分子病理學(xué)常用研究方法專家講座

分子病理學(xué)慣用研究方法

(一)分子病理學(xué)常用研究方法第1頁基因變異診療

分子病理學(xué)常用研究方法第2頁Southernblot,

PCR,

RT-PCR,Real-TimeRT-PCR,

FISH分子遺傳學(xué)異常檢測方法分子病理學(xué)常用研究方法第3頁檢測基因丟失和擴增

比較基因組雜交ComparativeGenomicHybridization,CGH分子生物學(xué)技術(shù)與細胞遺傳學(xué)方法相結(jié)合優(yōu)點：1.新鮮材料和福爾馬林固定石蠟包埋材料均可進行CGH研究2.被測樣品只需數(shù)mg甚至不到1mgDNA分子病理學(xué)常用研究方法第4頁分子病理學(xué)常用研究方法第5頁CGH應(yīng)用：為搜尋腫瘤癌基因或抑癌基因確定范圍腫瘤細胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)增加，往往提醒該位置可能包含已知或未知癌基因有擴增腫瘤細胞染色體某一位置上DNA序列拷貝數(shù)降低或缺失，提醒該位置可能包含已知或未知抑癌基因丟失CGH發(fā)覺MYCN，MET與胃癌相關(guān)分子病理學(xué)常用研究方法第6頁區(qū)分良惡性病變，臨床上預(yù)計預(yù)后

16例前列腺癌CGH顯示染色體異常占81%5例良性前列腺增生全部陰性

67肝細胞癌CGH顯示:1q,8q,20q,17q↑4q,8p,13q,16q↓12例癌周肝硬化組織：陰性

53例淋巴結(jié)陰性乳腺癌：8q,11q13,17q,20q異常，預(yù)后差

分子病理學(xué)常用研究方法第7頁蛋白組學(xué)及生物芯片分子病理學(xué)常用研究方法第8頁生物芯片（biochip)是指采取光導(dǎo)原位合成或微量點樣等方法將大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、RNA）或多肽分子甚至細胞等生物樣品有序地固定于支持物（玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝膠、尼龍膜等載體）表面，組成密集二維分子排列，然后與已標識待測生物樣品中靶分子雜交，經(jīng)過特定儀器如激光共聚焦掃描或電荷偶聯(lián)攝影像機（CCD）對雜交信號強度進行快速、并行、高效地檢測分析，從而判斷樣品中靶分子數(shù)量改變。

分子病理學(xué)常用研究方法第9頁生物芯片：基因芯片蛋白質(zhì)芯片細胞芯片組織芯片基因芯片(Affymetrix專利）

寡核苷酸芯片，cDNA芯片，基因組芯片

DNAmicroarray:陣密度很高玻片基質(zhì)或膠膜基質(zhì)DNA微陣列DNAmacroarray:陣密度較低尼龍膜DNA微陣列

分子病理學(xué)常用研究方法第10頁雜交組織化學(xué)-概述一、概述和原理

雜交組織/細胞化學(xué)(Hybridohistochemistry)

原位分子雜交(Insituhybridization,ISH)利用核酸分子間鹼基互補性質(zhì)結(jié)合免疫組織化學(xué)技術(shù)在組織切片(或細胞片)上顯示特異核酸(DNA或RNA)序列一個技術(shù)。分子病理學(xué)常用研究方法第11頁雜交組織化學(xué)原理標識探針雜交變性標識探針

──

互補核酸次序DNA/cDNADNADNA/cDNARNARNARNA分子病理學(xué)常用研究方法第12頁核酸分子雜交種類：固相雜交(硝酸纖維素膜或尼龍膜)Southern印跡轉(zhuǎn)移(DNA)Northern印跡轉(zhuǎn)移(RNA)

液相雜交原位雜交原位雜交四要素：

適當探針良好組織材料可靠試劑和方法相當形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)分子病理學(xué)常用研究方法第13頁二、探針制備1.探針種類和制備

DNA探針：應(yīng)用多，操作輕易比較敏感，背景高(本身網(wǎng)絡(luò))雙鏈DNA探針用時要變性

整合

轉(zhuǎn)化擴增DNA片段───質(zhì)粒(或其它載體)───細菌───

提取酶切───質(zhì)粒───探針(PCR擴增)分子病理學(xué)常用研究方法第14頁線性質(zhì)粒提取質(zhì)粒擴增探針重組質(zhì)粒質(zhì)粒酶切插入轉(zhuǎn)染探針分子病理學(xué)常用研究方法第15頁RNA探針：結(jié)合穩(wěn)定，穿透性好無需變性，不存在退火問題未雜交探針可用RNase去除，背景好多采取體外轉(zhuǎn)錄法合成同時加以標識

寡核苷酸探針：合成快速，不用變性，對RNase不敏感30-150bp，組織通透性好未端標識，敏感度不夠多采取DNA合成儀固相合成分子病理學(xué)常用研究方法第16頁探針選擇:特異性多項選擇擇基因組5'或3'端20-50對堿基互補就已穩(wěn)定

大小200-300對堿基互補可獲強復(fù)合體原位雜交多項選擇擇100-400bp(<1000bp)種類穩(wěn)定性：RNA-RNA>DNA-RNA>DNA-DNA分子病理學(xué)常用研究方法第17頁2.探針標識

標識物：同位素,非同位素,修飾物同位素：敏感，定位較差，試驗室要求高

探針使用周期短

32P放射過強,定位差,半衰期短(14.3天)

35S最慣用,定位好,曝光時間短(數(shù)天),半衰期較長(84天)

125I與35S相同，但半衰期較短(60天)

3H慣用,放射能小,定位準確,曝光時間長(數(shù)周),半衰期長分子病理學(xué)常用研究方法第18頁非同位素：定位很好，試驗室要求低，可長久使用

生物素：最早用，特點與免疫組化相同地高辛：最慣用，敏感性高，特異性好熒光素：方法簡便，敏感性低，多用于染色體檢驗

修飾物(現(xiàn)少用)：磺基化(Sulphon基團)乙酰氨基芴光敏生物素汞分子病理學(xué)常用研究方法第19頁

標識方法

引入法：利用標識好核苷酸合成探針缺口翻譯法隨機引物法末端標識法PCR擴增標識法RNA體外合成法化學(xué)修飾法：化學(xué)修飾已合成探針分子病理學(xué)常用研究方法第20頁缺口翻譯/平移法：雙鏈DNA標識，線環(huán)狀均可分子較大(>1KB)者效果好DNA用量較多(>200ng)標識率低原理：DNA酶(DNaseI)在雙鏈DNA分子中導(dǎo)入缺口DNA聚合酶(DNApolI，含有5'→3'外切酶和5'→3'聚合酶活性)，使各種核苷酸，包含標識核苷酸自缺口處合成與對應(yīng)鏈互補DNA鏈(探針)變性后標識探針分子小，穿透性好分子病理學(xué)常用研究方法第21頁缺口翻譯/平移法分子病理學(xué)常用研究方法第22頁隨機引物法：單/雙鏈線狀DNA標識，100-500bp亦可DNA用量少(可少至10ng)標識率高(1/20-25)原理：以任意次序六核苷酸片段為引物與單鏈DNA模板結(jié)合后，在DNA聚合酶IKlenow片段(無5'-3'外切酶活性)作用下合成帶標識核苷酸互補DNA鏈(探針)分子病理學(xué)常用研究方法第23頁隨機引物法分子病理學(xué)常用研究方法第24頁1.于Eppendorf離心管中依次加入15μlddH2O1μgDNA(10ng-3μg)100℃10'(變性)干冰聚冷30秒鐘2.加入10×六核苷酸混合物2μl10×dTNP標識混合液2μl

含1mMdATP，1mMdCTP，1mMdGTP，0.65mMdTTP，0.35mMDIG-dUTPKlenow酶(2U/μl)1μl

分子病理學(xué)常用研究方法第25頁3.混合后37℃保溫1-2h(可達20h)4.加入2μlpH8.0200mMEDTA終止反應(yīng)5.加入2μl糖原(10mg/ml)6.加2.5μl4MLiCl或3MNaAc(pH5.5)7.加75μl無水乙醇(-20℃預(yù)冷)8.混合后-70℃30'9.13000g4℃離心15'，棄上清10.加100μl70%乙醇(預(yù)冷)洗，離心棄上清11.真空干燥，加50μlTE(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)溶解，-20℃保留

分子病理學(xué)常用研究方法第26頁末端標識法：用于短鏈DNA或寡核苷酸探針標識敏感性較低40個以上堿基檢測較穩(wěn)定又分3'端標識法和5'端標識法3'端標識法：原理：DIG-11-ddUTP在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作用下與寡核苷酸3'端相連分子病理學(xué)常用研究方法第27頁5'端標識法：原理:在堿性磷酸酶作用下把5‘端磷酸脫去,T4噬菌體多核苷酸激酶將[γ-32P]ATPγ-32P轉(zhuǎn)移到5'端PCR擴增標識法：用于cDNA合成和標識，方法簡單DNA用量少，產(chǎn)量多原理：TaqDNA多聚酶以DNA為模板，在引物引導(dǎo)下合成帶有標識核苷酸cDNA探針。分子病理學(xué)常用研究方法第28頁PCR擴增標識法分子病理學(xué)常用研究方法第29頁1.于Eppendorf離心管中加入10×PCR緩沖液5μl(1×)MgCl22～10μl(1～5mM)引物適量(0.1～1μM)標識/非標識dNTP5μl(200μM，dTTP:Dig-dUTP=3:1)

ddH2O加到50μl模板DNA1～100ngTagDNA多聚酶0.2～1μl(1～5units)分子病理學(xué)常用研究方法第30頁反應(yīng)組對照組1對照組2DNA模板++-Dig-dUTP+--2．混合后PCR儀擴增循環(huán)溫度時間194°C5’94°C45’

2～3155＋0.2°C45’

72°C90’

3272°C5’

334°CHold分子病理學(xué)常用研究方法第31頁3.純化和判定乙醇沉淀法：100μlPCR產(chǎn)物加10μl4MLiCl和300μl預(yù)冷100%乙醇，-20?C，2小時，離心4?C13000g，5分鐘Agarose凝膠電泳分子病理學(xué)常用研究方法第32頁RNA體外合成/標識法：用以合成并同時標識RNA探針產(chǎn)量高，NTP濃度要求低，不用純化原理：將模板DNA(雙鏈)插入帶有噬菌體RNApol開啟子特定質(zhì)粒，在體外RNApol作用下，以DNA為模板、開啟子為起點，合成帶有標記核苷酸RNA探針。分子病理學(xué)常用研究方法第33頁雜交組織化學(xué)RNA體外合成/標識法pGEM分子病理學(xué)常用研究方法第34頁1.

于Eppendorf離心管中加入DNA模板(酶切成線性)1μg

含噬菌體開啟子質(zhì)粒NTP標識混合物2μl

含10mMATP，10mMCTP10mMGTP，6.5mMUTP3.5mMDIG-11-UTP10×反應(yīng)緩沖液2μl

DEPC處理H2O加至17μl分子病理學(xué)常用研究方法第35頁

2.混合后加：RNase抑制劑1μl

RNA多聚酶(SP6/T7)2μl

3.柔和混合后37℃保溫2h

4.加入DNaseⅠ2μl，37℃15'(去除模板DNA)

5.加入2μl200mMpH8.0EDTA

6.加入2.5μl4MLiCl和75μl預(yù)冷乙醇

7.混合后置-70℃，30'或-20℃過夜

8.4℃13000g離心15'，棄上清

9.加100μl70%乙醇(預(yù)冷)洗，離心棄上清10.真空干燥，加100μlDEPC-H2O溶解，-20℃保留

分子病理學(xué)常用研究方法第36頁化學(xué)修飾法：慣用有光敏生物素、磺化可用以標識單/雙鏈DNA或RNA光敏生物素標識：光敏生物素+核酸────標識探針磺化標識：亞硫酸氫鈉和甲基羥胺使胞嘧啶C5磺化，生成Sulphon基團。乙酰氨基芴(AAF)標識：N-acetoxy-AAF與探針一起孵育時，AAF基團與鳥嘌呤核苷殘基共價結(jié)合分子病理學(xué)常用研究方法第37頁3.標識探針純化目標：去除無機鹽、dNTP、酶等方法：沉淀離心法

加入EDTA中止反應(yīng)，再加4MLiCl和乙醇冷凍離心，乙醇洗滌，干燥后用緩沖液溶解

玻璃纖維濾過法

反應(yīng)物與玻璃纖維結(jié)合，清洗，緩沖液洗脫分子病理學(xué)常用研究方法第38頁4.標識結(jié)果檢驗?zāi)繕耍鹤C實標識結(jié)果；預(yù)計探針得率；測試檢測條件非同位素標識探針檢驗：采取斑點印跡法不一樣濃度(10倍梯度稀釋)標識探針點尼龍膜常規(guī)檢測系統(tǒng)顯色未標識探針點膜后用標識探針雜交分子病理學(xué)常用研究方法第39頁不一樣濃度（10倍梯度稀釋）標識探針點尼龍膜DNA／RNA探針：0.01pg～1ng／ul寡核苷酸探針：0.08FM～50fM/ul紫外照光或加熱120℃30’固膜緩沖液1洗膜（100mM馬來酸，150mMNaC1，pH7.5）緩沖液2（1%阻斷劑，緩沖液1配）30’抗DIG一堿性磷酸酶1：5000，孵育30’緩沖液1洗膜緩沖液3浸2’(100mMTris-HC1．100mMNaC1，50mMMgC12，pH9.5）顯色液（NBT：BCIP，9:7），作用0.5～16h緩沖液3洗膜分子病理學(xué)常用研究方法第40頁三、組織處理和標本制作

目標：保留好被測核酸維持形態(tài)結(jié)構(gòu)

方法：新鮮取材、及時固定適當固定液：4%多聚甲醛(用0.1MPB配制)

用于：冰凍或石蠟切片細胞培養(yǎng)片、細胞涂片或切片分子病理學(xué)常用研究方法第41頁DNA穩(wěn)定性好，普通不需特殊處理

RNA酶滅活(雜交前)：組織內(nèi)Rnase:固定劑滅活玻璃器皿：180℃處理3h以上用DEPC(二乙基焦碳酸鹽)水處理試劑：用DEPC水配制和/或高壓消毒帶手套操作RNase抑制劑分子病理學(xué)常用研究方法第42頁檢測RNA時標本制備及玻片處理常規(guī)：

切片處理：切片插架──熱水稀釋中性洗滌劑浸泡30'──流水沖洗──高壓消毒──流水沖洗──蒸餾水洗──180℃3h──APES處理(2%APES/甲醇）室溫1'，甲醇洗──DEPC水洗──陰干

標本處理：4%多聚甲醛(PB配)4℃過夜──乙醇脫水──二甲苯透明──石蠟包埋──切片

DEPC水：0.1DEPC，室溫放置3h，高壓消毒分子病理學(xué)常用研究方法第43頁四、原位分子雜交

要求：提升敏感性降低非特異著色

方法：去垢劑(TritonX-100)：增強組織通透性

蛋白酶(蛋白酶K)消化：增加通透性、去除雜蛋白

稀酸：雜蛋白變性、去內(nèi)源性酶、暴露靶核酸

乙?；幚恚褐泻完栯x子，降低靜電吸引

適當雜交條件：溫度、離子強度、pH探針種類、大小、濃度

雜交液：葡聚糖：增加探針相對濃度魚精DNA、tRNA應(yīng)用：封閉

充分洗滌分子病理學(xué)常用研究方法第44頁1.雜交前處理石蠟切片常規(guī)脫蠟，PB洗片，[TritoX-100]蛋白酶K消化，37℃，(1～15μg/ml，15～120')4%多聚甲醛后固定，室溫10'PB洗片1～2'×2；0.2MHCl，室溫10'；PB洗片1～2'×20.1M三乙醇胺(DEPC-H2O配)，室溫2～3'三乙醇胺/無水乙酸室溫10'PB洗片，室溫2'×270%→80%→90%→100%→100%酒精脫水室溫干燥分子病理學(xué)常用研究方法第45頁2.雜交（預(yù)雜交）滴加雜交工作液，蠟?zāi)どw片，濕盒內(nèi)，50℃16～20h(檢測DNA時要求先變性(90~100度)，探針為雙鏈DNA也要變性)

雜交液：甲酰胺50%Tris-HClpH7.610mMDEPC-H2OEDTApH8.01mM加到50.0mlNaCl600mM-70℃保留Denhart's液1×SDS0.25%分子病理學(xué)常用研究方法第46頁50%×Denhart's液：聚蔗糖(Ficoll400)10g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)10g牛血清白蛋白(BSA)10gDEPC-H2O1000ml雜交工作液：1ml雜交液加tRNA(最終濃度0.3～0.5mg/ml)加標識探針(最終濃度0.5～5μg/ml)每張切片用50μl分子病理學(xué)常用研究方法第47頁雜交條件優(yōu)化：

溫度：溫度高反應(yīng)快，溫度太高破壞組織，普通Tm-25℃G:C多者Tm高(G:C50%Tm約為70℃)甲酰胺可降低雜交溫度(1%下降0.35～0.65℃)

探針：長雜交快(太長時穿透性差)復(fù)雜性高雜交時間長濃度高雜交時間短離子強度和pH：離子強度高雜交體穩(wěn)定性好（0.01-0.4M)兩價陽離子可使DNA結(jié)合牢靠，用EDTA去除慣用50%甲酰胺，pH6.5～7.5，45～65℃，雜交16～20h分子病理學(xué)常用研究方法第48頁3.雜交后處理

洗片：5×SSC，50℃1'去膜；5×SSC，50℃5'2×SSC+50%甲酰胺，50℃30'TNE(Tris-HClpH7.6+NaCl+EDTA)，37℃10'

RnaseA(1mg/100mlTNE)，37℃30'TNE，37℃10'2×SSC，50℃15'；0.2×SSC，50℃15'×2

嚴格度：甲酰胺濃度高溫度高高嚴格度離子強度低分子病理學(xué)常用研究方法第49頁4.顯色反應(yīng)(大致同免疫組化)BufferⅠ(0.1MTris-HClpH7.5含0.15MNaCl)，室溫1'1.5%阻斷劑(用BufferⅠ加熱配制)，室溫45'抗DIG-AP，37℃30～60'，4℃過夜BufferⅠ，室溫15'×2BufferⅢ浸片(0.1MTris-HCl+0.1MNaCl+50mMMgCl2，pH9.5)，室溫5'，顯色液(NBT+BCIP+2mlBufferⅢ)，避光室溫，30'以上TE(10mMpH7.6Tris-HCl+1mMEDTA)中止反應(yīng)H2O洗片甘油明膠封片分子病理學(xué)常用研究方法第50頁5.對照陰性組織片對照陽性組織片對照(包含分布)探針Northernblot檢測探針正義鏈陰性對照不標識探針競爭抑制不含探針陰性對照(顯色階段對照)DNase或RNase消化后陰性對照(非核酸吸附)核酸原位雜交與蛋白產(chǎn)物免疫組化檢測對照其它陽性或陰性對照（載體對照）分子病理學(xué)常用研究方法第51頁四、雜交組化技術(shù)進展1.雙重及多重雜交組化技術(shù)（最好選擇不一樣檢測系統(tǒng)）2.與免疫組化結(jié)合應(yīng)用雙重檢測(普通先作免疫組化)同時檢測核酸和蛋白產(chǎn)物3.電鏡下雜交組化方法與免疫電鏡相同多采取PG或PLP固定、包埋后法、膠體金標識細胞則多用包埋前法分子病理學(xué)常用研究方法第52頁4.原位PCR技術(shù)將PCR與雜交技術(shù)結(jié)合起來，以提升敏感性間接原位PCR：先擴增后雜交方便、敏感、特異性差直接原位PCR：加入引物、標識核苷酸、DNA聚合酶等，直接以靶鏈為模板合成DNA并檢測出相正確DNA雜合體5.原位反轉(zhuǎn)錄PCR（也分直接和間接法）在PCR擴增前先進行反轉(zhuǎn)錄，rTth酶出現(xiàn)使其更為輕易分子病理學(xué)常用研究方法第53頁五、雜交組化應(yīng)用1.病原體檢測病毒：HPV(16，18)──宮頸癌

EBV──鼻咽癌

HBV──肝癌、肝炎──腎炎(IgA腎病)

CMV──AIDS病等原位PCR顯示肝炎肝細胞內(nèi)HCV陽性分子病理學(xué)常用研究方法第54頁

2.腫瘤基因檢測癌基因染色體定位癌基因mRNA檢測──癌基因活化宮頸癌癌細胞內(nèi)p53表示分子病理學(xué)常用研究方法第55頁3.mRNA檢測(敏感性較Northernblot低，可準確到細胞水平)原位雜交顯示腎小球系膜細胞及腎小管上皮細胞TIMP-2陽性分子病理學(xué)常用研究方法第56頁熒光原位雜交---FluorescenceInSituHybridization原理采取熒光標識DNA探針，利用探針與被檢測樣本DNA堿基正確互補性，在探針與樣本DNA雜交后，經(jīng)過熒光顯微鏡檢測熒光信號而得出結(jié)果，從而檢測細胞，組織樣本中染色體異常。分子病理學(xué)常用研究方法第57頁FISH：“釣魚”技術(shù)分子病理學(xué)常用研究方法第58頁分子病理學(xué)常用研究方法第59頁細胞周期不一樣階段分子病理學(xué)常用研究方法第60頁分子病理學(xué)常用研究方法第61頁探針是一段熒光標識核酸（DNA）片段，被用作尋找另一互補DNA(靶標）指示。DNA靶標可能是一個特異性條帶、一個基因、一個染色體片段或一個完整染色體探針（probe)及靶標（target)分子病理學(xué)常用研究方法第62頁適合用于間期FISH標本石蠟切片分離細胞核腫瘤組織印片細胞離心涂片血液或骨髓涂片細胞爬片或切片分子病理學(xué)常用研究方法第63頁FISH探針類型全染色體涂抹探針（WCP）染色體計數(shù)（著絲粒）探針（CEP）位點特異性探針（LSI）雙色分離重排探針雙色雙融合易位探針xyxx分子病理學(xué)常用研究方法第64頁可檢測樣本包含分子病理學(xué)常用研究方法第65頁分子病理學(xué)常用研究方法第66頁臨床應(yīng)用領(lǐng)域分子病理學(xué)常用研究方法第67頁分子病理學(xué)常用研究方法第68頁TERC基因分子病理學(xué)常用研究方法第69頁分子病理學(xué)常用研究方法第70頁

HPV→hTERC=宮頸癌？分子病理學(xué)常用研究方法第71頁分子病理學(xué)常用研究方法第72頁子宮頸癌研究最新進展中國醫(yī)學(xué)論壇報/年/12月/4日/第B03版IGCS會議報道hTERC擴增診療宮頸癌及癌前病變

當前宮頸癌篩查主要經(jīng)過宮頸細胞學(xué)檢驗及人乳頭狀瘤病毒（HPV）檢測，但這些方法臨床應(yīng)用都有一定不足。今年研究致力于尋找新指標來幫助診療宮頸癌前病變，尤其是判別出高度病變，以提升篩查準確性和可預(yù)測性。人端粒酶RNA（hTERC）是人端粒酶組分之一，有研究證實，端粒酶激活是HPV整合入宮頸細胞后，上皮內(nèi)瘤樣病變（CIN）向?qū)m頸癌轉(zhuǎn)化關(guān)鍵步驟。此次大會口頭匯報中北京大學(xué)人民醫(yī)院魏麗惠等提交一項研究頗為引人注目，該研究發(fā)覺，經(jīng)過熒光原位雜交（FISH）檢測宮頸細胞學(xué)涂片中hTERC基因擴增情況，在宮頸癌和癌前病變診療中含有主要價值。分子病理學(xué)常用研究方法第73頁TERC與子宮頸癌級別國內(nèi)1000多例臨床試驗結(jié)果分子病理學(xué)常用研究方法第74頁TERC在臨床中意義分子病理學(xué)常用研究方法第75頁TERC在臨床中意義-風(fēng)險預(yù)測針對HPV高危宮頸癌易感人群,在常規(guī)TCT篩查基礎(chǔ)上,加做TERC基因檢測,可幫助醫(yī)生判斷病人疾病風(fēng)險分子病理學(xué)常用研究方法第76頁

改進子宮頸癌篩查與診療伎倆分子病理學(xué)常用研究方法第77頁TERC在臨床中意義-CIN1患者分流治療分子病理學(xué)常用研究方法第78頁TERC在臨床中意義-CIN1患者分流治療分子病理學(xué)常用研究方法第79頁TERC在臨床中意義-CIN2患者分流治療分子病理學(xué)常用研究方法第80頁TERC在臨床中意義-術(shù)后評定，復(fù)發(fā)監(jiān)測

TERC（-）：手術(shù)病灶切除潔凈，并無復(fù)發(fā)，定時隨訪觀察TERC（+）：高度懷疑有病灶沒有被完全切除，或者有復(fù)發(fā)。依據(jù)病人情況再次進行手術(shù)治療分子病理學(xué)常用研究方法第81頁TERC在臨床中意義-判別診療對于30歲以前HPV陽性病人，大多是一過性感染，可用TERC探針進行判別診療。

TERC（-）：一過性感染TERC（+）：有癌變風(fēng)險，采取治療辦法對于懷孕期婦女，雌激素可使移行帶區(qū)基底細胞出現(xiàn)不經(jīng)典增生甚至類似原位癌改變，與宮頸原位癌判別困難。但前者在產(chǎn)后能恢復(fù)正常。TERC（-）：雌激素引發(fā)，無需治療，產(chǎn)后自然恢復(fù)正常TERC（+）：高度懷疑原位癌，親密隨診，產(chǎn)后六周進行對應(yīng)治療分子病理學(xué)常用研究方法第82頁TERC在臨床中意義-判別診療CIN1和CIN2病理學(xué)上有時難以區(qū)分，不過對指導(dǎo)臨床治療有主要意義TERC（-）：90%可能為CIN1，按CIN1方案治療TERC（+）：90%可能為CIN2，按CIN2方案治療分子病理學(xué)常用研究方法第83頁TERC指導(dǎo)臨床治療小結(jié)分子病理學(xué)常用研究方法第84頁臨床慣用檢測項目-宮頸癌分子病理學(xué)常用研究方法第85頁三種檢測方法比較方法特異性（％）敏感性（％）形態(tài)學(xué)檢測9055-80HPV檢測64－9584-100FISH9090分子病理學(xué)常用研究方法第86頁TERC基因陽性圖原位癌術(shù)后復(fù)查分子病理學(xué)常用研究方法第87頁TERC基因陰性圖分子病理學(xué)常用研究方法第88頁TERC基因FISH檢測檢測樣本：TCT采集、生理鹽水采集、活檢標本石蠟切片、手術(shù)標本石蠟切片分子病理學(xué)常用研究方法第89頁分子病理學(xué)常用研究方法第90頁FISH檢測TERC基因結(jié)果判讀：標本為新鮮宮頸細胞制片：閾值建立采集20例正常人宮頸細胞。閾值測定：每例分析最少100個細胞，統(tǒng)計出現(xiàn)2個以上TERC信號細胞數(shù)目標百分比。閾值=平均數(shù)（M）+3X標準差（SD）結(jié)果判斷每例樣本隨機計數(shù)細胞（最少100個），假如檢測值大于閾值，判定為陽性結(jié)果；假如檢測值小于閾值，判定為陰性結(jié)果；假如檢測值等于閾值，加大觀察樣本細胞數(shù)目。標本為組織石蠟切片：連續(xù)3個細胞出現(xiàn)2個以上TERC信號，即判為陽性。分子病理學(xué)常用研究方法第91頁FISH檢測Her-2基因擴增分子病理學(xué)常用研究方法第92頁分子病理學(xué)常用研究方法第93頁分子病理學(xué)常用研究方法第94頁分子病理學(xué)常用研究方法第95頁分子病理學(xué)常用研究方法第96頁分子病理學(xué)常用研究方法第97頁Her-2基因擴增模式分子病理學(xué)常用研究方法第98頁Her-2基因擴增模式分子病理學(xué)常用研究方法第99頁分子病理學(xué)常用研究方法第100頁赫賽汀在胃癌中應(yīng)用分子病理學(xué)常用研究方法第101頁分子病理學(xué)常用研究方法第102頁隨訪終點指標分子病理學(xué)常用研究方法第103頁赫賽汀在胃癌中應(yīng)用—小結(jié)分子病理學(xué)常用研究方法第104頁分子病理學(xué)常用研究方法第105頁TOP2A基因分子病理學(xué)常用研究方法第106頁測TOP2A基因意義分子病理學(xué)常用研究方法第107頁分子病理學(xué)常用研究方法第108頁計數(shù)100個細胞，統(tǒng)計Ratio值（紅信號數(shù)/綠信號數(shù)）FISH陽性：1.EGFR基因擴增（1）Ratio≥2為陽性結(jié)果，提醒該樣本有EGFR基因擴增（2）大于等于15個紅色信號細胞數(shù)占細胞總數(shù)10%以上，為陽性結(jié)果，提醒該樣本有EGFR基因擴增（3）出現(xiàn)成團擴增細胞，為陽性結(jié)果，提醒該樣本有EGFR基因擴增2.高多體性

Ratio＜2，但大于等于4個紅色信號細胞占細胞總數(shù)40%以上，為陽性結(jié)果，提醒該樣本為EGFR基因高多體性擴增FISH陰性除以上陽性情況上，其余結(jié)果均為陰性結(jié)果分子病理學(xué)常用研究方法第109頁淋巴瘤診療和治療——對病理醫(yī)生和臨床醫(yī)生挑戰(zhàn)淋巴瘤分類復(fù)雜（年WHO分類）不一樣類型淋巴瘤有著不一樣預(yù)后，需要不一樣治療；即使是相同類型腫瘤，因為攜帶不一樣分子遺傳學(xué)異常，對治療反應(yīng)也可能不一樣;多數(shù)淋巴瘤綜合臨床特征、組織形態(tài)學(xué)、免疫表型特征可得到正確診療;分子遺傳學(xué)檢測能夠提供更多普通病理學(xué)檢驗所不能提供信息。分子病理學(xué)常用研究方法第110頁診療BCDA臨床特征形態(tài)學(xué)免疫表型分子遺傳學(xué)淋巴瘤診療—臨床特征、形態(tài)學(xué)、免疫表型及分子遺傳學(xué)相結(jié)合分子病理學(xué)常用研究方法第111頁淋巴瘤常見染色體易位及所累及基因分子病理學(xué)常用研究方法第112頁FISH檢測淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常慣用探針雙色分離重排探針（DualColorBreakApartRearrangementProbe）雙色雙融合易位探針（DualColor，DualFusionTranslocationProbe）染色體計數(shù)探針（Chromosomeenumerationprobe,CEP）分子病理學(xué)常用研究方法第113頁①切片準備：選擇雜交區(qū)域，脫蠟水化、酶消化、脫水干燥②變性、雜交③洗滌、封片④觀察：熒光顯微鏡。間期FISH方法分子病理學(xué)常用研究方法第114頁間期FISH結(jié)果觀察與解讀分子病理學(xué)常用研究方法第115頁雙色分離重排探針（BCL2）正常分離基因拷貝數(shù)增加分子病理學(xué)常用研究方法第116頁間期FISH結(jié)果觀察與解讀分子病理學(xué)常用研究方法第117頁正常融合基因拷貝數(shù)增加雙色融合易位探針(IGH/BCL2）分子病理學(xué)常用研究方法第118頁間期FISH結(jié)果觀察與解讀分子病理學(xué)常用研究方法第119頁正常染色體數(shù)目增加染色體著絲粒探針（2號染色體，橙色）分子病理學(xué)常用研究方法第120頁有利于診療、分類經(jīng)過特異性遺傳學(xué)異常來確定淋巴瘤類型判定預(yù)后、指導(dǎo)治療

FISH檢測淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常意義分子病理學(xué)常用研究方法第121頁間期FISH在淋巴瘤中應(yīng)用舉例侵襲性成熟B細胞淋巴瘤小細胞性B細胞淋巴瘤

外周T細胞淋巴瘤

B淋巴母細胞性淋巴瘤/白血病分子病理學(xué)常用研究方法第122頁Burkitt淋巴瘤(BL)t(8q24)/IG-cMYC含有介于彌漫大B細胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤之間特征不能分類B細胞淋巴瘤(IntermediateBL/DLBCL)（Double-hit）t(8q24)/nonIG-cMYC（35-50%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（15%）t(3q27)/BCL6-IGH

（少）彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)（Double-hit）

t(8q24)/IG(nonIG)-cMYC（10%）

t(3q27)/BCL6（30%）t(14;18)(q32;q21)/IGH-BCL2

（20-30%）t(3;14)(p14;q32)/FOXP1-IGH（3%）侵襲性成熟B細胞淋巴瘤分子病理學(xué)常用研究方法第123頁利用FISH檢測以上三個類型淋巴瘤分子遺傳學(xué)異常，通常使用以下探針：雙色分離重排探針：IGH、C-MYC、BCL2、BCL6雙色雙融合易位探針：IGH/C-MYC

侵襲性成熟B細胞淋巴瘤分子病理學(xué)常用研究方法第12