TCAOE 75-2024 牡蠣徐氏擬裸莖吸蟲熒光定量PCR檢測方法

ICS65.020.30ICS65.020.30CCSB41CAOET/CAOE75—2024PCR法FluorescencequantitativePCRmethodforthedetectionofGymnophalloidesseoiLeeinoyster2024-02-04發(fā)布 2024-02-04實施中國海洋工程咨詢協(xié)會 發(fā)布T/CAOE75T/CAOE75—2024PAGE\*ROMANPAGE\*ROMANII目 次前 言 II范圍 1規(guī)范性引用文件 1術語和定義 1縮略語 1試劑 1儀器與設備 2樣品 2樣品核酸質量檢測 3實時熒光PCR檢測方法和條件 3結果判定 4安全 4防污染措施 4附錄 5前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則 第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)起草。本文件由魯東大學提出。本文件由中國海洋工程咨詢協(xié)會歸口。本文件起草單位：魯東大學、中國水產(chǎn)科學研究院長島增殖實驗站。本文件主要起草人：王曉通、劉雅瓊、魏磊、蔡忠強、王曉娜、房燕、李明珠。T/CAOE75T/CAOE75—2024PAGEPAGE1牡蠣徐氏擬裸莖吸蟲熒光定量PCR檢測方法范圍本文件規(guī)定了太平洋牡蠣中寄生徐氏擬裸莖吸蟲（GymnophalloidesseoiLee）的實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）PCR樣品、檢測方法和條件、結果處理及結果判定等內容。本文件適用于牡蠣科寄生徐氏擬裸莖吸蟲的檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求SN/T1193基因分析檢測實驗室技術要求SC/T7103術語和定義本文件沒有需要界定的術語和定義。縮略語Cc氧化酶第一亞基（Ctohoecoxdeuuit）DEPC：焦炭酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）Ct值：循環(huán)閾值（Cyclethreshold）（Ribonuclease）EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraaceticacid）PCR：聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction）TAE：Tris、乙酸（Aceticacid）和EDTA組成的緩沖液EB：溴化乙錠（Ethidiumbromide）試劑GB/T6682中規(guī)定的一級水。A.1.1配制。10A.1.2配制，或其它等效產(chǎn)品。氯仿：生化試劑。EB（0μg/L.13RNaseA.2.2配制，或其它等效產(chǎn)品。75%A.2.3配制。PCRSYBRGreenPremixExIIDNA聚合（5/μCRMgl（3ol/L～7ol/LT（dTdTCTdT、SYBR熒光染料等。PCRPrimeScriptEnzymeMixI5×ieciptBue、ligodTie（50μ、Rnom6e（100M、RaeeedH2。引物COI-QF：GGTTGATGTTAAGACTTCGG，-20℃保存。引物保存。陽性對照為已知受徐氏擬裸莖吸蟲感染的牡蠣組織樣品，-80℃保存。陰性對照為已知未受徐氏擬裸莖吸蟲吸蟲感染的牡蠣組織樣品，-80℃保存。DNA分子質量標準溶液：生化試劑。瓊脂糖：生化試劑。2×PremixTaqDNA聚合酶：生化試劑，-20℃保存。儀 與設備CRCR（1℃~5（20pm~p、電泳儀（0V~3、微量移液器（0.1μL~25L，05μL~0μL10μL~10L，20μL~μL100μL~1000μL規(guī)格RNase2mL（A.2.1RNase1.5mL200μLPCR反應管（A.2.1處理，或其它等效產(chǎn)品RNase的微量加樣（1μL10μLA.2.1（最001g（100p、微波爐。樣品樣品選取在牡蠣產(chǎn)地或水產(chǎn)市場售賣牡蠣的攤位，按照SC/T7103規(guī)范執(zhí)行牡蠣樣品的采集。樣品運輸和前處理活體牡蠣樣品應在4℃DEPC100mgRNase2mL凍存管中，液氮冷凍?；蛟谝旱羞\輸。實驗室收到樣品后若暫時不能檢測，應將組織樣品用液氮冷凍后保存于-80℃冰箱中。樣品RNA提取100mg1.5mLRNase1mLTRIzol5min。200μL15sec5min。12000rpm4℃15min1.5mLRNase離心管。（00L10in。12000rpm4℃10min，棄去上清，RNA沉淀在管底。1mL75%乙醇，輕輕顛倒洗滌沉淀，7500g4℃5min，棄去上清。RNA5min～10min。30μL~250μLRNase去離子水溶解沉淀。RNA提取試劑盒。反轉錄反轉錄體系按照表1的要求配置在無RNase的PCR管中。表1 反轉錄反應所需試劑及組成試劑10μL體系試劑終濃度5×PrimeScriptBuffer2μL1×PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL—OligodTPrimer（50μM）0.5μL25pmol/LRandom6mers（100μM）0.5μL25pmol/LRNA500ng—RNaseFreedH2O補至10μL—將裝有反轉錄混合液的PCR管放入PCR5sec；4℃保溫。加入40μL～90μL無菌去離子水獲得稀釋的反轉錄反應液?？刹捎闷渌刃唐坊崔D錄試劑盒。樣品核酸質量檢測PCR反應方法PCR反應體系按照表2的要求配置。表2 PCR反應所需試劑及組成試劑20μL體系試劑終濃度2×PermixTaqDNA聚合酶10μL1×檢測引物COI-qF（10μmol/L）2μL1μmol/L檢測引物COI-qR（10μmol/L）2μL1μmol/L反轉錄反應液2μL滅菌雙蒸水補至20μL—DNA模板以及無菌水加入PCR管中，將PCR管放入PCR儀。按照以下反應程序進行擴增：94℃3min；94℃30sec，57℃30sec，72℃30sec，35個循環(huán)；72℃5保溫。瓊脂糖凝膠電泳檢測方法40mLEB2.5%（A.1.4配制電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。9μLPCR1μL10DNA分子量標準對照。120V30min~40min。將凝膠置于凝膠成像儀下觀察電泳結果。核酸質量判斷在120bp大小位置出現(xiàn)單一條帶，則提取的核酸可用于進一步實驗；若為陰性，則需重新提取RNA。PCR按照表3的要求配置實時熒光PCR反應體系，同時設置陽性對照和陰性對照。表3 實時熒光PCR反應所需試劑及組成試劑20μL體系試劑終濃度SYBRGreenPremixExTaqII10μL1×檢測引物COI-qF（10μmol/L）1μL0.5μmol/L檢測引物COI-qR（10μmol/L）1μL0.5μmol/L反轉錄反應液2μL滅菌雙蒸水補至20μL—PCRPCRPCR℃30sec；95℃5sec，60℃30sec，40個循環(huán)。PCR（SYBR法）試劑盒。結果判定閾值設定閾值設定以閾值線剛好超過陰性樣品擴增的最高點為準。質量控制陰性對照無Ct值或Ct值≥33，且無特異性擴增曲線；陽性對照Ct值＜30，且出現(xiàn)特異性擴增曲線。結果判斷若檢測樣品的Ct值≥33或為None（無值），認為樣品未被吸蟲感染，檢測結果為陰性；若檢測樣品的Ct值＜30，認為樣品被吸蟲感染，檢測結果為陽性；若30≤檢測樣品的CtCt安全實驗室安全防護按GB/T19489中的規(guī)定執(zhí)行。防污染措施檢測過程中防污染措施按照SN/T1193的規(guī)定執(zhí)行。附錄普通溶液的配制緩沖液：0.5mol/L溶液，pH8.0

附 錄 A（規(guī)范性）試劑配方-Na2·H2O 186.1g滅菌去離子水 800mL5mol/L氫氧化鈉溶液 調pH至8.0滅菌去離子水加至1000mL，121℃，15min滅菌備用。電泳緩沖液（50×）配制242g冰乙酸 57.1mL0.5mol/L溶液，pH8.0 100mL滅菌去離子水加至1000mL，121℃，15min滅菌備用用時用滅菌去離子水稀釋至1×使用。10×上樣緩沖液：聚蔗糖 25g滅菌去離子水 100mL溴酚藍 0.1g可采用等效商品化產(chǎn)品。EB（10μg/μL）溴化乙錠 20mg滅菌去離子水 2mL可采用等效商品化產(chǎn)品。0.5μg/mL2.5%瓊脂糖凝膠瓊脂糖 2.5g電泳緩沖液 100mL混合后使用微波爐加熱至完全融化,50℃~55℃EB（10μg/μL）5μL動搖勻，避免產(chǎn)生氣泡，將梳子置于膠槽中，然后倒入融化瓊脂糖溶液，待膠凝后