(高清版)GBT 40903-2021 紡織品 DNA分析法鑒別某些特種動物纖維 山羊絨、綿羊毛、牦牛絨及其混合物

紡織品DNA分析法鑒別某些特種動物纖維Textiles—IdentificationCashmere,wool,yakandthei 國家市場監(jiān)督管理總局國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會 I 1 13術(shù)語和定義 1 2 26設(shè)備和儀器 2 3 4 410驗(yàn)證 711結(jié)果判定 8 913試驗(yàn)報告 附錄A(資料性)特定長度的DNA片段PCR擴(kuò)增 附錄B(資料性)額外的DNA純化 附錄D(資料性)各類紡織產(chǎn)品的應(yīng)用實(shí)例 附錄E(資料性)方法重復(fù)性和再現(xiàn)性 I——第3章對應(yīng)ISO18074:2015中的第4章；——第4章對應(yīng)ISO18074:2015中的第5章；——第5章對應(yīng)ISO18074:2015中的第2章；Ⅱ12與山羊絨線粒體DNA序列一致的引物。與綿羊毛線粒體DNA序列一致的引物。與牦牛絨線粒體DNA序列一致的引物。檢測特定長度的DNA片段的方法。4原理通過化學(xué)和酶的處理抽提出動物纖維中的DNA,經(jīng)離心沉淀對DNA進(jìn)行純化。分別使用山羊DNA分析的鑒別結(jié)果在樣品染色處理程度較輕或是淺色染色的情況下有著很高的準(zhǔn)確性。當(dāng)紡織產(chǎn)品經(jīng)過深度加工或高溫處理時，線粒體DNA可能遭到破壞。在此情況下，由于PCR擴(kuò)增受到抑制，使鑒別產(chǎn)生一定的困難。紡織產(chǎn)品如受別的物種污染，比如綿6.1微量移液器及吸頭：能夠準(zhǔn)確移取(0～20)μL(±0.20μL),(20～200)μL(±1.60μL),(200~37.6緩沖溶液A: NaCl,170mg;47.12DNA組成成分(dNTP):59.4.7將超濾離心裝置于4℃,14000g離心12min。6引物名稱引物序列山羊絨下游下游下游通用下游—MgCl?,1.5mmol。7溫度/時間1擴(kuò)增最后的延伸119.6.2.6將凝膠置于可密封塑料盒(6.12)中。加入含有EB的溶液100mL,將凝膠在溶液中浸染8在9.3描述的DNA抽提過程不投入動物纖維，即DNA反應(yīng)溶液中無樣品DNA。每批試驗(yàn)均需性對照。每次試驗(yàn)均需完成一次添加動物纖維的抽提擴(kuò)增。該驗(yàn)證可觀察到PCR擴(kuò)增。當(dāng)10.3所述陽性對照未出現(xiàn)擴(kuò)增片段時，進(jìn)行本操作。在PCR反應(yīng)體系中加入指定的單個陽性參照DNA,此時應(yīng)能觀察到特定物種的PCR擴(kuò)增。當(dāng)10.2所述陰性對照出現(xiàn)了陽性條帶時，進(jìn)行本操作。PCR反應(yīng)液中不加DNA,應(yīng)觀察不到若動物纖維的試驗(yàn)結(jié)果為陰性，則將DNA標(biāo)準(zhǔn)引物及相應(yīng)的DNA加入反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)PCR反應(yīng)溶液樣品DNA加入反應(yīng)DNA加入反應(yīng)纖維制樣否是否否否是是否否否是是否否否擴(kuò)增是是是是是檢測是是是是是 當(dāng)反應(yīng)體系不含DNA(10.2和10.5)發(fā)生了擴(kuò)增時，此次試驗(yàn)不可信；當(dāng)驗(yàn)證試驗(yàn)中有加入特定片段應(yīng)通過與其參照遷移DNAmarker的信號強(qiáng)度比較來判定。9——當(dāng)驗(yàn)證試驗(yàn)完全正常時，可通過特定動物引物是否引起DNA擴(kuò)增產(chǎn)物來確定動物纖維的DNA不提取，DNA提取，纖維樣品擴(kuò)增不擴(kuò)增擴(kuò)增擴(kuò)增不擴(kuò)增擴(kuò)增不擴(kuò)增不擴(kuò)增擴(kuò)增擴(kuò)增不擴(kuò)增擴(kuò)增者未擴(kuò)增的擴(kuò)增可信不擴(kuò)增 不擴(kuò)增擴(kuò)增—不擴(kuò)增a)采用的文件編號；c)聚合酶及PCR的反應(yīng)條件；d)產(chǎn)品組分的測定結(jié)果；e)其他偏離所述操作的詳細(xì)說明。DNA擴(kuò)增經(jīng)歷以下步驟。每經(jīng)過一個完整的PCR循環(huán)DNA片段就會倍增。如圖A.1的圖文表反應(yīng)中起到引發(fā)和有選擇性地引導(dǎo)單核苷酸復(fù)制成為新的DNA鏈。DNA片段的長度由這一步驟A.2.3第2步：兩種擴(kuò)增同時在這一步發(fā)生：1)第1步的擴(kuò)增；2)另一種擴(kuò)增。另一種擴(kuò)增是以第1步因此，擴(kuò)增生成的DNA片段經(jīng)熱處理再次解旋成為DNA單鏈。目前有三種長度的單鏈DNA,來A.2.4第3步：第1步和第2步的擴(kuò)增繼續(xù)進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)生了大量長度由兩端引物決定的新的DNAA.2.5第4步：第1步、第2步、第3步繼續(xù)重復(fù)進(jìn)行。最主要的擴(kuò)增發(fā)生在兩端由引物決定長度的圖A.1DNA片段的PCR擴(kuò)增過程(資料性)一種使用磁珠法去除染料和色素的例子。所使用的試劑盒為Promega1)DC6701。核酸與表面修飾的B.2DNA純化方法C.3.1蛋白酶K溶液：稱取180mg蛋白酶(>30單位/mg),溶于10mL水中，分裝后置于-20℃C.3.9三氯甲烷?！狢TAB(C.3.3),2g;———0.5mol/LEDTA(C.3.4),40mL;———1mol/LTris-HCl(C.3.7),100m標(biāo)簽標(biāo)有山羊絨的染色產(chǎn)品購自市場。這些樣品同時進(jìn)行了顯微鏡檢測和DNA分析，O表示檢表D.1實(shí)際樣品的DNA分析結(jié)果顯微鏡觀察山羊絨山羊絨1OO2OO3紫色針織OO4OO5OOOOO6OOOOOO7黑色針織OOO8OOO9OOOOOOOOOO黑色毛氈OOOOOOOOOOOOOOO黑色針織OO(弱)OO(弱)OOOOO黑色針織OO黑色針織OOOOOOOO黑灰針織OOOOE.1.1.2聚合酶及PCR條件MMCYWCYWCYWCYWCYWCYWCMM陽性對照所用的樣品即為E.1中使用的100%樣品。引物樣品山羊絨綿羊毛陰性對照山羊絨綿羊毛織物A為一塊黑色50%山羊絨/50%綿[1]GB/T6529紡織品調(diào)濕和試驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)大氣(GB[2]GB/T11951天然纖維術(shù)語(GB/T11951—2018,ISO6938:2012,MOD)[3]GB/T36433紡織品山羊絨和綿羊毛的混合物DNA定量分析熒光PCR法[5]Ausubel,F.M.;Brent,R.;Kingston,R.E.;Moore,E.E.;SeidmaK.CurrentProtocolsinM