2μm、0.45μm;e)樣品保存瓶：50mL螺蓋塑料瓶，用5%的HCl溶液浸泡1d以上，并經(jīng)0.2μm醋酸纖維濾膜過(guò)濾的蒸餾水漱洗并高壓滅菌。戊二醛溶液(分析純級(jí))或多聚甲醛溶液(10%)。12.5樣品采集與分析12.5.1采樣操作與樣品保存采樣操作與樣品保存如下：a)水樣采集使用無(wú)菌采水器進(jìn)行采集，水樣采集詳細(xì)信息記錄于表A.1;b)按照表1規(guī)定的采樣層次，采集50mL水樣，并用孔徑20μm的篩絹過(guò)濾。然后加戊二醛或多聚甲醛溶液固定(終濃度1%),冷藏避光保存至實(shí)驗(yàn)室分析。12.5.2分析步驟分析步驟如下：a)利用黑色核孔濾膜，過(guò)濾10mL～50mL水樣，負(fù)壓不應(yīng)超過(guò)50kPa;b)將黑色核孔濾膜取出放在載玻片上，載物面朝上，在濾膜上加一滴無(wú)菌蒸餾水，蓋上蓋玻片，濾膜兩面均不應(yīng)有氣泡；c)在落射熒光顯微鏡下使用藍(lán)色激發(fā)光，40倍物鏡觀察，應(yīng)隨機(jī)選取至少20個(gè)視野。分別計(jì)數(shù)具有橘黃色熒光的含藻紅蛋白的聚球藻細(xì)胞和呈磚紅色熒光的含葉綠素的微微型光合真核生物細(xì)胞。綠色激發(fā)光用來(lái)輔助觀測(cè)校對(duì)，一般情況下綠色激光下記錄的紅色顆粒為所有微微型浮游光合生物。記錄總數(shù)應(yīng)大于200個(gè)；d)計(jì)數(shù)結(jié)果記錄于表A.6中。12.6記錄與計(jì)算微微型浮游植物豐度單位以個(gè)/mL表示。落射熒光顯微鏡測(cè)試結(jié)果按式(14)計(jì)算：式中：N——樣品中細(xì)胞豐度，單位為個(gè)每毫升(個(gè)/mL);N?——各視野平均細(xì)胞數(shù)，單位為個(gè)；S——濾膜濾水面積，單位為平方厘米(cm2);S?——顯微鏡視野面積，單位為平方厘米(cm2);f——所加固定劑終濃度；V——過(guò)濾樣品體積，單位為毫升(mL)。計(jì)算結(jié)果記錄表格式見(jiàn)表A.6。12.6.3繪制分布圖分布圖的繪制要求如下：a)用繪圖軟件繪制微微型浮游植物細(xì)胞豐度平面分布圖；b)平面分布圖一般用等值線表示，豐度取值標(biāo)準(zhǔn)為5,10,50,100,500,1000,5000,10000(單位為個(gè)/mL)。以上取值標(biāo)準(zhǔn)，可視具體情況酌情增減。12.7注意事項(xiàng)本試驗(yàn)執(zhí)行中應(yīng)注意的事項(xiàng)如下：a)對(duì)懸浮物含量較高的樣品，應(yīng)在分析前靜置10h以上；b)樣品應(yīng)在30d內(nèi)分析完畢；c)熒光顯微鏡操作宜在暗室環(huán)境中進(jìn)行。13微型浮游生物——顯微鏡個(gè)體計(jì)數(shù)法13.1適用范圍本方法適用于海洋生物生態(tài)監(jiān)測(cè)微型浮游生物的樣品采集、分析測(cè)試及資料整理。13.2方法原理將少量待測(cè)樣品的混勻懸浮液置于浮游植物計(jì)數(shù)框中，按照微型浮游生物分類原則，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)和分類。13.3一般規(guī)定13.3.1技術(shù)設(shè)計(jì)與要求技術(shù)設(shè)計(jì)內(nèi)容包括，監(jiān)測(cè)計(jì)劃編制及監(jiān)測(cè)項(xiàng)目、監(jiān)測(cè)要素、監(jiān)測(cè)站位、監(jiān)測(cè)方法、監(jiān)測(cè)時(shí)間、監(jiān)測(cè)頻率、監(jiān)測(cè)船只要求、監(jiān)測(cè)人數(shù)及其專業(yè)素質(zhì)、器材設(shè)備、預(yù)期成果等。微型浮游生物監(jiān)測(cè)時(shí)，宜與化學(xué)、水文物理等同船、同站、同步監(jiān)測(cè)。13.3.2監(jiān)測(cè)方式生物監(jiān)測(cè)的方式有大面觀測(cè)、斷面觀測(cè)和連續(xù)觀測(cè)等幾種。用采水器(瓶)采集微型浮游生物樣品。采集水層規(guī)定見(jiàn)表1。見(jiàn)9.3.2.2:h)取樣管；k)支架。13.5試劑及其配制13.6樣品采集13.6.2采樣要求13.6.2.1采樣位置海洋生物監(jiān)測(cè)現(xiàn)場(chǎng)采樣時(shí)，應(yīng)避開(kāi)監(jiān)測(cè)船的排污口。13.6.2.2采水量水深大于200m的海區(qū)，每次采水不少于1000mL;水深小于200m的海區(qū)不少于500mL;發(fā)生富營(yíng)養(yǎng)化或赤潮海區(qū)視具體情況而定，每次采水100mL。13.6.2.3樣品采集與保存樣品采集與保存步驟如下：a)用采水器采水，入水前應(yīng)檢查采水器的球蓋是否打開(kāi)，出水閥是否關(guān)閉，準(zhǔn)確放至預(yù)定水層；b)主要采集特定水層個(gè)體2μm～20μm的微型金藻、微型甲藻、微型硅藻、無(wú)殼纖毛蟲和領(lǐng)鞭蟲等樣品；c)按預(yù)定水層和規(guī)定量采集水樣。如需去除大于20μm的生物，可先用孔徑20μm的篩絹預(yù)過(guò)濾。將采集好水樣裝入采樣瓶?jī)?nèi)，樣品用魯哥氏液固定，每1L水樣加入10mL～15mL,根據(jù)樣品的實(shí)際濃度可作適當(dāng)增減；d)如需要對(duì)樣品做電鏡觀察分析，則選用戊二醛固定，根據(jù)樣品濃度可加入樣品體積的e)分析、測(cè)量、鑒定后的樣品，可依資料分析、應(yīng)用程度和學(xué)術(shù)價(jià)值高低確定全部或部分保留。各監(jiān)測(cè)項(xiàng)目均應(yīng)按GB/T12763.1有關(guān)規(guī)定進(jìn)行記錄。樣品采集、分析、鑒定和測(cè)定記錄表的格式見(jiàn)表A.7～表A.12。遇異常現(xiàn)象或新發(fā)現(xiàn)，除進(jìn)行筆錄外還應(yīng)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)攝像或錄像。13.7樣品分析13.7.1樣品編號(hào)各類樣品應(yīng)有總編號(hào)?？偩幪?hào)由代表采樣海區(qū)、采樣方式、使用網(wǎng)型、采樣年份和樣品序號(hào)等內(nèi)容的代號(hào)依次組成，每份貯存樣品的瓶外應(yīng)貼有總編號(hào)的外標(biāo)簽，瓶?jī)?nèi)應(yīng)放有總編號(hào)、站號(hào)和采樣日期等內(nèi)容的內(nèi)標(biāo)簽(見(jiàn)附錄D),填寫表A.8。13.7.2樣品分類鑒定與豐度測(cè)定標(biāo)本鑒定宜采用活體與固定樣品相結(jié)合、網(wǎng)采與水樣樣品相結(jié)合的方法；定量計(jì)數(shù)宜以水樣樣品為準(zhǔn)，水柱的定量計(jì)數(shù)宜以網(wǎng)采樣品為準(zhǔn)。除需作特殊處理的微型浮游生物種類以及培養(yǎng)觀察的特殊類群之外，原則上鑒定到種的標(biāo)本比例在80%以上；鑒定到屬的比例應(yīng)在90%以上。水樣樣品每次實(shí)際標(biāo)本鏡檢數(shù)不少于100個(gè)～200個(gè)。13.7.3沉降計(jì)數(shù)法將混合水樣均勻吸取3個(gè)分樣裝滿3個(gè)等容量(10mL～20mL)的沉降器，蓋上蓋玻片，靜置24h,經(jīng)沉降后分別置于倒置顯微鏡下鑒定計(jì)數(shù)，求其平均單位體積海水中微型浮游生物細(xì)胞總量(單位：個(gè)/mL)。計(jì)數(shù)結(jié)果填入表A.9。水樣浮游生物數(shù)量分別以個(gè)/mL或個(gè)/L表示。豐度計(jì)算方法如下：a)用繪圖軟件繪制微型浮游生物及其優(yōu)勢(shì)種細(xì)胞豐度平面分布圖；b)平面分布圖一般用等值線表示，豐度取值標(biāo)準(zhǔn)為5,10,50,100,500,1000,5000,10000(單位為102個(gè)/L);15.1適用范圍15.2方法原理水深不小于200m的海區(qū)拖網(wǎng)深度為200m至表面垂直拖網(wǎng)，水深小于200m的則由海底至表面水平拖網(wǎng)深度為表層0m～3m。網(wǎng)具名稱網(wǎng)長(zhǎng)網(wǎng)口內(nèi)徑網(wǎng)口面積1生物網(wǎng)拖曳及30m以深、200m以淺垂直采2游生物網(wǎng)適用于30m以淺垂直采集魚卵和高度為5m～6m(深水拖網(wǎng)大于6m)。負(fù)荷為500kg～1000kg;吊桿的舷間距1m左右，并能調(diào)在海水表層(0m～3m)進(jìn)行水平拖網(wǎng)10min～15min,船速為1kn～2kn。所用網(wǎng)具、水層和拖由海底至海面垂直拖網(wǎng)。落網(wǎng)速度為0.5m/s;起網(wǎng)速度為0.5m/s～0.8m/s。所用網(wǎng)具見(jiàn)表2,15.4.2.3樣品處理15.5樣品分析 (18)a)魚卵和仔、稚魚總量(單位為ind/m3或ind/100m3):1,5,10,25,50,100,250,500,1000,b)魚卵和仔、稚魚主要科、屬(單位為ind/m3或ind/100m3):1,5,10,25,50,100,200,300,400,c)數(shù)量小于上述a)、b)等級(jí)時(shí)，可用“+”標(biāo)在測(cè)站上，以示出現(xiàn)；d)取值標(biāo)準(zhǔn)，可視具體情況酌情增減。15.6.2.2圓圈的取值標(biāo)準(zhǔn)圓圈的取值標(biāo)準(zhǔn)如下：a)魚卵和仔、稚魚總量(ind/m3或ind/100m3)為>0～1,>1～10,>10～25,>25～50,>50~100,>100～250,>250～500,>500>25～50,>50～100,>100～200,>200～300,>400～500,>5c)數(shù)量小于上述a)、b)等級(jí)時(shí)，可用“+”標(biāo)在測(cè)站上，以示出現(xiàn)；d)取值標(biāo)準(zhǔn)，可根據(jù)具體情況酌情增減。16珍稀瀕危動(dòng)物調(diào)查——調(diào)訪觀測(cè)法16.1適用范圍本方法適用于海洋珍稀瀕危動(dòng)物的調(diào)訪和觀測(cè)。16.2方法原理以調(diào)訪和觀測(cè)等途徑，對(duì)海洋珍稀瀕危動(dòng)物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)等進(jìn)行查實(shí)。16.3調(diào)訪與觀測(cè)16.3.1技術(shù)要求與調(diào)查要素16.3.1.1技術(shù)要求以調(diào)訪和觀測(cè)等途徑，對(duì)海洋珍稀瀕危動(dòng)物數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)等進(jìn)行查實(shí)。任何觀測(cè)手段或方法，都不應(yīng)威脅到海洋珍稀瀕危動(dòng)物的生命安全。16.3.1.2調(diào)查要素儒艮、中華白海豚和斑海豹的數(shù)量；海龜和鱟的種類和數(shù)量；文昌魚、白蝶貝等的分布、密度、生物量、年齡結(jié)構(gòu)等；重點(diǎn)保護(hù)海鳥的數(shù)量、分布、種群組成等。16.3.2海洋珍稀瀕危游泳動(dòng)物調(diào)訪與觀測(cè)16.3.2.1儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)望遠(yuǎn)鏡(雙筒：7×50;8×40;10×40或單筒);b)長(zhǎng)鏡頭照相機(jī)；d)衛(wèi)星定位儀(GPS);e)羅盤；f)海拔表；g)溫度計(jì)；h)計(jì)數(shù)器。16.3.2.2站位布設(shè)在調(diào)查海域內(nèi)均勻布設(shè)站位，一般每2km2布設(shè)一個(gè)觀測(cè)站位。16.3.2.3調(diào)訪手段與觀測(cè)方式對(duì)儒艮、中華白海豚、斑海豹、海龜、鱟等海洋珍稀瀕危游泳動(dòng)物的調(diào)訪以現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)、攝像與照相為主，亦可采用衛(wèi)星遙感、航空遙感、定點(diǎn)連續(xù)觀測(cè)；目測(cè)個(gè)體的大小、性別、年齡、體重等特征，填寫觀測(cè)記錄格式見(jiàn)表A.17和表A.18;在調(diào)查期間發(fā)現(xiàn)有違捕海洋珍稀瀕危游泳動(dòng)物的，調(diào)查人員應(yīng)及時(shí)趕到現(xiàn)場(chǎng)，并會(huì)同有關(guān)海洋行政管理部門進(jìn)行救治；對(duì)已死亡的海洋珍稀瀕危游泳動(dòng)物應(yīng)制成標(biāo)本。16.3.2.4樣品分析與資料處理統(tǒng)計(jì)海洋珍稀瀕危游泳動(dòng)物在觀測(cè)期間出現(xiàn)的機(jī)率，被違捕個(gè)體的生物學(xué)特征及死亡個(gè)體等，編制海洋珍稀游泳動(dòng)物觀測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表(見(jiàn)表A.18)。16.3.3珍稀瀕危海鳥類調(diào)訪與觀測(cè)16.3.3.1儀器設(shè)備見(jiàn)16.3.2.1.16.3.3.2調(diào)訪手段與觀測(cè)方式16.3.3.2.1站位布設(shè)原則珍稀瀕危海鳥調(diào)訪采用距離抽樣的方法，具體包括樣點(diǎn)法和樣帶法，兩種方法的站位布設(shè)原則為：a)樣點(diǎn)法觀測(cè)站位以每觀測(cè)區(qū)域布設(shè)20個(gè)左右站位，各站位間距應(yīng)不小于200m;b)樣帶法觀測(cè)以每觀測(cè)區(qū)域布設(shè)4條～7條觀測(cè)條帶，各條帶的直線距離不小于500m。16.3.3.2.2樣點(diǎn)法步驟如下：a)確定調(diào)查區(qū)域內(nèi)觀測(cè)點(diǎn)，觀察者在每個(gè)觀測(cè)點(diǎn)等待至鳥類到達(dá)觀測(cè)點(diǎn)并平靜下來(lái)后開(kāi)始計(jì)數(shù)，每一觀測(cè)點(diǎn)計(jì)數(shù)3min～10min;b)每一觀測(cè)點(diǎn)至少進(jìn)行兩次計(jì)數(shù)，一次在鳥類繁殖季節(jié)的前半部，一次在后半部；c)記錄每個(gè)鳥種在每個(gè)觀測(cè)點(diǎn)內(nèi)出現(xiàn)的最大值，每一個(gè)觀測(cè)點(diǎn)應(yīng)用衛(wèi)星定位儀進(jìn)行定位。16.3.3.2.3樣帶法步驟如下：a)確定區(qū)域內(nèi)觀測(cè)樣帶，確定每樣帶調(diào)查觀測(cè)次數(shù)；b)以步行、駕車、駕船、飛行等方式沿設(shè)計(jì)好的觀測(cè)樣帶移動(dòng)，記錄向海一面的鳥類觀測(cè)結(jié)果，包括海面或近岸陸上的鳥類和正在飛行的鳥類；c)記錄移動(dòng)速度和移動(dòng)時(shí)間，計(jì)算樣帶面積(樣帶面積=移動(dòng)速度×移動(dòng)時(shí)間×目測(cè)樣帶寬度),記錄單元可通過(guò)固定時(shí)間或固定距離獲得；估算被記錄鳥類距離觀測(cè)者(樣帶)的距離；d)飛行中的鳥在10min內(nèi)用幾個(gè)瞬間快速調(diào)查計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)在300m寬(由船向外的垂直距離)和前方調(diào)查人員認(rèn)為能夠看見(jiàn)所有鳥的長(zhǎng)度范圍內(nèi)進(jìn)行；與船有聯(lián)系的鳥(如跟著船走的鳥)可以另行記錄或忽略不計(jì)。16.3.3.3樣品分析與資料處理珍稀瀕危海鳥類調(diào)查數(shù)據(jù)記錄于表A.19和表A.20。采用樣點(diǎn)法調(diào)查，應(yīng)將日期、觀測(cè)點(diǎn)坐標(biāo)、生態(tài)環(huán)境、海拔高度、生境、觀測(cè)起止時(shí)間以及觀測(cè)到鳥類相關(guān)信息等記錄于表A.19;采用樣帶法調(diào)查，應(yīng)將日期、觀測(cè)點(diǎn)坐標(biāo)、生態(tài)環(huán)境、海拔高度、生境、觀測(cè)起止時(shí)間以及觀測(cè)到鳥類相關(guān)信息和與樣帶的垂直距離等記錄于表A.20。16.3.4其他珍稀瀕危海洋動(dòng)物調(diào)訪與觀測(cè)(以文昌魚為例)16.3.4.1儀器設(shè)備采用大型底棲生物采樣設(shè)備(0.1m2箱式或抓斗式采泥器);負(fù)荷為1000kg絞車和吊桿；絞車用鋼絲繩，一般為直徑6mm～8mm的軟鋼絲繩；套篩(由3層不同孔徑的篩子和支架組成，上層篩的孔徑為2.0mm～5.0mm,中層為1.0mm,下層為0.1mm～0.5mm);游標(biāo)卡尺；體視顯微鏡；電子天平(感量：0.01g);鑷子等實(shí)驗(yàn)室常用物品。16.3.4.2站位布設(shè)根據(jù)文昌魚分布情況布設(shè)站位。16.3.4.3樣品采集文昌魚樣品使用采泥器采集，每個(gè)測(cè)站采樣面積至少為0.1m2。樣品用底層孔徑為0.1mm的套篩分選，現(xiàn)場(chǎng)挑選出上層或中層篩子內(nèi)的文昌魚樣品，放入標(biāo)本瓶中。可將生物樣及沉積物全部裝入文昌魚標(biāo)本瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室再行處理。樣品用體積比為5%～7%的中性甲醛溶液固定，樣品瓶外貼好標(biāo)簽。樣品采集站位、時(shí)間、水深、沉積物類型等信息記錄于表A.21。16.3.4.4樣品分析用游標(biāo)卡尺測(cè)量每個(gè)采樣站位30尾文昌魚樣品的體長(zhǎng)(mm),少于30尾的站位則測(cè)量所有樣品的體長(zhǎng)(mm)。計(jì)算每個(gè)站位文昌魚的總個(gè)體數(shù)，用總個(gè)體數(shù)除以采樣面積，得到每個(gè)站位文昌魚的棲息密度(ind/m2)。將文昌魚樣品放在吸水紙上吸去水分，稱重，用文昌魚的樣品重量除以采樣面積，得到每個(gè)站位文昌魚的生物量(g/m2)。樣品分析數(shù)據(jù)包括總個(gè)體數(shù)、棲息密度、總生物量、平均體長(zhǎng)等信16.3.4.5樣品保存文昌魚標(biāo)本經(jīng)分析后，放入250mL白色廣口瓶中，用70%的乙醇固定長(zhǎng)期保存。16.3.4.6資料處理資料處理要求如下：a)繪制年齡結(jié)構(gòu)圖文昌魚各年齡組的體長(zhǎng)范圍為：0齡≤7.0mm;7.0mm<I齡≤15.0mm;15.0mm<Ⅱ齡≤29.0mm;29.0mm<Ⅲ齡≤37.0mm;37.0mm<IN齡≤43.0mm;V齡以上>43.0mm。部分海域分布的文昌魚由于水溫、種群等差異，各年齡組體長(zhǎng)范圍有所差異。根據(jù)體長(zhǎng)分布規(guī)律確定不同年齡組體長(zhǎng)范圍。將所有站位樣品體長(zhǎng)數(shù)據(jù)作為一個(gè)樣本群，作出年齡結(jié)構(gòu)圖(見(jiàn)圖3).b)繪制密度及生物量平面分布圖采用等值線或圓圈繪制出密度及生物量的平面分布圖，密度區(qū)間為<50,≥50～<100,≥100～<200,≥200～<400,≥400～<800,≥800,單位為尾每平方米(ind/m2)。生物量區(qū)間為<5,≥5～<10,≥10～<20,≥20～<40,≥40～<80,≥80,單位為克每平方米(g/m2)。圖3文昌魚年齡結(jié)構(gòu)模式圖17濱海濕地植物——野外勘查法本方法適用于濱海濕地植物的野外調(diào)查。以布設(shè)斷面和選擇樣地等方法，對(duì)濱海濕地植物密度、頻度、生長(zhǎng)高度和地上生物量進(jìn)行調(diào)查。17.3濕地植物樣地設(shè)置與描述17.3.1樣地設(shè)置的原則樣地設(shè)置的原則如下：a)典型性和代表性原則：樣地要有較好的代表性，有限的調(diào)查面積中應(yīng)較好地反映出植物群落的基本特征，不應(yīng)在兩個(gè)群落的過(guò)渡帶上設(shè)置樣方。樣地地形相對(duì)平坦，地勢(shì)布相對(duì)均勻。b)自然性原則：選擇人為干擾和動(dòng)物活動(dòng)影響相對(duì)較少的地段，且樣地在較長(zhǎng)時(shí)間不被破壞，如c)充分性原則：樣地內(nèi)或樣地外有足夠的植物供取樣分析，以及土壤水分觀測(cè)，土于氣象觀測(cè)或資料的收集等。對(duì)固定樣地應(yīng)進(jìn)行圍欄、封育，圍欄面積應(yīng)大于觀測(cè)樣地的實(shí)際d)安全性原則：在進(jìn)行植物及其群落調(diào)查與采樣時(shí)，應(yīng)選擇對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)破壞較小的觀測(cè)方法。觀測(cè)區(qū)設(shè)置應(yīng)具有合理性，減少觀測(cè)活動(dòng)對(duì)綜合觀測(cè)場(chǎng)生態(tài)環(huán)境的干擾，保證觀測(cè)位點(diǎn)的e)定位原則：永久樣地應(yīng)有明顯標(biāo)識(shí)物，可通過(guò)打樁或GPS定位。描述內(nèi)容見(jiàn)表3。表3植物群落樣地描述調(diào)查表斷面號(hào)人類活動(dòng)自然災(zāi)害b)樣地選擇和面積確定：隨機(jī)選擇樣方3個(gè)～5個(gè)，草本群落樣方面積宜取1m×1m,灌叢群落宜取3m×4m;某種植物在全部調(diào)查樣方中出現(xiàn)的百分率。)b)樣地選擇和面積確定：隨機(jī)選擇樣方3個(gè)～5個(gè)，草本群落樣方面積宜取1m×1m,灌叢群落宜取3m×4m;17.6.1.2調(diào)查方法b)樣地選擇和面積確定：隨機(jī)選擇樣方3個(gè)～5個(gè)，草本群落樣方面積取1m×1m,灌叢群落取 17.7.1.2調(diào)查方法調(diào)查方法如下：b)樣地選擇和面積確定：隨機(jī)選擇樣方3個(gè)～5個(gè)，樣方面積為1m×1m,每期重復(fù)5個(gè)樣方；c)生物量確定：采用收獲法測(cè)定草本植物群落地上綠色部分、已枯部分和凋落物的干重之和。分種收獲樣方內(nèi)植物群落的地上部分，應(yīng)將植物齊地面剪下，并將綠色部分、已枯部分和凋落物部分和凋落物分別稱其鮮重后，放入大小適當(dāng)?shù)募埓?，置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)85℃烘干至恒重，18腹瀉性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)按《海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)范第3部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查》的要求執(zhí)行。19麻痹性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)按《海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)范第3部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查》的要求執(zhí)行。20麻痹性貝毒——高效液相法(HPLC)20.1適用范圍本方法適用于海洋貝類生物體中麻痹性貝毒的檢測(cè)。海洋貝類生物體內(nèi)的麻痹性貝毒經(jīng)分離提取后，通過(guò)堿性氧化作用將毒素分子氧化成有色的熒光衍生物，再通過(guò)高效液相色譜熒光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：b)色譜柱：C?反相柱(4.6mm×250mm,5μm),或與之相當(dāng)者；c)高速離心機(jī)，轉(zhuǎn)速不低于12000r/min;d)旋渦振蕩器；e)真空泵；f)酸度計(jì)。20.4試劑及其配制試劑及其配制要求如下：d)四丁基磷酸銨溶液(1.2mmol/L):0.20g四丁基磷酸銨溶解于450mL水中，用氨水調(diào)整pH值為6.5,以水準(zhǔn)確定容至500mL,過(guò)0.45μm水相濾膜；e)1-庚烷磺酸鈉(2.6mmol/L)與磷酸銨(10mmol/L)混合溶液：0.26gl-庚烷磺酸鈉和1.02g磷酸銨溶解于450mL水中，用乙酸和氨水調(diào)整pH值為7.1,以水準(zhǔn)確定容至500mL,過(guò)f)高碘酸(7mmol/L)與磷酸鉀(50mmol/L)混合溶液：0.80g高碘酸和6.66g磷酸鉀溶解于450mL水中，用乙酸和氨水調(diào)整pH值為9.0,以水準(zhǔn)確定容至500mL;g)乙酸水溶液(0.5mol/L):14.31mL乙酸，用水定容至500mL;h)麻痹性貝毒標(biāo)準(zhǔn)溶液：標(biāo)準(zhǔn)母液可用乙酸(0.01mol/L)稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)使用液，冷凍避光保存(不應(yīng)超過(guò)1年);i)水：試驗(yàn)用水均為超純水。20.5樣品采集與保存20.5.1采樣原則樣品采集的原則是：樣品新鮮，樣品的分布具有代表性；同種樣品的個(gè)體體長(zhǎng)大致相似；樣品帶殼外觀正常，采集后及時(shí)冷凍保存。20.5.2采樣數(shù)量宜采集貝類1kg～2kg.20.5.3樣品保存采集的新鮮樣品保存或運(yùn)輸過(guò)程中應(yīng)冷凍，不應(yīng)放于水中。20.6分析步驟20.6.1儀器工作條件20.6.1.1高效液相色譜儀工作條件高效液相色譜儀的工作條件如下：a)實(shí)驗(yàn)室溫度為20℃~27℃,溫度變化小于3℃/h,相對(duì)濕度小于80%;c)流動(dòng)相：檢測(cè)C1～C2毒素時(shí)流動(dòng)相為四丁基磷酸銨；檢測(cè)GTX1-GTX5、dcGTX2和dcGTX3毒素時(shí)流動(dòng)相為1-庚烷磺酸鈉與磷酸銨的混合溶液；檢測(cè)STX、neoSTX和dcSTX毒素時(shí)流動(dòng)相為1-庚烷磺酸鈉與磷酸銨混合溶液：乙腈(體積比20:1);e)熒光波長(zhǎng)：λ=330nm,λm=390nm;f)進(jìn)樣量：10μL或根據(jù)樣品含量適當(dāng)增減；g)數(shù)據(jù)處理：峰面積外標(biāo)法定量。20.6.1.2柱后衍生儀工作條件柱后衍生儀工作條件如下：a)實(shí)驗(yàn)室溫度為20℃~27℃,溫度變化小于3℃/h,相對(duì)濕度小于80%;b)柱后衍生劑1:高碘酸與磷酸鉀混合溶液；c)反應(yīng)器1:75℃,2.0mL;d)柱后衍生劑2:乙酸水溶液；e)反應(yīng)器2:30℃,0.1mL;攪拌；用5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0～4.0,加熱煮沸5min,冷卻至室溫；用超純水定容至30mL,5mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2.0～4.0(pH值不應(yīng)大于4.5),12000r/min,離心10min,0.22μm水相方法檢出限見(jiàn)表4。表4各類麻痹性貝毒檢出限參考表毒素類型 (22)在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不應(yīng)超過(guò)算術(shù)平均值的10%。a)每批次樣品測(cè)試完畢后，應(yīng)根據(jù)儀器特征用超純水和甲醇或乙腈充分清洗系統(tǒng)，防止鹽類析出結(jié)晶；b)所用試劑不可放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，宜即用即配，發(fā)現(xiàn)有沉淀生成應(yīng)過(guò)濾使用或拋棄處理。21記憶缺失性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)按《海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)范第3部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查》的要求執(zhí)行。22神經(jīng)性貝毒——酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)按《海洋災(zāi)害調(diào)查技術(shù)規(guī)范第3部分：海洋生態(tài)災(zāi)害調(diào)查》的要求執(zhí)行。23金黃色葡萄球菌——測(cè)試片法23.1適用范圍本方法適用于海洋魚、蝦、蟹、貝、藻類等生物樣品中金黃色葡萄球菌的快速檢驗(yàn)計(jì)數(shù)。本方法包括直接計(jì)數(shù)法與MPN計(jì)數(shù)法，當(dāng)兩種方法所獲得的結(jié)果發(fā)生矛盾時(shí)，以直接計(jì)數(shù)法為仲裁方法。23.2直接計(jì)數(shù)法23.2.1方法原理金黃色葡萄球菌快速檢驗(yàn)測(cè)試片法，是一種不需準(zhǔn)備培養(yǎng)基、應(yīng)用一種預(yù)先制備好的快速檢驗(yàn)系統(tǒng)(測(cè)試片)來(lái)檢測(cè)金黃色葡萄球菌的方法。測(cè)試片含有具有顯色功能并經(jīng)改良的Baird-Parker培養(yǎng)基，對(duì)金黃色葡萄球菌具有很強(qiáng)的選擇性，培養(yǎng)24h后金黃色葡萄球菌在測(cè)試片上形成紫紅色菌落。當(dāng)測(cè)試片上出現(xiàn)除紫紅色以外的其他任何顏色的菌落時(shí)，則應(yīng)使用確認(rèn)反應(yīng)片。此確認(rèn)反應(yīng)片含有顯色劑和脫氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid,簡(jiǎn)稱DNA)。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的脫氧核糖核酸酶(DNase)會(huì)和反應(yīng)片中的顯色劑形成粉紅色暈圈。23.2.2儀器設(shè)備儀器設(shè)備應(yīng)符合以下要求：a)超凈工作臺(tái)；c)冰箱，2℃~5℃;d)高壓蒸汽滅菌器；e)便攜式冷藏箱；f)天平或電子稱：感量0.1g;g)移液器及其吸頭或無(wú)菌吸管1mL、10mL;h)無(wú)菌錐形瓶：150mL;i)無(wú)菌培養(yǎng)皿：直徑90mm;j)無(wú)菌試管：180mm×18mm;k)干熱滅菌箱；m)滅菌玻璃研缽或均質(zhì)器(旋刀式或拍擊式);n)放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器；o)金黃色葡萄球菌測(cè)試片壓板；p)酸度計(jì)或精密pH試紙；r)一次性無(wú)菌乳膠手套；s)一次性無(wú)菌塑料袋；u)集網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類、甲殼類的手撈網(wǎng)；v)采樣記錄表格。23.2.3試劑和測(cè)試片所需試劑和測(cè)試片如下：b)金黃色葡萄球菌測(cè)試片(應(yīng)符合23.2.1方法原理的要求);c)金黃色葡萄球菌確認(rèn)反應(yīng)片(應(yīng)符合23.2.1方法原理的要求)。23.2.4樣品采集與預(yù)處理見(jiàn)8.2.4.3。23.2.5檢驗(yàn)操作程序檢驗(yàn)操作程序見(jiàn)圖4。圖4金黃色葡萄球菌測(cè)試片直接計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序23.2.6接種和培養(yǎng)接種和培養(yǎng)步驟：a)接種：取2個(gè)～3個(gè)稀釋度(10-1、10-2、10-3)樣品稀釋液接種金黃色葡萄球菌測(cè)試片上，每個(gè)稀釋樣品接種3片，每片1mL。將測(cè)試片置于超凈工作臺(tái)上，揭開(kāi)上層膜，用移液器吸取1mL樣液垂直滴加到一張測(cè)試片的中央處，然后將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產(chǎn)生，再把金黃色葡萄球菌的壓板放置在上層膜中央處，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面上，拿起壓板，靜置至少1min使培養(yǎng)基凝固；b)培養(yǎng)：將測(cè)試片的透明面朝上水平置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不應(yīng)超過(guò)20片，在36℃±1℃條件下培養(yǎng)24h±2h;c)確認(rèn)反應(yīng)：如上述測(cè)試片上沒(méi)有菌落生長(zhǎng)或菌落全部是紫紅色(典型的金黃色葡萄球菌特征),無(wú)需進(jìn)行確認(rèn)；如測(cè)試片上出現(xiàn)黑色菌落、藍(lán)綠色菌落或紫紅色菌落不明顯，應(yīng)使用確認(rèn)反應(yīng)片作進(jìn)一步確認(rèn)；d)將上層膜掀起，將確認(rèn)反應(yīng)片置入測(cè)試片的培養(yǎng)范圍內(nèi)，再將上層膜放下覆蓋在確認(rèn)反應(yīng)片上，用手指以滑動(dòng)的方式輕輕將測(cè)試片與確認(rèn)反應(yīng)片壓緊，包括確認(rèn)反應(yīng)片的邊緣，此步驟可使測(cè)試片與確認(rèn)反應(yīng)片緊密接觸并除去氣泡，最后把插入確認(rèn)反應(yīng)片的測(cè)試片放在36℃±1℃的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1h～3h。23.2.7菌落計(jì)數(shù)與報(bào)告菌落計(jì)數(shù)與報(bào)告要求如下：a)判讀：紫紅色的菌落直接計(jì)數(shù)為金黃色葡萄球菌；需要使用確認(rèn)反應(yīng)片作確認(rèn)時(shí)，計(jì)數(shù)有粉紅色暈圈的菌落。沒(méi)有粉紅色暈圈的菌落不是金黃色葡萄球菌，不應(yīng)被計(jì)數(shù)。如整個(gè)培養(yǎng)面積呈粉紅色而沒(méi)有明顯的暈圈，說(shuō)明金黃色葡萄球菌大量存在，結(jié)果記錄為“多不可計(jì)”;b)菌落計(jì)數(shù)與報(bào)告：培養(yǎng)結(jié)束后立即計(jì)數(shù)，可目視或用菌落計(jì)數(shù)器來(lái)計(jì)數(shù)，放大鏡可輔助計(jì)數(shù)；選取金黃色葡萄球菌菌落數(shù)在15～150之間的測(cè)試片，計(jì)數(shù)菌落平均數(shù)，乘以相對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即為每克樣品中的金黃色葡萄球菌數(shù)，報(bào)告單位以“CFU/g”表示；c)如所有稀釋度測(cè)試片上的菌落數(shù)都小于15,則計(jì)數(shù)稀釋度最低的測(cè)試片上的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作報(bào)告；如所有稀釋度的測(cè)試片上均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)作報(bào)告；如最高稀釋度的菌落數(shù)大于150個(gè)時(shí)，計(jì)數(shù)最高稀釋度的測(cè)試片上的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)作報(bào)告。23.3MPN計(jì)數(shù)法23.3.1檢驗(yàn)程序檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖5。23.3.2樣品采集與預(yù)處理見(jiàn)8.2.4.3.23.3.3樣品稀釋液接種、培養(yǎng)與確認(rèn)見(jiàn)23.2.6。23.3.4結(jié)果判讀與報(bào)告金黃色葡萄球菌菌落判讀見(jiàn)23.2.7a),根據(jù)金黃色葡萄球菌陽(yáng)性測(cè)試片數(shù)，查MPN檢索表(見(jiàn)附錄C),報(bào)告每克或每升樣品中金黃色葡萄球菌MPN值。如可以直接計(jì)數(shù)的，結(jié)果報(bào)告見(jiàn)23.2.7b)。報(bào)告結(jié)果圖5金黃色葡萄球菌測(cè)試片MPN計(jì)數(shù)法檢驗(yàn)程序23.4廢棄物處理與生物安全措施見(jiàn)8.4.24沙門氏菌——微孔板試劑盒法24.1適用范圍本方法適用于海洋魚、蝦、蟹、貝、藻類等生物樣品中沙門氏菌的快速檢驗(yàn)。24.2方法原理沙門氏菌微孔板試劑盒快速檢驗(yàn)法