2011艾滋病基礎(chǔ)技術(shù)培訓

2011艾滋病基礎(chǔ)技術(shù)培訓濟南市CDC1什么是艾滋病病毒（HIV）HIV屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，慢病毒亞科，單鏈雙拷貝RNA病毒。病毒顆粒：呈20面體立體對稱球形，表面有刺突狀結(jié)構(gòu)的糖蛋白，分為包膜和核心兩部分2艾滋病的傳播途徑經(jīng)血液傳播：輸血、靜脈吸毒等。經(jīng)性傳播：異性、同性、雙性。垂直傳播：母嬰經(jīng)胎盤傳播。3艾滋病的檢測方法快速檢測：膠體金/硒、明膠凝集、唾液檢測卡等。

敏感性約相當于中度敏感的ELISA，適用于應(yīng)急檢測、門診急診個體檢測。

優(yōu)點：簡單、快速。缺點：不穩(wěn)定、假陰/陽性常用篩查實驗：酶聯(lián)免疫（ELISA）、化學發(fā)光等。確證檢測：免疫印跡實驗（WB）其他檢測方法：核酸檢測等

4什么是ELISA方法是以酶標記的抗體或抗原為主要試劑，利用抗原抗體反應(yīng)進行的檢測方法,是標記免疫技術(shù)的一種。5目前使用的ELISA試劑多為第三代及第四代ELISA試劑。第四代試劑是最近發(fā)展起來的HIV抗原抗體聯(lián)合測定試劑，可同時檢測P24抗原和抗HIV-1/2抗體。與第三代抗HIV-1/2試劑相比，檢出時間提前了4-9.1天，其優(yōu)點在于能同時檢測抗原、抗體，降低血源篩查的殘余危險度。什么是ELISA方法6什么是ELISA方法7什么是ELISA方法ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物，根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的條件，可設(shè)計出各種不同的檢測方法。89ELISA的成品試劑盒中包含以下各組分：

(1)已包被抗原或抗體的固相載體(96孔板);(2)酶標記的抗原或抗體(結(jié)合物);(3)酶的底物（緩沖液和底物液或稱A/B液）;(4)陰性對照品和陽性對照品(定性測定中)(5)有些試劑盒中還有標本的稀釋液;(6)洗滌液（基本為通用的濃縮磷酸鹽溶液）;(7)酶反應(yīng)終止液（一般為弱硫酸液）什么是ELISA方法10必須是經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局注冊批準、批批檢驗合格、在有效期內(nèi)的試劑。推薦使用經(jīng)臨床質(zhì)量評估敏感性和特異性高的試劑。什么是ELISA方法111HIV抗體檢測可用于監(jiān)測、診斷、血液篩查。2以監(jiān)測為目的的檢測是為了解不同人群HIV感染率及其變化趨勢而進行的檢測，檢測的人群包括各類高危人群和一般人群。3以診斷為目的的檢測是為了確定個體HIV感染狀況而進行的檢測，包括臨床檢測和自愿咨詢檢測、術(shù)前檢測、根據(jù)特殊需要進行的體檢等。4以血液篩查為目的的檢測是為了防止輸血傳播HIV而進行的檢測，包括獻血員篩查和原料血漿篩查。HIV抗體檢測的目的12樣品初篩試驗篩查試劑陽性反應(yīng)陰性反應(yīng)復檢試驗原有試劑+另一不同原理（或廠家）試劑或另外兩種不同原理（或廠家）試劑均陽性反應(yīng)一陰一陽均陰性反應(yīng)確證試驗報告陰性HIV抗體篩查檢測流程HIV檢測試驗流程13最常用的樣品是血液，包括血清、血漿和全血。唾液或尿液有時也可作為測試樣品。什么是血清：抽取靜脈血，置于普通試管內(nèi)，室溫下自然放置1

2h，待血液凝固、血塊收縮后再用3000r/min離心15min，吸出血清備用。什么是血槳：抗凝靜脈血，抽取靜脈血后，置于加有EDTA或肝素等抗凝劑的試管，顛倒混勻數(shù)次，可用于CD4細胞檢測。離心分離出的上清液為血槳。血漿與血清的區(qū)別是上清液中存在纖維蛋白，容易產(chǎn)生假陽性。因此盡量上送血清樣品。采樣注意：采血時自我防護，使用安全針具，戴雙層手套14用于抗體檢測的血清或血漿樣品，應(yīng)存放于-20℃以下，短期（1周）內(nèi)進行檢測的樣品可存放于2-8℃。用于CD4+/CD8+T淋巴細胞測定的樣品不能長期保存，樣品采集時間超過48h則不可檢測。采樣15血液樣本應(yīng)及時檢測，一般10個工作日內(nèi)必須出具報告。各篩查實驗室必須對樣品進行ELISA或化學發(fā)光法檢測。不能只進行快速檢測。對于篩查陰性的樣品出具：

“HIV抗體陰性（—）”報告此為唯一正確格式檢測及報告16實驗室間傳遞的樣品應(yīng)為血清或血漿，除特殊情況外一般不運送全血。應(yīng)采用三級包裝系統(tǒng)（WHO提出）NO.1帶螺帽的凍存管，要求防滲漏。標注：姓名、種類以及采集時間。

疑似陽性樣品的處理試管的周圍應(yīng)墊有緩沖吸水材料（泡沫塑料等）。17NO.2

：要求耐受性好、防滲漏、容納并保護第一層容器，帶蓋子。（金屬盒，硬塑料盒）NO.3：生物運輸箱。外貼警示標簽。

疑似陽性樣品的處理隨樣品應(yīng)附有送檢單，送檢單應(yīng)與樣品分開放置，并由1名檢驗人員和1名具有中級以上技術(shù)職稱的人員的手寫簽字。18血清和血漿樣品應(yīng)在2

8℃條件下由專人運送。用于CD4+/CD8+T淋巴細胞測定的樣品應(yīng)在室溫下18

25℃運送。疑似陽性樣品的處理運送必須有陽性標本轉(zhuǎn)運登記表：送樣人以及接收人都要有簽字。19實驗室需要重視的問題：cutoff值的計算臨界值（cutoff值）是界定樣品陰陽性的標準，不同的試劑有不同的設(shè)定方法。以珠海麗珠為例：cutoff值=NC1+0.15。（陰性對照<0.08，按0.08計算）因此在NC1<0.08時，cutoff值=0.230.20S/CO值的計算：S/CO值=樣品OD值/cutoff值S/CO值≥1為陽性，反之為陰性。

實驗室需要重視的問題：cutoff值的計算HIV檢測一般不設(shè)灰度值，遇到臨界的情況需重新檢測并咨詢上級檢測單位。21外部質(zhì)控目的：為了監(jiān)控檢測的重復性和穩(wěn)定性，試劑盒批間或孔間差異。包括強陽性、弱陽性和陰性對照血清。也可以只設(shè)置一個弱陽性對照，以該試劑盒臨界值（cutoff值）的2

3倍為宜。實驗室需要重視的問題：外部質(zhì)控的設(shè)定22外質(zhì)控品可通過購買獲得，不能使用試劑盒中的陰/陽性對照配制。按一周實驗用量分裝、分類、標記、封口、-20℃凍存于非自動除霜冰箱中。不可反復凍融，一旦融化后應(yīng)該存放2

8℃，一周內(nèi)用完。實驗室需要重視的問題：外部質(zhì)控的設(shè)定2360/110μl陽性血清60/110μl陰性血清60/110μl陰性血清60/110μl陰性血清60/110μl陰性血清60/110μl陰性血清60/110μl陰性血清質(zhì)控品梯度稀釋方法將梯度稀釋后的樣品同普通樣品一樣進行OD值測定60/110μl混合液24對于檢測量小的單位，可以使用“即刻法”進行質(zhì)量控制。對于檢測量大的單位，可以使用常規(guī)方法（L-J法）進行質(zhì)量控制。實驗室需要重視的問題：質(zhì)控方法的種類25“即刻法”質(zhì)控是在對同一批外部質(zhì)控血清（Q）進行連續(xù)測定3次后，即可對第3次檢驗結(jié)果進行質(zhì)控。一直到20次后更換為“L-J法質(zhì)控”為止。具體計算方法如下：即刻法質(zhì)控26

⑴將質(zhì)控血清的測定值從小到大排列：

x1，x2，x3……xn(x1為最小值，xn為最大值)。⑵計算平均值和標準差s。即刻法質(zhì)控27⑶計算SI上限值和SI下限值。⑷將SI上限、SI下限與“SI值表”中的數(shù)字比較。

即刻法質(zhì)控28即刻法質(zhì)控29（4）當SI上限值和SI下限值<n2s時表示處于控制范圍內(nèi)，可以繼續(xù)測定。（5）當SI上限值和SI下限值有一值處于n2s-n3s值之間時說明該值在2s

3s范圍，處于“告警”狀態(tài)。（6）當SI上限值和SI下限值有一值>n3s時說明該值已在3s范圍之外，屬“失控”。每增加一個測定值都要重新計算平均值和標準差，重復以上各項計算。即刻法質(zhì)控30（7）數(shù)值處于“告警”和“失控”狀態(tài)應(yīng)舍去，需重新測定該質(zhì)控血清和病人樣品。（8）舍去的只是失控的這次數(shù)值，其它測定值仍可繼續(xù)使用。即刻法質(zhì)控31最常用的質(zhì)控圖是Levey-Jennings質(zhì)控圖，通過圖形分析可提供一段時間內(nèi)實驗室質(zhì)量控制的總體情況。Levey-Jennings質(zhì)控32質(zhì)控圖參數(shù)包括：算數(shù)平均值：標準差:是描述樣品與均數(shù)之間離散程度的一個指標。S

變異系數(shù)：用來衡量檢測的重復性。CV經(jīng)由“即刻法”質(zhì)控后得到了20個Q的數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)計算得出各項參數(shù)值。L-J法質(zhì)控33繪制質(zhì)控圖:包含一條中心橫線（均值線）和其上、下各兩條平行的控制線（均值±1SD和均值±

2SD），并按時間順序點入本實驗室每次試驗Q的測定值。L-J法質(zhì)控34將平均值和標準差分別在質(zhì)控框架圖中標示出來。以S/CO值作縱座標(Y軸)，每一次試驗時間點作為橫座標(x軸)，繪制質(zhì)控圖。L-J法質(zhì)控35從第21次的Q值起，將每次質(zhì)控血清的檢測結(jié)果依次點入該質(zhì)控框架圖中，檢驗進入質(zhì)控狀態(tài)。L-J法質(zhì)控前20次數(shù)據(jù)屬于即刻法，在L-J法中成為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)不標入圖中3637告警（2S）：當外部對照的S/CO值超出±2s范圍時，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)，應(yīng)予注意，是否可以繼續(xù)檢測需要進一步觀察。失控（3S）：當外部對照的S/CO值超出±3s范圍時，系統(tǒng)處于失控狀態(tài)，本次實驗結(jié)果不能被接受?？赡苁窍到y(tǒng)誤差、隨機誤差或外部對照滴度下降造成。超出2s或3s的數(shù)據(jù)不應(yīng)刪除L-J法質(zhì)控38位移：連續(xù)幾次（3

5次）外部對照S/CO值都落在均值的一側(cè)則稱為位移，提示實驗條件發(fā)生了較大的變化。趨勢：連續(xù)幾次（5

7次）外部對照S/CO值幾乎按一個方向分布時稱為趨勢，通常由參數(shù)的緩慢改變引起。L-J法質(zhì)控更換了新的試劑盒\(zhòng)孵育時間和溫度不準確\更換新的檢驗人員更換了新的儀器設(shè)備（加樣器、洗板機、酶標儀等）39出現(xiàn)下列情況時，應(yīng)暫停檢測查找原因⑴出現(xiàn)一次3s范圍的變化⑵連續(xù)兩次出現(xiàn)同一方向2s范圍的變化⑶連續(xù)四次出現(xiàn)同一方向的1s范圍的變化⑷連續(xù)10次結(jié)果都在1s范圍內(nèi)，但落在均值線的同一側(cè)。L-J法質(zhì)控40實驗室應(yīng)建立質(zhì)控圖分析及失控情況處理程序。當出現(xiàn)失控時必須找出問題原因，并找出解除故障的方法，消除原因，防止將來出現(xiàn)同樣的問題。L-J法質(zhì)控41建議長期和穩(wěn)定地使用一種質(zhì)量好的試劑盒，更換不同廠家的試劑盒后，必須重新配制質(zhì)控品并重新進行新的質(zhì)控，繪制新的質(zhì)控圖。并在質(zhì)控圖上注明使用日期。L-J法質(zhì)控42發(fā)現(xiàn)質(zhì)控結(jié)果失控，應(yīng)填寫報告單，上交質(zhì)量負責人，分析原因并決定是否發(fā)出檢測報告。質(zhì)控圖上必須有操作者以及審核者的手寫簽名。L-J法質(zhì)控43使用新批次的外部對照質(zhì)控物時，必須重新繪制質(zhì)控圖。變異系數(shù)(cv)小于20％，表示外部對照處于穩(wěn)定狀態(tài)。L-J法質(zhì)控44實驗室操作人員在實驗室內(nèi)必須穿戴規(guī)范的防護用品，隔離衣、口罩、帽子等。HIV病毒對酒精等化學消毒劑敏感，實驗室內(nèi)應(yīng)備有酒精噴壺等設(shè)備。實驗室廢棄物必須用高壓蒸汽滅菌后，裝入黃色垃圾袋中，并貼上警示標簽后。由專人負責轉(zhuǎn)運。并填寫廢棄物轉(zhuǎn)運登記。實驗室需要重視的問題：

生物安全及廢棄物處理45儀器鑒定是確保整個實驗順利進行的重要條件之一，是必須具備的。儀器鑒定要提前進行，以防止儀器使用中出現(xiàn)鑒定過期現(xiàn)象。儀器的鑒定管理最好有專人負責管理。實驗室需要重視的問題：儀器檢定46濟南市規(guī)定每月5日之前報上個月的報表。每個月的報表的紙質(zhì)版記錄都需要保存。陽性結(jié)果上報必須以收到確認陽性報告的時間為準，不可擅自上報。工作量為“0”也要上報。實驗室需要重視的問題：實驗室月報47濟南市HIV確證實驗室介紹：外觀艾滋病檢測實驗室需要相對獨立的實驗房間。實驗室門口必須貼有黃色的生物安全警示標志。48在實驗室的清潔區(qū)域放置打印機以及各種登記用的文檔。在清潔區(qū)內(nèi)及時完成各種實驗記錄的書寫工作。濟南市HIV確證實驗室介紹：布局49在實驗室的污染區(qū)內(nèi)完成各項實驗。實驗必須在生物安全柜內(nèi)進行。實驗人員必須穿著防護服，帶口罩、帽子、雙層手套。濟南市HIV確證實驗室介紹：試驗操作50實驗室內(nèi)放置溫濕度儀，監(jiān)控環(huán)境溫度在18