GB/T 43160-2023 梨火疫病菌檢疫鑒定方法（正式版）

ICSCCS65.020.20梨火疫病菌檢疫鑒定方法DetectionandidentificationofErwiniaamy國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會國家市場監(jiān)督管理總局發(fā)布國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會IGB/T43160—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由全國植物檢疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(SAC/TC271)提出并歸口。本文件起草單位：中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院、塔里木大學(xué)、三亞中國檢科院生物安全中心、上海海1GB/T43160—2023梨火疫病菌檢疫鑒定方法害的田間調(diào)查與監(jiān)測。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。輸工具等多種自然因素及人為因素均可引起梨火疫病的傳播。其中，染病的植物繁殖材料是梨火疫病遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。梨火疫病菌的其他信息參見附錄A。5方法原理根據(jù)梨火疫病菌與抗體之間的特異性反應(yīng)進(jìn)行免疫學(xué)檢測；根據(jù)梨火疫病菌的特異性DNA序列6儀器設(shè)備和主要試劑2×PCR反應(yīng)預(yù)混液、2×熒光PCR反應(yīng)預(yù)混液等，緩沖液及培養(yǎng)基按附錄B配制，除另有規(guī)定2GB/T43160—20237檢疫鑒定方法7.1癥狀檢查檢查植株有無梨火疫病的典型癥狀見附錄A中的癥狀描述，早春為重點(diǎn)監(jiān)測時(shí)期。主要檢查嫩否從葉柄基部向上變黑；枝干是否有潰瘍斑以及病組織上是否有菌膿。對出現(xiàn)典型癥狀或疑似癥狀的狀的幼嫩枝條，應(yīng)重點(diǎn)對其頂端和基部取樣。7.2樣品的制備樣品采集后應(yīng)盡快檢測，若不能及時(shí)檢測，樣本應(yīng)在4℃~8℃下保存，盡可能不超過一周。采集樣品以及在運(yùn)輸和處理過程中應(yīng)注意避免交叉污染。樣品處理應(yīng)采用分離培養(yǎng)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)檢測都有效的通用程序。樣品用無菌蒸餾水或pH7.2的磷酸鹽緩沖液(PBS)處理，直接用于分離培養(yǎng)、免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢測。盡量選擇表現(xiàn)出最典型癥狀并帶有菌膿的植物部位(花朵、嫩梢、幼枝、葉片或果實(shí))。挑取病健交界部位的植物組織，切成約0.1g～1.0g的小塊，放入裝有適量PBS或無菌蒸餾水的離心管或培養(yǎng)皿中研磨或擠壓，靜置至少5min,制成樣品懸浮液，用于后續(xù)分離培養(yǎng)、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測。7.2.2無癥植株樣品的制備無癥狀樣品宜單個處理，或者最多10個一組。樣品處理和提取過程中小心避免交叉污染。開花期開始至果實(shí)膨大中期，采集花器、幼果幼梢枝段，裝入無菌袋或容器中。從待檢植株上剪下長度約為20cm的嫩梢或花期時(shí)的花器。如果在冬天進(jìn)行采樣檢測，從每株植物上采集5個～10個花蕾。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，從挑選的植株上剪下花期時(shí)的花器、花梗和嫩梢下部幾個葉片的葉柄基部或莖段。稱取0.1g～1.0g植物材料，浸漬在7.2.1描述的無菌蒸餾水或磷酸鹽緩沖液中，制成樣品懸浮液。處理由多個植物材料組成的樣品時(shí)，可將其放入裝有適量PBS或無菌蒸餾水的無菌三角瓶中，置于搖床中室溫劇烈振蕩1h,制成樣品懸浮液，可直接用于后續(xù)分析，也可將懸浮液轉(zhuǎn)移至50mL離心管中12000r/min離心20min,棄上清液，向沉淀中加入2mL無菌蒸餾水或磷酸鹽緩沖液使其重新懸7.3免疫學(xué)檢測對于疑似癥狀樣品，如新鮮的葉片、幼果等，可利用商品化免疫膠體金試紙條進(jìn)行采用商品化酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法進(jìn)行檢測，按照說明書進(jìn)行操作及結(jié)果判定。若檢測結(jié)果為陰性，直接判定為未檢出梨火疫病菌。若檢測結(jié)果為陽性，需進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定及致病性測定。亦可不進(jìn)行免疫學(xué)檢測，直接進(jìn)行分子生物學(xué)檢測。7.4分子生物學(xué)檢測對于植株樣品，按照步驟7.2的方法制備成樣品懸浮液或樣品富集液后，直接用商業(yè)化植物基因組DNA提取試劑盒按照操作說明書提取樣品總DNA,—20℃保存?zhèn)溆谩τ诜蛛x培養(yǎng)得到的疑似菌株，可直接或經(jīng)裂解處理后(取適量菌懸液于1.5mL離心管中，97℃3GB/T43160—2023沸水浴10min;12000r/min離心10min,取上清液，-20℃保存)作為分子生物學(xué)檢測反應(yīng)模板。7.4.2PCR凝膠電泳檢測以E.amylovora標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽性對照，以非E.amylovora的植物細(xì)菌作陰性對照，以雙蒸水代替模板作為空白對照，同時(shí)利用靶標(biāo)在梨火疫病菌質(zhì)粒pEA29及染色體基因上的兩對特異性擴(kuò)增引物對待測樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增及凝膠電泳檢測，具體檢測步驟按附錄C執(zhí)行。7.4.3實(shí)時(shí)熒光PCR檢測實(shí)時(shí)熒光PCR檢測具體步驟按附錄D執(zhí)行，對照設(shè)置同7.4.2。7.5分離培養(yǎng)鑒定按照步驟7.2的方法制備成樣品懸浮液或樣品富集液后，用滅菌接種環(huán)醮取懸浮液于超凈工作臺內(nèi)在LB培養(yǎng)基平板上劃線分離，或者用無菌水對樣品懸浮液進(jìn)行10倍梯度稀釋，各取100μL稀釋液涂板分離，各重復(fù)3次。將培養(yǎng)基平板放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，25℃恒溫培養(yǎng)24h～48h,挑取可疑單菌落進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接2次～3次，隨后進(jìn)行致病性測定、Biolog鑒定、免疫學(xué)或分子生物學(xué)鑒定。在LB培養(yǎng)基上，梨火疫病菌形成乳白色菌落，菌落較大而凸起，光滑呈透鏡狀，而常見的污染菌草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)在LB培養(yǎng)基上則形成黃色菌落。7.6Biolog鑒定分離物在培養(yǎng)后轉(zhuǎn)移至BUG培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)24h,按照Biolog使用說明，調(diào)整分離物菌懸。微孔板30℃下培養(yǎng)18h后用7.7致病性測定取梨幼果(直徑約3cm～5cm)洗凈晾干，用滅菌刀片橫切果實(shí)，置墊有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿上(加少量無菌水)。用接種針蘸取在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h～36h的待鑒定菌落，針刺接種到幼果的果肉組織，一個橫切面接種3個～4個點(diǎn)。接種后，26℃保濕培養(yǎng)，誘導(dǎo)發(fā)病和菌膿的形成。24h后，觀察接種部位有無壞死和菌膿產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)以無菌水為對照。剪取梨樹當(dāng)年生的幼嫩枝梢，插于盛有自來水的三角瓶中，用接種針蘸取在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h～36h的待鑒定菌落，刺傷接種到頂端生長點(diǎn)下約5cm～10cm處；也可刺傷后，在刺傷點(diǎn)接種1滴(3μL～5μL)濃度為10?CFU/mL的病菌懸浮液。接種后套袋25℃左右保濕培養(yǎng)，2d～3d后觀察接種點(diǎn)是否出現(xiàn)變黑、組織干癟、枝梢萎蔫等癥狀及是否出現(xiàn)菌膿。8結(jié)果判定對于有典型癥狀的植株樣品，免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢測結(jié)果為陽性，即判定為檢出梨火疫病菌。對于無癥狀樣品，免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢測結(jié)果為陽性，初步判定為檢出梨火疫病菌，若分離培養(yǎng)出典型菌落，Biolog鑒定為陽性或致病性測定出現(xiàn)典型癥狀，則確定檢出梨火疫病菌。其中，分子生物學(xué)檢測可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，按照7.4.2或7.4.3進(jìn)行，任意一種檢測方法的結(jié)果為陽4GB/T43160—2023性則判定分子生物學(xué)檢測結(jié)果為陽性。致病性測定可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件，按照7.7.1或7.7.2進(jìn)行，任意一種測定方法出現(xiàn)典型癥狀則判定致病性測定結(jié)果為陽性。9樣品及資料保存9.1樣品及菌種保存樣品經(jīng)登記和經(jīng)手人簽字后妥善保存。對檢出梨火疫病菌的樣品應(yīng)保存于4℃冰箱中，以備復(fù)核。該類樣品保存期滿后應(yīng)經(jīng)高壓滅菌后再處理。從檢測樣品中分離并鑒定為梨火疫病菌的菌株，應(yīng)妥善保存。可采用甘油保存于超低溫冰箱或凍干保存。對不需要長期保存的菌株應(yīng)及時(shí)滅菌處理。9.2結(jié)果記錄與資料保存員的簽字。現(xiàn)場檢疫發(fā)現(xiàn)的可疑癥狀、培養(yǎng)基上的菌落特征和人工接種的典型癥狀等應(yīng)及時(shí)拍照保存，酶聯(lián)免疫方法應(yīng)有酶聯(lián)反應(yīng)的原始數(shù)據(jù)，PCR凝膠電泳檢測應(yīng)有電泳結(jié)果照片，熒光PCR檢測應(yīng)有原始數(shù)據(jù)。5GB/T43160—2023(資料性)A.1名稱與分類地位分類地位：細(xì)菌界(Bacteria),變形菌門(Proteobacteria),γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria),腸桿菌目(Enterobacteriales),腸桿菌科(Enterobacteriaceae),歐文氏菌屬(Erwinia)。A.2地理分布A.3寄主范圍唐棣屬(Amelanchier)[榿葉唐棣(A.alnifolia)、加拿大唐棣(A.canadensis)、平滑木瓜屬(Chaenomeles)[日本木瓜(C.japonica)、貼梗海棠(C.lagenaria)、木瓜(C.sinensis)]、枸子屬(Cotoneaster)[(匍匐枸子(C.adpressus)、藏邊枸子(C.affinis)、四川枸子(C.ambigena)、細(xì)尖枸子(C.apiculata)、泡葉枸子(C.bullatus)、多花泡葉枸子(C.bullatusvar.floribundus)、黃楊葉枸子6GB/T43160—2023carpus)、小葉枸子(C.microphyllus)、光澤枸子(C.nitens)、暗紅枸子(C.obscurus)、氈毛枸子柿(Diospyroskaki)、君遷子(Diospyroslotus)、云南移(木衣)(Docyniadelavayi)、枇杷屬(Eriobotrya)[(枇杷(E.japonica)]、草莓屬(Fragaria)[智利草莓(F.chiloensis)]、蟲菊(Fragariavirginiana)、加州黑胡桃(Juglanscalifornica)、印度黑胡桃(Juglanshindsii)、黑胡桃(Juglans(M.microm.)、楸子(M.prunifolia)、蘋果(M.pumila)、西伯利亞海棠(M.robusta)、三葉海棠根尼李(Prunusalleghaniensis)、杏(Prunusarmeniaca)、歐洲甜櫻桃(Prunusavium)、比西氏櫻salicina)、杏李(Prunussimonii)、美國稠李(Prunusvirginiana)、火棘屬(Pyracantha)[窄葉火棘毛草原薔(R.setigera)]、懸鉤子屬(Rubus)[復(fù)盆子(R.idaeus)]、花楸屬(Sorbus)[美洲花楸(S.(Stranvaesiadavidiana)[波葉紅果樹(S.davidianavar.undulata)]。A.4危害癥狀b)枯梢和枯枝：病菌侵染當(dāng)年生新梢(以春梢為主),侵入點(diǎn)最初表現(xiàn)為表皮變黑，病斑向上下擴(kuò)GB/T43160—2023梨火疫病在梨樹上的危害癥狀與亞洲梨火疫病無十分明顯的差別，唯一的癥狀區(qū)別是典型的梨火圖A.2果柄菌膿癥狀圖A.3幼枝葉片干枯癥狀圖A.4枝條8GB/T43160—2023(規(guī)范性)緩沖液及培養(yǎng)基的配制氯化鈉(NaCl)8.0g;氯化鉀(KCl)0.2g;十二水磷酸氫二鈉(Na?HPO?·12H?O)2.9g;磷酸二氫鉀(KH?PO?)0.2g;蒸餾水加至1.0L,攪拌混勻至溶解。B.2LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10.0g;酵母浸膏5.0g;氯化鈉(NaCl)10.0g;瓊脂15.0g;蒸餾水加至1.0L,調(diào)節(jié)pH到7.5,濕熱滅菌(121℃,20min)。B.3BUG瓊脂培養(yǎng)基BUG瓊脂培養(yǎng)基57.0g,蒸餾水加至1.0L,調(diào)節(jié)pH到7.4,濕熱滅菌(121℃,20min)。9GB/T43160—2023(規(guī)范性)PCR凝膠電泳檢測PCR檢測引物見表C.1。引物名稱引物序列退火溫度產(chǎn)物大小pEA29A5'-CGGTTTTTAACGCTGGG-3'約1kbpEA29B5'-GGGCAAATACTCGGATT-3'FER1-F5'-AGCAGCAATTAATGGCAAGTATAGTCA-3rgER2-R5'-AAAAGAGACATCTGGATTCAGACAAT-3′PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min;94℃30