GBT 33584.6-2017 海水冷卻水質(zhì)要求及分析檢測(cè)方法 第6部分：異養(yǎng)菌的測(cè)定（正式版）

海水冷卻水質(zhì)要求及分析檢測(cè)方法第6部分：異養(yǎng)菌的測(cè)定2017-05-12發(fā)布2017-12-01實(shí)施IGB/T33584《海水冷卻水質(zhì)要求及分析檢測(cè)方法》分為6個(gè)部分：——第5部分：溶解固形物的測(cè)定；——第6部分：異養(yǎng)菌的測(cè)定。本部分為GB/T33584的第6部分。本部分按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本部分由國(guó)家海洋局提出。本部分由全國(guó)海洋標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC283)歸口。本部分起草單位：國(guó)家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所、浙江國(guó)華浙能發(fā)電有限公司。Ⅱ在以海水為水源的海水冷卻水系統(tǒng)中易于滋生微生物污垢沉積等危害，因此，在系統(tǒng)運(yùn)行過(guò)程中常需測(cè)定微生物量，用以評(píng)估系統(tǒng)生物污染程度，以及所采用的生物防治技術(shù)的有效性和經(jīng)濟(jì)性，其中最常測(cè)定的是黏液形成菌總數(shù)。但在黏液形成菌的測(cè)定過(guò)程中，需采用成套的黏泥采集裝置，樣品為生物黏泥樣，樣品狀態(tài)為含水固體，須經(jīng)研磨后定量稀釋測(cè)定，導(dǎo)致這種采樣方式在實(shí)踐中受到限制，且研磨、稀釋黏泥樣品后再進(jìn)行測(cè)定，也增加了測(cè)定步驟和污染機(jī)率，使得黏液形成菌的檢測(cè)很難日?；１静糠譁y(cè)定的異養(yǎng)菌是一類(lèi)生活于海水冷卻水中的浮游細(xì)菌，其存在和數(shù)量可以直接反映海水冷卻系統(tǒng)的生物污染程度。本部分舍棄黏泥采集裝置，直接采集水樣測(cè)定異養(yǎng)菌數(shù)，簡(jiǎn)化了采樣和制樣步驟，使得異養(yǎng)菌的測(cè)定得以日?；岣吡撕Ｋ鋮s水的運(yùn)行管理水平。1海水冷卻水質(zhì)要求及分析檢測(cè)方法第6部分：異養(yǎng)菌的測(cè)定GB/T33584的本部分規(guī)定了海水冷卻水質(zhì)要求和采用平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定海水冷卻水中異養(yǎng)菌的方法原理、試劑與材料、儀器與設(shè)備、分析測(cè)定、菌落計(jì)數(shù)、菌落總數(shù)的計(jì)算和報(bào)告方式。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。異養(yǎng)菌heterotrophicbacteria利用有機(jī)物分子作為能源的微生物。菌落形成單位colony-formingunit;CFU采用平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定的菌落數(shù)量。蔓延菌落spreadingcolony在瓊脂培養(yǎng)基表面呈彌漫生長(zhǎng)的菌落。4水質(zhì)要求海水冷卻水主要水質(zhì)指標(biāo)應(yīng)符合表1的規(guī)定。表1海水冷卻水主要水質(zhì)要求允許值鈣離子(Ca2+)mg/L鎂離子(Mg2+)mg/L鋅離子(Zn2+)mg/L氯化物(Cl-)mg/L2表1(續(xù))允許值mg/L溶解固形物異氧菌注1:Ca2+、Mg2+、Cl-、SO、異氧菌的允許值引自GB/T23248—2009的6.1.2和6.1.3。注2:Zn2+的允許值引自GB8978—1996中表4第二類(lèi)污染物最高允許排放濃度一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。注3:溶解固形物的允許值依據(jù)實(shí)際海水冷卻工程最大濃縮倍數(shù)N=2.5倍確定。待測(cè)水樣經(jīng)適當(dāng)稀釋后，傾注接種到的營(yíng)養(yǎng)瓊脂中，于有氧條件下，在29℃±1℃下培養(yǎng)72h水樣中的單個(gè)異養(yǎng)菌將在營(yíng)養(yǎng)瓊脂上形成肉眼可見(jiàn)的單菌落。統(tǒng)計(jì)每個(gè)平皿的菌落數(shù)，根據(jù)其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)和接種量，即可換算出待測(cè)水樣中的異養(yǎng)菌數(shù)。6試劑與材料除非另有說(shuō)明，在分析中化學(xué)試劑僅使用分析純?cè)噭┖虶B/T6682規(guī)定的三級(jí)水。6.1氯化鈉。6.4氯化鈣。6.6碳酸氫鈉。6.7牛肉膏。6.9磷酸氫二鉀。6.10瓊脂。6.12鹽酸溶液：1+11。6.13硫代硫酸鈉：將硫代硫酸鈉置于稱(chēng)量紙上，轉(zhuǎn)入無(wú)菌箱(室)或超凈工作臺(tái)(7.1)內(nèi)，并均勻地?cái)偡旁陔x紫外線(xiàn)燈的垂直距離30cm處滅菌30min備用。6.14陳海水：取天然海水避光保存3個(gè)月以上，使用時(shí)取其清液或經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾的濾液。CO?加入到1L水中，混勻后備用。(6.14)或人工海水(6.15)和500mL蒸餾水配制的混合水中，加熱溶解(如用含雜質(zhì)較多的瓊脂配制時(shí)，應(yīng)趁熱用四層醫(yī)用脫脂紗布過(guò)濾),用熱水補(bǔ)充至1000mL后，用氫氧化鈉溶液(6.11)或鹽酸溶液(6.12)調(diào)節(jié)pH值至7.2±0.2,并分裝于三角瓶(7.9)中，于121℃±1℃下蒸汽壓力滅菌20min,冷卻后備用。3于121℃±1℃下蒸汽壓力滅菌20min,冷卻后備用。6.19牛皮紙。6.20醫(yī)用脫脂紗布。7儀器與設(shè)備7.1無(wú)菌箱(室)或超凈工作臺(tái)。7.2蒸汽壓力滅菌器。7.3恒溫培養(yǎng)箱。7.4電熱干燥箱7.5電熱恒溫水浴鍋。7.6天平：稱(chēng)量范圍0g～220g,感量0.01g。7.11試管：直徑18mm,長(zhǎng)度180mm,配硅膠塞。經(jīng)蒸汽壓力滅菌器121℃±1℃滅菌20min后，50℃~60℃烘干冷卻備用。7.12培養(yǎng)皿：直徑90mm。經(jīng)蒸汽壓力滅菌器121℃±1℃滅菌20min后，50℃~60℃烘干冷卻7.13刻度吸管或移液器和槍頭：1000μL、1mL～10mL。經(jīng)蒸汽壓力滅菌器121℃±1℃滅菌7.14采樣瓶：廣口玻璃瓶或聚丙烯塑料瓶，1000mL。洗凈后經(jīng)蒸汽壓力滅菌器121℃±1℃滅菌20min后，50℃~60℃烘干冷卻7.16放大鏡(3×)或菌落計(jì)數(shù)器。8分析測(cè)定8.1樣品的采集8.1.1采用采樣瓶(7.14)在海水冷卻水的給水總管或回水總管處采集約500mL樣品，在取樣過(guò)程中，應(yīng)避免瓶口和頸部受雜菌污染。采樣前用酒精燈灼燒管口，并放水5min后再采集。中加入滅菌的硫代硫酸鈉(6.13),硫代硫酸鈉的加入量為每升水樣約加入0.1g。若確定水樣不含余8.1.3水樣采集后，應(yīng)立即進(jìn)行測(cè)定，如果在2h內(nèi)不能進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)把水樣放在冰箱(7.7)中冷藏保存，存放時(shí)間不宜超過(guò)24h。經(jīng)冷藏保存后的水樣需測(cè)定時(shí)，從冰箱中取出，在培養(yǎng)箱(7.3)中29℃±1℃下活化4h～5h,再進(jìn)行測(cè)定。8.2水樣的稀釋與接種8.2.1將水樣搖勻，采取無(wú)菌操作方法，按10倍稀釋法對(duì)水樣進(jìn)行系列稀釋?zhuān)敝列枰?8.2.2采取無(wú)菌操作方法，將不同稀釋度的水樣分別接種到無(wú)菌培養(yǎng)皿(7.12)中，每個(gè)稀釋度重復(fù)接種3皿～5皿，每皿接種1mL,每接種一個(gè)稀釋度更換一支無(wú)菌吸管或槍頭(7.13)。然后傾注入15mL~20mL已融化并冷卻至45℃±1℃的滅菌培養(yǎng)基(6.16),并立即輕輕旋搖培養(yǎng)皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。測(cè)定一個(gè)水樣從接種到灌入培養(yǎng)基不得超過(guò)20min。8.2.3另取一組無(wú)菌培養(yǎng)皿(7.12),采取無(wú)菌操作方法，接種1mL無(wú)菌稀釋水(6.17)并傾注滅菌培養(yǎng)基(6.16)作為空白對(duì)照。8.3培養(yǎng)待培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基固化后，倒置平皿，在培養(yǎng)箱(7.3)中于29℃±1℃培養(yǎng)72h。9菌落計(jì)數(shù)9.1培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)皿，用肉眼觀(guān)察(若菌落太小，采用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器觀(guān)察),記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以CFU表示。9.2計(jì)數(shù)時(shí)，根據(jù)平皿上的菌落形態(tài)，按下述情況處理：a)當(dāng)無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)時(shí)，對(duì)每個(gè)平皿上的菌落計(jì)數(shù)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)采用一組平皿的平均數(shù)；b)同一稀釋度下，當(dāng)部分平皿出現(xiàn)較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)選擇無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平皿計(jì)算該稀釋度的菌落數(shù)；c)同一稀釋度下，當(dāng)所有平皿均出現(xiàn)不同程度的片狀菌落，應(yīng)選取片狀菌落不到平皿面積的一半，而其余一半多的平皿中菌落分布又很均勻的平皿進(jìn)行計(jì)數(shù)，即對(duì)分布均勻的半個(gè)平皿計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果乘以2,代表一個(gè)平皿菌落數(shù)；d)同一稀釋度下，當(dāng)所有平皿均出現(xiàn)超過(guò)平皿面積一半的片狀菌落時(shí)，該稀釋度的平皿不應(yīng)計(jì)數(shù)；e)當(dāng)平皿上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。10菌落總數(shù)的計(jì)算和報(bào)告方式10.1若空白對(duì)照培養(yǎng)皿出現(xiàn)菌落，表明測(cè)定過(guò)程中有污染，本次測(cè)定無(wú)效。10.2選擇平均菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間的稀釋度，進(jìn)行計(jì)算。若只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，則將該平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告(見(jiàn)表2例1)。10.3若有兩個(gè)稀釋度，其生長(zhǎng)菌落數(shù)均在30CFU～300CFU之間，則視二者之比值來(lái)決定，若其比值小于2,應(yīng)報(bào)告兩者平均數(shù)(見(jiàn)表2例2);若大于2則報(bào)告其中稀釋度較小的菌落數(shù)(見(jiàn)表2例3);若等于2亦報(bào)告其中稀釋度較小的菌落數(shù)(見(jiàn)表2例4)。10.4若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300CFU,則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告(見(jiàn)表2例5)。10.5若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30CFU,則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告(見(jiàn)表2例6)。10.6若所有稀釋度均無(wú)菌落生長(zhǎng)，則以“小于1乘以最低稀釋倍數(shù)”報(bào)告(見(jiàn)表2例7)。10.7若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30CFU～300CFU之間，其中一部分大于300CFU而另一部分小于30CFU時(shí)，則選擇最接近30CFU或300CFU的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告(見(jiàn)表2例8)。10.8若所有平皿均密布菌落，則不宜用“多不可計(jì)”報(bào)告，而宜在稀釋度最高的各平皿上，任意計(jì)數(shù)51cm2中的菌落數(shù)，求出每平方厘米內(nèi)的平均菌落數(shù)，乘以皿底面積63.6cm2,再乘以其稀釋倍數(shù)報(bào)告。10.9若所有平皿上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。10.10菌落總數(shù)修約原則如下：b)菌落數(shù)大于或等于100CFU時(shí)，第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)；也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示，按“四舍五入”原則修約后，采用兩位有效數(shù)字(見(jiàn)表2報(bào)告方式欄)。表2