產(chǎn)脂肪酶的微生物研究進展

產(chǎn)脂肪酶細菌的篩選與鑒定姓名：范麗萍學號：班級：生09級6班前言1.脂肪酶的簡介脂肪酶(Lipase，EC3．1．1．3，甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶uJ。在動植物體和微生物中普遍存在，它是一類特殊的酯鍵水解酶，催化如下反映：甘油三酯+水=甘油+游離脂肪酸。它的另一重要特性是只作用于異相系統(tǒng)，即在油(或脂)一水界面上作用，對均勻分散的或水溶性底物無作用即使作用也極緩慢，因此脂肪酶也可說是專門在異相系統(tǒng)或水不溶性系統(tǒng)的油(脂)一水界面上水解酯的酶。2.微生物產(chǎn)脂肪酶的研究歷程脂肪酶是最早研究的酶類之一(見表1)。從1834年兔胰脂肪酶活性的報道至如今的微生物脂肪酶已有上百年的歷史。微生物發(fā)酵法的應用前景要遠遠大于提取法及化學合成法。如今，黑曲霉、白地霉、毛霉等微生物來源的酶已制成結晶。根霉、圓柱假絲酵母、德氏根霉、多球、，粘質(zhì)色桿菌等也得到高度提純，并對它們的理化性質(zhì)[1]開展進一步研究。早在60年代，假絲酵母[2]、曲霉、根霉等菌產(chǎn)生的脂肪酶相繼在日本進入商品生產(chǎn)(見表2)。我國60年代也已開展脂肪酶的研究開發(fā)。1967年，中科院微生物所篩選到解脂假絲酵母(Candidalipolytica)AS2．1203并于1969年制成酶制劑供應市場。表1常見的產(chǎn)脂肪酶的徽生物菌名黑曲霉熒光假單胞菌白地霉無根根霉毛霉圓柱假絲酵母巢子須霉德氏根霉多球菌棉毛狀酶圓弧青霉粘質(zhì)色桿菌表2常見商品酶enzymeabbreviationmanufacturerCandidacylindracesCCSigina,amanoAspergillusnigerANAmino,flukaRhisopusdelemarRDamano就微生物脂肪酶而言，雖然在產(chǎn)酶菌株選育、培養(yǎng)條件、酶的性質(zhì)及工業(yè)應用上已研究了幾十年，但由于脂肪酶的結構及性質(zhì)的多樣性、酶的不穩(wěn)定性、底物的水不溶性、酶的來源局限性、提純困難以及應用范圍不廣泛等問題，脂肪酶的研究進展及工業(yè)應用與蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多。因此在微生物產(chǎn)脂肪酶方面尚有很大的研究空間，本實驗重要就是通過對微生物的培養(yǎng)，篩選出產(chǎn)脂肪酶活力高的細菌。3.微生物產(chǎn)脂肪酶的用途微生物脂肪酶的應用雖不如淀粉酶，蛋白酶廣泛，但在許多方面已顯示出不可估量的開發(fā)潛力。比如脂肪酶食品的加工、乳制品的生產(chǎn)以及在食品添加劑的工業(yè)生產(chǎn)中都有著不可估量的價值[1]。又比如脂肪酶在紡織物的應用方面[2]也具有一定的奉獻。4.國內(nèi)外微生物脂肪酶的最新研究進展[3]微生物脂肪醇是一種重要的工業(yè)酶類，也是當前國內(nèi)外研究的熱點。（1）在食品工業(yè)中的應用脂肪酶現(xiàn)已用于奶制品，如奶酪、奶油和人造黃油的增香。由于奶制品中的香味是牛奶中的脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖代謝的產(chǎn)物，因此，脂肪酶和蛋白酶被廣泛地用于加快奶酪的熟化和香味的產(chǎn)生。用脂肪酶解決過的奶制品比未解決的具有更好的香味和可接受性[4]。除奶制品外，脂肪酶也用于改善稻米和酒精飲料的香味，如在酒精飲料的發(fā)酵過程中加入一定量的低溫脂肪酶[5]，產(chǎn)品具有類似奶酪的香味。脂肪酶還用于無脂肪肉的生產(chǎn)，如在魚加工過程中脂肪的去除是用脂肪酶來完畢的。此外，在生面團中加入脂肪酶使三甘酯部分水解而增長單甘酯的含量可延緩腐敗，單甘酯和雙甘酯的形成也使蛋白的起泡性質(zhì)得到改善[6]。（2）環(huán)境治理方面的應用每年由于各種因素排入海中的石油達200萬t，如不及時解決，不僅會導致魚類的大量死亡，并且石油中的有害物質(zhì)也會通過食物鏈進人人體。人們用品有脂肪酶及其它成分的復合制劑解決海中的石油，可以將石油降解成適合微生物的營養(yǎng)成分，為浮在油表面的細菌提供優(yōu)良的養(yǎng)料，使得分解石油的細菌迅速繁殖，以達成快速降解石油的目的。脂肪酶生物技術應用于被污染環(huán)境的修復以及廢物解決是—個新興的領域。石油開采和煉制過程中產(chǎn)生的油泄漏，脂加工過程中產(chǎn)生的含脂廢物以及飲食業(yè)產(chǎn)生的廢物，都可以用不同來源的脂酶進行有效的解決。酶法生產(chǎn)生物柴油[7]日益受到人們的青睞，可運用餐飲業(yè)廢油脂和工業(yè)廢油脂為原料，變廢為寶的同時減少了生物柴油的生產(chǎn)成本[8]。（3）脂肪酶在奶酪、面包中的應用[9]脂肪酶可用于改良食品風味。在適當條件下，脂肪酶生成短鏈脂肪酸酯、乙醇、丙酮、乙醛、二甲硫醚及低檔脂肪酸等風味成分，增強食品香味。如在奶酪生產(chǎn)中，脂肪酶將脂肪降解為游離脂肪酸，游離脂肪酸分解形成有揮發(fā)性的脂肪酸，異戊醛，二乙酰，3．羥基丁酮等呈味物質(zhì)，改善了奶酪風味，并產(chǎn)生特殊香味。脂肪酶還能催化脂肪釋放中鏈脂肪酸產(chǎn)生爽滑感。釋放出游離脂肪酸參與化學反映，誘發(fā)合成乙酰乙酸、p一酮類酸、甲基酮、香味酯和內(nèi)酯等香味成分[10]。（4）脂肪酶在生物傳感器中的應用用脂肪酶的催化特性研制生物傳感器逐漸受到關注。固定在pH或氧化電極的脂肪酶聯(lián)合葡萄糖氧化酶可作為脂質(zhì)生物傳感器，測定甘油三酯、血膽固醇含量。（5）脂肪水解方面的應用水解反映是指脂肪酶催化脂肪或酯，將其水解為脂肪酸和甘油或醇。脂肪酶作為生物催化劑可催化由不同底物出發(fā)的水解反映，運用脂肪酶水解油脂的能力可獲得重要的輕化工原料脂肪酸和甘油。用于這種目的脂肪酶[11]涉及來自Candidarliosa，Pseudomonashuorescen和蓖麻種子(castorbean)等的脂肪酶研究。水解的底物涉及各種植物油，如大豆油、蓖麻油、橄欖油等；動物油如牛脂、羊脂和魚油及各種油的酯類。（6）脂肪酸的提純方面的應用Hoshino等研制了一種富集n-3多不飽和脂肪酸的三甘酯的生物反映器，運用A．niger和C．rugosa、Brassicanapu岱脂肪酶不與多不飽和脂肪酸(PuFA)，如．R-亞油酸和二十二烷酸作用，而與其它脂肪酸作用使其優(yōu)先被釋放出來的性質(zhì)，可制備PUFA含量高的甘油酯。用R．a(chǎn)rrh／zus水解茴香油制備巖芹酸(順式一6一十八烯酸)是完全也許的，因它對這種酸具有高選擇性。（7）手性化合物合成中的應用脂肪酶催化具有高底物專一性、區(qū)域選擇性或?qū)τ尺x擇性等優(yōu)點，使其成為有機合成中重要的生物催化劑。脂肪酶催化合成手性化合物的基本類型有兩個：（1)前手性底物的反映；(2)外消旋化合物的拆分舊。催化的底物已由傳統(tǒng)的前手性或手性醇和羧酸酯擴展到二醇、二酯、內(nèi)酯、胺、二胺、胺基醇、Ct或B羥基酸，因此，大多數(shù)重要的功能有機化合物原則上都可被脂肪酶催化立體選擇性地制備。典型的生物催化劑涉及細菌脂肪酶，如P．a(chǎn)eruginosa、P．fluorescens、Pseudomonas、B．cepacia、C．viscosum、Bacillussubtilis、Achromobactersp．、Alcaligenes和Serratiamarcescens以及來自真菌的C．a(chǎn)ntarcticaB和C．rugosa.5.微生物脂肪酶的前景與展望[12]脂肪酶來源不同，導致結構和性質(zhì)的多樣性、不穩(wěn)定性，使脂肪酶研究進展較慢。固定化脂肪酶可反復運用，提高酶穩(wěn)定性、有助于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，減少生產(chǎn)成本。目前，脂肪酶固定化因其經(jīng)濟性和技術可靠性，離產(chǎn)業(yè)化尚有相稱大的差距，需對脂肪酶載體、固定化技術作進一步研究。此后，脂肪酶研究需生物遺傳、生物化工、儀器分析、食品工程等領域的研究人員通力合作，篩選新的工業(yè)脂肪酶菌株，以解決工業(yè)生產(chǎn)和保護環(huán)境問題。實驗目的1.掌握產(chǎn)脂肪酶細菌的篩選鑒定方法。2.篩選出產(chǎn)脂肪酶活性高的細菌，將其擬定到種。實驗意義1.篩選出的產(chǎn)脂肪酶活性高的細菌，將其用于實際生產(chǎn)中。四．實驗器材顯微鏡載玻片接種環(huán)酒精燈高壓蒸汽滅菌鍋超凈工作臺熱鼓風干燥箱恒溫磁力攪拌器離心機熱恒溫水箱精密電子天平隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱便攜式pH計三角瓶（帶棉塞）移液管天平（帶砝碼）鑰匙稱量紙三角瓶培養(yǎng)皿涂布器試管游標卡尺接種環(huán)五．試劑及藥品5.1培養(yǎng)基成分及配制方法1.富集培養(yǎng)基：酵母粉0．2，Na2HPO43．5，K2HP041．5，MgS04·7H200．5，NaCl0．5，橄欖油10．0，pH7．0．2牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，氯化鈉0.5g，瓊脂1.5g，水100ml．橄欖油0.05溴甲酚紫在燒杯內(nèi)加水100毫升，放入牛肉膏、蛋白胨和氯化鈉，用記號筆在燒杯外作上記號后，放在火上加熱。待燒杯內(nèi)各組分溶解后，用10%鹽酸或10%的氫氧化鈉調(diào)整pH值到7.2～7.6,再加入15%瓊脂，不斷攪拌以免粘底。等瓊脂完全溶解后補足失水，分裝在各個試管里，加棉花塞，用高壓蒸汽滅菌30分鐘。3.復篩培養(yǎng)基：A.種子培養(yǎng)基：1％蛋白胨，0．5％酵母粉，0．5％橄欖油，0．05％MgSO4·7H2O，0.2％K2HPO4，調(diào)pH值至7．0，乳化分裝滅菌。B..初始發(fā)酵培養(yǎng)基：1％蛋白胨，0．5％酵母粉，1％蔗糖，1％橄欖油，0．2％K2HPO40.05％MgSO4·7H20，0．01％CaCl2，1％吐溫80，0．001％FeS04·7H20，調(diào)pH值至7．0，乳化分裝滅菌4.LB液體培養(yǎng)基酵母膏5g／L，蛋白胨lOg／L，NaCIlOg／L用6mol／LNa2CO3調(diào)至pH9．0.5.V—P實驗培養(yǎng)基蛋白胨0．5％，葡萄糖0．5％，K2HPO40.05％，pH7.2～7．4。每管分裝4～5ml。6.硝酸鹽還原實驗培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨lOg，NaCI5g，KNO3lg，水1000ml，PH7～7．6硝酸鹽顯色液：A液：對氨基苯磺酸0．5g，稀醋酸(10％左右)150ml，B液：a一萘胺0．1g，蒸餾水20ml，稀醋酸(10％左右)150ml7.脲酶檢測培養(yǎng)基蛋白胨1g，NaCI5g，葡萄糖lg，K2HPO42g，0.2％酚紅水溶液6ml，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，115.C蒸汽滅菌30min后調(diào)pH至6．8～6．9使培養(yǎng)基呈橘黃色，微帶粉紅，20％的尿素過濾滅菌后和冷卻至50～55℃的基礎培養(yǎng)基混合，使其終濃度為2％，擺成較大斜面。8.葡萄糖氧化發(fā)酵實驗培養(yǎng)基蛋白胨2g，葡萄糖lOg，1％溴百里酚藍水溶液3ml(先用95％乙醇溶解后，再加水配成1％水溶液)，NaCI59，KH2PO40.2g，瓊脂6g，蒸餾水1000ml，pH7．0～7．2.9.明膠液化實驗培養(yǎng)基蛋白胨O．5％，明膠10～15％，pH7．2～7．4，滅菌后用試管分裝，培養(yǎng)基高度約為4～5cm.10.甲基紅實驗培養(yǎng)基蛋白胨O．5％，葡萄糖0．5％，K：HPO。0．05％，pH7．2～7．4。每管分裝4～5ml.11.半固體培養(yǎng)基酵母膏0．5％，蛋白棟1．0％，NaCI1．O％，瓊脂0．5％，用lmol／LNaOH調(diào)至pH7.012.菌體運動性實驗培養(yǎng)基蛋白胨0．5％，明膠5～6％。pH7．2～7．4，滅菌后分裝試管，培養(yǎng)基高度約為4～5cm。5.2常用用儲存液及配制方法(1)lmol／LHCl：取86．2ml濃鹽酸加入到900ml蒸餾水中，定容為1L。(2)lmol／LNaOH：稱取40．OgNaOH溶于900ml蒸餾水中，定容為1L。(3)6mol／LNa2CO3：稱取318．OgNa2CO3，溶于400ml蒸餾水中，完全溶解后用蒸餾水定容為500ml，分裝，高壓滅菌。(5)0．5％羅丹明溶液：稱取0．5g羅丹明溶解在lOOml重蒸水中。(6)橄欖油／聚乙烯醇乳化液：稱取1．8g聚乙烯醇，溶于90ml水中，用1mol／LNaOH溶液調(diào)至pH9．0，再加入30ml橄欖油，10000r／min攪拌乳化5分鐘，使之成為穩(wěn)定均勻的乳化液(7)革蘭氏染色液：結晶紫染色液：稱取2．0g結晶紫，0．8g草酸銨溶于20ml95％乙醇中，再加入80ml重蒸水渾勻，靜置48h過濾使用。碘液：先用5ml重蒸水溶解2．0g碘化鉀，再加入1．0番紅復染液：稱取0．5g番紅，溶于2．5％番紅的乙醇溶液20ml與80ml蒸餾水中。（8）溴甲酚紫(1.6%)的配制:溴甲酚紫1.6g溶于100ml乙醇（是95%的乙醇？）中，貯存于棕色瓶中保存?zhèn)溆?。用作培養(yǎng)指示劑時，每1000ml培養(yǎng)基中加入1ml1.6%溴甲酚紫。六．實驗環(huán)節(jié)1.土壤的采集本實驗是從綿陽師范學院食堂的排污口采集土壤樣品。共6份。2.土壤菌懸液的制備及富集降每份土樣稱取2g，加入到20mL滅活的無菌水3.菌種的初篩將富集培養(yǎng)液用無菌水進行梯度稀釋，各取200uL10-5、10-6和10-73個梯度的稀釋液涂布于三丁酸甘油酯篩選平板上，28℃下培養(yǎng)2～3d后，挑選有明顯水解圈的菌落，平板劃線法接種到新的初篩平板上，同樣條件下培養(yǎng)2---3d培養(yǎng)基500ml，并加入0.5ml的溴甲酚紫和橄欖油乳化液12ml（橄欖油：20g/L，聚乙烯醇（PVA）為1:3，轉(zhuǎn)速10000r/min,5min或是將2%的聚乙烯醇與橄欖油按體積3:1超聲波混勻，121℃濕熱滅菌20min）4.菌種的復篩挑取有水解圈的單菌落接種于種子培養(yǎng)基，30℃下200r／min搖床培養(yǎng)24h，按10％體積接種于基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃140r/min搖床培養(yǎng)40h后，無菌操作條件下，挑取篩選的菌株，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于5.酶活的測定[14]挑取平板上經(jīng)復篩后的細菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃原理：脂肪酶在一定條件下將甘油三酯水解，在不同水解階段可釋放出脂肪酸，甘油二酯，甘油單酯及甘油。水解釋放出的脂肪酸可用標準堿液滴定，以此表達酶活力。酶活力單位(u)“定義為：在一定條件下，以每分鐘分解底物(橄欖油)釋放出lumol游離脂肪酸所需酶量定義為1個脂肪酶活力單位，國際單位(1u)，以lu／m1表達。 試劑：(1)反映底物乳化液的制備：稱取308聚乙烯醇(PVA)，加900ml水，加熱溶解，冷卻后用6mol／L氫氧化鈉調(diào)至pH為9．0，過濾，定容為1000m1．量取上述PVA溶液150ml，加入橄欖油50ml，用高速組織搗碎機攪拌6min，4000r／min，前后各3min，間隔5min，液備用。(2)0.05mol／L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液的制備：稱取1.889甘氨酸，加入約480mL水溶解，用6mol／L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至9.0，再定容為500ml，備用。需新鮮配置。(3)0.05mol／L氫氧化鈉溶液的制備：取4.589固體氫氧化鈉溶于lL水中，用鄰苯二甲酸氫鉀標定，使用時再稀釋一倍。(4)1％酚酞作指示劑，95％乙醇作反映終止劑。測定方法：在三角瓶中加入5ml緩沖溶液和4ml乳化液，放入40。C恒溫水浴鍋中，再加入酶液反映并計時，一定期間(10min或30min)后終止反映，用0.05mol／L氫氧化鈉滴定游離出的脂肪酸，同時做空白樣(先加終止劑，后加酶液，其余同樣品操作)計算：酶活力(U)=(V2-V1)×N／t其中：v2為樣品消耗堿的體積(m1)V1為空白消耗堿的體積(m1)t為反映時間(min)N為稀釋倍數(shù)，這里N=50，50為1mlO.05mol／L氫氧化鈉的微摩爾數(shù)5.菌種的鑒定與對篩選出來的菌株進行純培養(yǎng)，然后對其進行形態(tài)學上的觀測，通過形態(tài)特性初步判斷所篩選的菌株屬于哪一類微生物，然后根據(jù)此依據(jù)對其進行相應的生理生化等方面的鑒定。其具體過程如下所示：將產(chǎn)脂肪酶活力較高的菌落劃線在LB培養(yǎng)基上30℃1..細菌形態(tài)的顯微觀測(1)制片制片要采用干凈的載玻片，用接種環(huán)挑菌體涂布到載玻片上。操作時需注意接種環(huán)的無菌操作，注意菌體量適中。(2)固定涂片后最佳先在室溫下自然干燥，然后固定。固定常用高溫。手執(zhí)載玻片一側(cè)，標本面朝上，在火焰外層快速來回通過3～4次。共約3～4s，規(guī)定載玻片表面溫度不超過60。C，此時以手背皮膚接觸，不覺燙為度。放置待冷后染色。(3)染色標本固定以后，滴加結晶紫染色液，使整個標本固定在染色液中。染色時間為1～3min。(4)水洗與干燥染色時間一到，用細小的緩流水將多余染料從標本上洗去，洗凈后，將標本置桌上風干，也可用吸水紙輕輕吸去水分。有時也可微微加熱，待干后再鏡檢。(4)顯微鏡觀測菌體形態(tài)。細菌的生理生化鑒定1）革蘭氏染色[13]A制片制片要采用干凈的載玻片，并注意接種環(huán)的無菌操作。做斜面菌體時，要防止菌體和水混合不均勻有結團現(xiàn)象，注意菌體量適中。B固定涂片后最佳先在室溫下自然干燥，然后固定。固定常用高溫。手執(zhí)載玻片一側(cè)，標本面朝上，在火焰外層快速來回通過3～4次a共約3～4s，規(guī)定載玻片表面溫度不超過60。C，此時以手背皮膚接觸，不覺燙為度。放置待冷后染色。C媒染與染色標本固定以后，滴加結晶紫染色液，使整個標本固定在染色液中。染色時間視標本與染料的性質(zhì)而定，一般染色時間為2～3min，用水洗。碘液作用1min，水洗，吸干。D脫色與復染A．用95％乙醇或丙酮乙醇溶液脫色，流滴到脫色液為無色，約30秒。B．脫色后需再用蕃紅液染色2～3min。E水洗與干燥染色時間一到，用細小的水緩緩流滴將多余染料從標本上洗去。洗凈后，將標本置桌上風干，也可用吸水紙輕輕吸去水分。有時也可微微加熱，待干后再鏡檢。(2)過氧化氫酶實驗A．接種于LB斜面培養(yǎng)基上，30℃B．滴加3％雙氧水于斜面培養(yǎng)基上，若有氣泡為陽性。(3)V--P實驗A．接種于V—P斜面培養(yǎng)基上于30℃B．培養(yǎng)2、4、9天后觀測，若仍為陰性，可適當延長培養(yǎng)時間。C．取培養(yǎng)液和40％氫氧化鈉等量混合，加入少許肌酸，lOmin后如培養(yǎng)液顯紅色，則V—P為陽性，有時需放置更長時間才出現(xiàn)紅色反映。(4)硝酸鹽還原實驗A．將測定菌接種于硝酸鹽還原液體培養(yǎng)基中，置室溫培養(yǎng)l、3、5天，另兩管不接種作對照。B．倒出少許l、3、5天液體培養(yǎng)基，再各加一滴A液和B液。C．如溶液變?yōu)榧t色、橙色、棕色等表達亞硝酸鹽存在，為硝酸鹽還原陽性；如無紅色可再加一滴二苯胺試劑，如呈藍色則無硝酸鹽還原作用，否則按硝酸鹽還原陽性解決。(5)脲酶檢測實驗A.接種于脲酶檢測培養(yǎng)基斜面上，于30℃B.分別于2h、4h過夜觀測，培養(yǎng)基變桃紅色為陽性，不變者為陰性，陰性結果要觀測4天。(6)葡萄糖氧化發(fā)酵實驗A.將滅菌的葡萄糖氧化發(fā)酵培養(yǎng)基分裝到試管中，然后穿刺接種。B.每株鑒定菌種分別接種4支試管，其中兩支試管用通過高溫滅菌的凡士林一石蠟油(含2／3的凡士林和1／3的液體石蠟)液封，以隔絕空氣。此外兩支試管不液封，同時需準備兩支未接種的試管，一支用凡士林一石蠟油液封，此外一支不液封，以做空白對照。C.室溫培養(yǎng)I、2、3、7、14天觀測結果。D.結果檢查：a.只有開管產(chǎn)酸變黃的為氧化型。b.開管、閉管均產(chǎn)酸變黃的為發(fā)酵型。(7)明膠液化實驗A.取培養(yǎng)18～24小時的明膠液化培養(yǎng)基作穿刺接種，于20℃B.培養(yǎng)2、7、10、14和30天的試管，在20℃以下觀測菌的生長情況和明膠是否融化。菌生長，明膠表面無凹陷，且為穩(wěn)定的凝塊，則為明膠水解陰性；如明膠凝塊部分或所有在20(8)甲基紅實驗A.接種于甲基紅實驗培養(yǎng)基，30℃B.培養(yǎng)2、4、9天后觀測，若仍為陰性，可適當延長培養(yǎng)時問。c.在培養(yǎng)基中加入一滴甲基紅試劑，假如顯紅色，則為M—R陽性，如黃色則為陰性。(9)菌體運動性實驗A.接種針穿刺接種于半固體培養(yǎng)基內(nèi)，30℃B.培養(yǎng)l、2、3后觀測，細菌的運動性可用透射光目測。C.假如細菌只沿著穿刺線生長，則沒有運動性。若有細菌(非氣泡)存在穿刺線周邊，說明細菌有運動性。(10)好氧性測試A.將菌種穿刺接種在半固體培養(yǎng)基內(nèi)，30℃B.培養(yǎng)3天后觀測，細菌的好氧性可以用透射光目測。C.若菌體只在培養(yǎng)基表面和穿刺線上段出現(xiàn)，則屬于好氧菌。若菌體生長物在穿刺線上生長良好，屬于兼性厭氧菌。假如菌體沿穿刺線向培養(yǎng)基內(nèi)生長，則屬于厭氧菌。參考文獻[1]縱偉.董海麗.脂肪酶及其在食品工業(yè)中的應用[期刊論文]-安徽農(nóng)學通報2023．13(15)：14-15[2]張中義.吳新俠.脂肪酶的研究進展[期刊論文](2023)12—0054—03[3]