酶的作用機制

關(guān)于酶的作用機制9.1、酶的活性部位（一）基本概念：酶的活性中心是指結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是相隔很遠的氨基酸殘基形成的三維實體。酶的活性中心包括兩個功能部位：結(jié)合部位和催化部位。1．結(jié)合部位（Bindingsite）酶分子中與底物結(jié)合的部位或區(qū)域一般稱為結(jié)合部位。此部位決定酶的專一性。2．催化部位（catalyticsite）酶分子中促使底物發(fā)生化學變化的部位稱為催化部位。此部位決定酶所催化反應(yīng)的性質(zhì)。第2頁,共64頁，星期六，2024年，5月（二）酶活性部位的特點1.活性中心只占酶分子總體積的很小一部分，往往只占整個酶分子體積的1%-2%。2.酶的活性部位是一個三維實體，具有三維空間結(jié)構(gòu)。3.酶的活性部位并不是和底物的形狀正好互補的，而是在酶和底物的結(jié)合過程中，底物分子或酶分子、有時是兩者的構(gòu)象同時發(fā)生了一定的變化后才互補的，此時催化基團的位置正好處在所催化底物鍵的斷裂和即將生成鍵的適當位置，這個動態(tài)辨認過程稱為誘導契合（induced-fit）.第3頁,共64頁，星期六，2024年，5月第4頁,共64頁，星期六，2024年，5月4.酶的活性部位位于酶分子表面的一個裂隙（crevice）內(nèi).裂隙內(nèi)是一個相當疏水的環(huán)境，從而有利于同底物的結(jié)合。5.底物靠次級鍵較弱的力與酶結(jié)合。6.酶的活性部位具有柔性和可運動性第5頁,共64頁，星期六，2024年，5月（三）研究酶活性部位的主要方法酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾法

1.非特異性共價修飾

2.特異性共價修飾（DFP）

3.親和標記（底物類似物，具有活潑的化學基團）X- 射線晶體衍射法：定點誘變法第6頁,共64頁，星期六，2024年，5月DFP的作用二異丙基氟磷酸第7頁,共64頁，星期六，2024年，5月9.2、影響酶催化效率的有關(guān)因素（一）底物和酶的鄰近效應(yīng)（approximation）與定向效應(yīng)（orientation）在酶促反應(yīng)中，由于酶和底物分子之間的親和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趨勢，最終結(jié)合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效濃度大大增加的效應(yīng)叫做鄰近效應(yīng)。定向效應(yīng)：當專一性底物向酶活性中心靠近時，會誘導酶分子構(gòu)象發(fā)生改變，使酶活性中心的相關(guān)基團和底物的反應(yīng)基團正確定向排列，同時使反應(yīng)基團之間的分子軌道以正確方向嚴格定位，使酶促反應(yīng)易于進行。以上兩種效應(yīng)使酶具有高效率和專一性特點。第8頁,共64頁，星期六，2024年，5月咪唑催化對-硝基苯酚乙酸酯的水解反應(yīng)第9頁,共64頁，星期六，2024年，5月實驗結(jié)果表明，分子內(nèi)咪唑基參與的水解反應(yīng)速度比相應(yīng)的分子間反應(yīng)速度大24倍。說明咪唑基與酯基的相對位置對水解反應(yīng)速度具有很大的影響。第10頁,共64頁，星期六，2024年，5月軌道定向(orbital-steering)假說示意圖第11頁,共64頁，星期六，2024年，5月（二）底物的形變（distortion）酶-底物復(fù)合物形成時，酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，底物分子也常常受到酶的作用而發(fā)生變化，甚至使底物分子發(fā)生扭曲變形，從而使底物分子某些鍵的鍵能減弱，產(chǎn)生鍵扭曲，有助于過度態(tài)的中間產(chǎn)物形成,從而降低了反應(yīng)的活化能。第12頁,共64頁，星期六，2024年，5月誘導契合模型與底物的形變第13頁,共64頁，星期六，2024年，5月（三）酸堿催化（acid-basecatalysis）酸-堿催化可分為狹義的酸-堿催化和廣義的酸-堿催化。酶參與的酸-堿催化反應(yīng)一般都是廣義的酸－堿催化方式。廣義酸－堿催化是指通過質(zhì)子酸提供部分質(zhì)子,或是通過質(zhì)子堿接受部分質(zhì)子的作用，達到降低反應(yīng)活化能的過程。酸-堿催化是催化有機反應(yīng)的最普遍有效的催化劑第14頁,共64頁，星期六，2024年，5月廣義酸基團廣義堿基團（質(zhì)子供體）（質(zhì)子受體）酶分子中可作為酸堿催化的功能基團第15頁,共64頁，星期六，2024年，5月影響酸堿催化反應(yīng)的因素包括酸堿強度及質(zhì)子傳遞的速率。His咪唑基的解離常數(shù)約6.0，咪唑基解離下來的質(zhì)子濃度與水中的[H+]相近，在中性條件下，一半以酸形式存在，一半以堿形式存在;同時，咪唑基接受質(zhì)子和供出質(zhì)子的速率十分迅速，半衰期小于10-10秒。所以，His是酶中最有效最活潑的一個催化功能基團。第16頁,共64頁，星期六，2024年，5月（四）共價催化（covalentcatalysis）催化劑通過與底物形成反應(yīng)活性很高的共價過渡產(chǎn)物，使反應(yīng)活化能降低，從而提高反應(yīng)速度的過程，稱為共價催化。酶中參與共價催化的基團主要包括以下親核基團：

His的咪唑基，Cys的硫基，Asp的羧基，Ser的羥基等；親電子基團：H+

、Mg2+、Mn2+

、Fe3+某些輔酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以參與共價催化作用。

第17頁,共64頁，星期六，2024年，5月(五)金屬離子的催化作用１.需要金屬的酶分類：

（1）金屬酶－metalloenzyme:含緊密結(jié)合的金屬離子。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+

（2）金屬-激活酶（metal-activatedenzyme）:含松散結(jié)合的金屬離子，如Na+K+Mg2+Ca2+2.金屬離子的催化作用：通過結(jié)合底物為反應(yīng)定向。通過可逆的改變金屬離子的氧化態(tài)調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)。通過靜電穩(wěn)定或屏蔽靜電荷。第18頁,共64頁，星期六，2024年，5月9.3、酶催化反應(yīng)機制的實例（一）溶菌酶溶菌酶的生物學功能是催化某些細胞壁多糖的水解。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析法和競爭性抑制劑揭示了酶的活性部位。鍵張力導致與酶結(jié)合的底物特定位置的糖苷鍵穩(wěn)定性降低。溶菌酶催化機制是一個廣義的酸堿催化，Glu35和Asp52在催化過程中起了重要作用。Next第19頁,共64頁，星期六，2024年，5月溶菌酶是一種葡糖苷酶，能催化水解NAM的C1和NAG的C4之間的糖苷鍵，但不能水解NAGC1和NAMC4之間的β（1-4）糖苷鍵。Back第20頁,共64頁，星期六，2024年，5月X射線晶體分析法揭示了溶菌酶的三維結(jié)構(gòu)活性部位？第21頁,共64頁，星期六，2024年，5月(NAG)3是研究溶菌酶活性部位的良好競爭性抑制劑60000(NAG-NAM)330000(NAG)64000(NAG)58(NAG)41(NAG)30(NAG)2相對水解速率底物圖像分析表明，(NAG)3僅僅占據(jù)了半個狹縫，酶的最小底物應(yīng)該是(NAG)6第22頁,共64頁，星期六，2024年，5月Back第23頁,共64頁，星期六，2024年，5月第4個糖殘基D環(huán)因空間原因必須由正常的椅式變形為能量較高的半椅式構(gòu)象。因此糖苷鍵的穩(wěn)定性降低，鍵容易從此斷裂。Back第24頁,共64頁，星期六，2024年，5月H218O溶液中酶促水解底物(NAG)6的實驗證明酶切位點在D糖基的C1和E殘基的糖苷鍵的O之間。第25頁,共64頁，星期六，2024年，5月Glu35的-COOH提供一個H+到D與E之間的糖苷鍵O原子上。糖苷鍵斷開，形成正碳離子過渡態(tài)中間產(chǎn)物。Asp52對中間產(chǎn)物有穩(wěn)定作用。EF離開酶分子。正碳離子中間體與溶劑中的OH-反應(yīng)，ABCD離開。同時Glu35質(zhì)子化。Back第26頁,共64頁，星期六，2024年，5月（二）絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶家族的所有成員在其活性部位都含有Ser殘基，并且催化機制也相似。具有消化作用的絲氨酸蛋白酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。胰凝乳蛋白酶機制的動力學特征分?；兔擋；瘍刹?。Ser195的異常反應(yīng)性與催化三聯(lián)體有關(guān)。絲氨酸蛋白酶的催化機制提供了一種典型的酸堿催化和共價催化的例子。第27頁,共64頁，星期六，2024年，5月絲氨酸蛋白酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶枯草桿菌蛋白酶凝血酶彈性蛋白酶纖溶酶組織纖溶酶原激活劑Back第28頁,共64頁，星期六，2024年，5月三種消化酶在胰腺中合成，以非活性的酶原形式分泌到消化道中，在消化道中通過胰蛋白酶水解除去部分肽鏈，轉(zhuǎn)變成活性酶形式。第29頁,共64頁，星期六，2024年，5月3個極性殘基：His57、Asp102和Ser195在活性部位形成催化三聯(lián)體。第30頁,共64頁，星期六，2024年，5月胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的底物結(jié)合口袋決定了各自的專一性。Back第31頁,共64頁，星期六，2024年，5月胰凝乳蛋白酶機制可以通過人工合成底物——簡單的有機酯進行研究。第32頁,共64頁，星期六，2024年，5月胰凝乳蛋白酶同乙酸－p－硝基苯酯反應(yīng)的動力學曲線第33頁,共64頁，星期六，2024年，5月胰凝乳蛋白酶的機制分兩個階段：

第一步是乙酰復(fù)合體的形成，稱為?；饔?。第二步是乙酰復(fù)合體通過水解再生為游離的酶，稱為脫酰作用。Back第34頁,共64頁，星期六，2024年，5月胰凝乳蛋白酶中的催化三聯(lián)體。Back第35頁,共64頁，星期六，2024年，5月絲氨酸蛋白酶的催化機制第36頁,共64頁，星期六，2024年，5月胰蛋白酶的催化機制Back第37頁,共64頁，星期六，2024年，5月9.4、酶活性的調(diào)控機制酶活性的調(diào)節(jié)可以通過改變其結(jié)構(gòu)而使其催化活性發(fā)生改變，也可以通過改變其含量來改變其催化活性，還可以通過以不同形式的酶在不同組織中的分布差異來調(diào)節(jié)代謝活動。第38頁,共64頁，星期六，2024年，5月（一）酶結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)通過對現(xiàn)有酶分子結(jié)構(gòu)的影響來改變酶的催化活性。這是一種快速調(diào)節(jié)方式。別構(gòu)調(diào)控酶原激活共價調(diào)控Next第39頁,共64頁，星期六，2024年，5月別構(gòu)調(diào)控酶分子的非催化部位與某些化合物非共價結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象的改變，進而改變酶活性狀態(tài)，稱為酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)（allostericregulation）。具有這種調(diào)節(jié)作用的酶稱為別構(gòu)酶（allosericenzyme）。凡能使酶分子發(fā)生別構(gòu)作用的物質(zhì)稱為效應(yīng)物（effector）或別構(gòu)劑。因別構(gòu)導致酶活性增加的物質(zhì)稱為正效應(yīng)物（positiveeffector）或別構(gòu)激活劑，反之稱為負效應(yīng)物（negativeeffector）或別構(gòu)抑制劑。第40頁,共64頁，星期六，2024年，5月當別構(gòu)酶的一個亞基與其配體（底物或別構(gòu)劑）結(jié)合后，能夠通過改變相鄰亞基的構(gòu)象而使其對配體的親和力發(fā)生改變，這種效應(yīng)就稱為別構(gòu)酶的協(xié)同效應(yīng)。別構(gòu)劑一般以反饋方式對代謝途徑的起始關(guān)鍵酶進行調(diào)節(jié)，常見的為負反饋調(diào)節(jié)。ABCDPE1E2E3En第41頁,共64頁，星期六，2024年，5月別構(gòu)酶的基本性質(zhì)別構(gòu)酶一般是寡聚酶，通過次級鍵由多亞基構(gòu)成。因別構(gòu)酶有協(xié)同效應(yīng)，故其[S]對v的動力學曲線不符合米氏方程。效應(yīng)物可分為K型和V型兩種類型。別構(gòu)酶經(jīng)加熱或化學試劑處理，可引起別構(gòu)酶解離，失去調(diào)節(jié)活性，稱為脫敏作用。第42頁,共64頁，星期六，2024年，5月多亞基調(diào)節(jié)亞基催化亞基協(xié)同效應(yīng)別構(gòu)激活劑別構(gòu)抑制劑正協(xié)同負協(xié)同Back第43頁,共64頁，星期六，2024年，5月別構(gòu)酶的動力學[S]對v的動力學曲線不是雙曲線，而是S形曲線（正協(xié)同）或表觀雙曲線（負協(xié)同），兩者均不符合米氏方程。2米氏曲線1負協(xié)同3正協(xié)同321V0[S]V第44頁,共64頁，星期六，2024年，5月飽和比值（Rs）可用來鑒別不同的協(xié)同作用以及協(xié)同的程度。典型的米氏類型的酶Rs=81

具有正協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶Rs<81，Rs正協(xié)同效應(yīng)具有負協(xié)同效應(yīng)的別構(gòu)酶Rs>81，Rs負協(xié)同效應(yīng)第45頁,共64頁，星期六，2024年，5月意義：在很小的濃度（底物、調(diào)節(jié)物）范圍內(nèi)嚴格控制酶活力，因此是生物代謝中許多代謝途徑的關(guān)鍵酶。別構(gòu)激活別構(gòu)抑制V0[S]底物敏感區(qū)2米氏曲線1負協(xié)同3正協(xié)同321V0[S]VBack第46頁,共64頁，星期六，2024年，5月K型效應(yīng)物和V型效應(yīng)物BackK型V型第47頁,共64頁，星期六，2024年，5月別構(gòu)模型齊變模型（WMC）別構(gòu)酶的所有亞基，或全部呈堅固緊密的，不利于結(jié)合底物的“T”狀態(tài)，或者全部是松散的，有利于結(jié)合底物的"R"狀態(tài)，這兩種狀態(tài)間的轉(zhuǎn)變對于每個亞基都是同時的，齊步發(fā)生的。"T"狀態(tài)中亞基的排列是對稱的，變成"R"狀態(tài)后亞基的排列仍然是對稱的。適于解釋由底物調(diào)節(jié)的效應(yīng)第48頁,共64頁，星期六，2024年，5月序變模型（KNF）酶分子中的亞基結(jié)合小分子物質(zhì)（底物或調(diào)節(jié)物）后，亞基構(gòu)象逐個地依次變化，因此亞基有各種可能的構(gòu)象狀態(tài)。

非底物調(diào)節(jié)的效應(yīng)用序變模式說明較好。Back第49頁,共64頁，星期六，2024年，5月酶原的激活處于無活性狀態(tài)的酶的前體物質(zhì)就稱為酶原。酶原在一定條件下轉(zhuǎn)化為有活性的酶的過程稱為酶原的激活。酶原的激活過程通常伴有酶蛋白一級結(jié)構(gòu)的改變。酶原分子一級結(jié)構(gòu)的改變導致了酶原分子空間結(jié)構(gòu)的改變，使催化活性中心得以形成，故使其從無活性的酶原形式轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘拿?。舉例：消化系統(tǒng)蛋白酶原的激活，凝血機制。第50頁,共64頁，星期六，2024年，5月第51頁,共64頁，星期六，2024年，5月Back第52頁,共64頁，星期六，2024年，5月共價調(diào)控酶蛋白分子中的某些基團可以在其他酶的催化下發(fā)生共價修飾，從而導致酶活性的改變，稱為共價修飾調(diào)節(jié)。

共價調(diào)節(jié)酶的兩個主要特點：

1、通過可逆的共價修飾調(diào)節(jié)酶活性；

2、導致級聯(lián)式放大反應(yīng)。第53頁,共64頁，星期六，2024年，5月共價修飾的主要方式是磷酸化和脫磷酸化。蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)－npi蛋白激酶蛋白磷酸酶第54頁,共64頁，星期六，2024年，5月第55頁,共64頁，星期六，2024年，5月蛋白激酶A是cAMP依賴性蛋白激酶。第56頁,共64頁，星期六，2024年，5月磷酸化酶激酶通過磷酸化作用使無活性的磷酸化酶b轉(zhuǎn)化為有活性的磷酸化酶a。第57頁,共64頁，星期六，2024年，5月Back第58頁,共64頁，星期六，2024年，