GB∕T 19180-2020 牛海綿狀腦病診斷技術(shù)

B41中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T19180—2003牛海綿狀腦病診斷技術(shù)2020-12-14發(fā)布2020-12-14實(shí)施國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)Ⅰ本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T19180—2003《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》。本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T19180—2003相比，除編輯性修改外，主要技術(shù)變化如下：—增補(bǔ)了H·E組織病理染色法、免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法的適用范圍，刪除了“也可用于其他動(dòng)物的傳染性海綿狀腦病的診斷”（見第1章—優(yōu)化了臨床癥狀的描述（見4.3);—優(yōu)化了H·E組織病理染色法操作步驟（見5.1)和免疫組織化學(xué)方法操作步驟（見5.2);—增補(bǔ)了免疫印跡方法（見5.3)。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心。Ⅱ神經(jīng)性疾病，對(duì)動(dòng)物和人構(gòu)成較大危害。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為嚴(yán)重影響國(guó)際貿(mào)易的動(dòng)物疫病之一，我國(guó)將其歸為一類動(dòng)物疫病。我國(guó)現(xiàn)行《牛海綿狀腦病診斷技術(shù)》(GB/T19180—2003)系2003年6月4日由原國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布，2003年12月1日起實(shí)施。該標(biāo)準(zhǔn)僅包括臨床癥狀、組織病理學(xué)、免疫組織化學(xué)等三種診斷方法，未包括OIE陸生動(dòng)物手冊(cè)指定的另一種確診方法即免疫印跡。免疫印跡方法比免疫組織化學(xué)方法更靈敏，特異性更好。因此，免疫印跡方法是牛海綿狀腦病診斷技術(shù)中一種更好的確診方法，它能更好地服務(wù)于我國(guó)瘋牛病的監(jiān)測(cè)工作。BSE分為典型BSE和非典型BSE。典型BSE是由于牛采食污染牛羊朊病毒的肉骨粉或者飼料而引起，非典型BSE為自然發(fā)生的一種散發(fā)性BSE。自然條件下，BSE經(jīng)由消化道傳播，未發(fā)現(xiàn)水平和垂下罕見，6歲以上明顯減少。根據(jù)病原的分子量大小，非典型BSE又分為H型和L型。非典型BSE的平均發(fā)病年齡為11歲。BSE病程多為數(shù)月至一年，最終死亡。大多數(shù)BSE病牛無典型臨床癥狀，因此BSE的診斷應(yīng)通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)來實(shí)現(xiàn)。BSE的病原是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)朊蛋白的異構(gòu)體，在病牛血清里檢測(cè)不到BSE朊病毒抗體，所以血清學(xué)檢測(cè)方法對(duì)于BSE來說是無意義的。目前，實(shí)驗(yàn)室診斷方法多以檢測(cè)BSE病原為目的，包括免疫組織化學(xué)方法、免疫印跡方法、ELISA方法等，其中免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法是OIE手冊(cè)規(guī)定的BSE確診方法。BSE病牛的中樞神經(jīng)被朊病毒侵害會(huì)出現(xiàn)海綿狀空泡變性，在中樞神經(jīng)保存良好且未發(fā)生自溶的情況下，應(yīng)用H·E組織病理染色法可以觀察到這些病變情況。OIE手冊(cè)規(guī)定H·E組織病理染色法是確診BSE的輔助方法，在使用免疫組織化學(xué)方法診斷BSE時(shí)應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診；在使用免疫印跡方法診斷BSE時(shí)，如果樣品適合進(jìn)行H·E組織病理染色，那么也應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診。1牛海綿狀腦病診斷技術(shù)本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了BSE診斷的臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室診斷及綜合判定技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于BSE的診斷，其中臨床診斷適用于BSE的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，H·E組織病理染色法適用于BSE中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理診斷，免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法適用于BSE的病原學(xué)診斷。2縮略語下列縮略語適用于本文件。PK酶：蛋白酶K(ProteinaseK)3臨床診斷牛科和貓科動(dòng)物，包括各種牛、各種羊和各種貓科動(dòng)物。表現(xiàn)為不安、恐懼、異常震驚或沉郁；不自主運(yùn)動(dòng)，如磨牙、震顫；不愿經(jīng)過有縫隙的地面或進(jìn)入畜欄等。3.2.2感覺或反應(yīng)過敏表現(xiàn)為視、聽、觸三覺過于敏感。對(duì)光線的明暗變化、外部聲響以及頸部觸摸過度敏感，這是BSE病牛的特征性臨床表現(xiàn)。病牛步態(tài)呈“鵝步”狀，共濟(jì)失調(diào)，四肢伸展過度，有時(shí)倒地，難以站立。3.2.4體重和體況下降病牛的體重和體況下降，表現(xiàn)出異常消瘦，體質(zhì)虛弱。23.3病理變化剖檢無明顯病變。易感動(dòng)物出現(xiàn)上述臨床癥狀，又不能確定為其他疾病時(shí)，可判定為疑似BSE。確診應(yīng)采集易感動(dòng)物的腦組織進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。4實(shí)驗(yàn)室診斷如甲醛、甲酸、二甲苯、氯仿等。通風(fēng)櫥。A4.1.3.8蘇木素染液(H·E染液，見A.2)。4.1.3.91%鹽酸酒精（見A.3)。4.1.3.13無機(jī)試劑原料均為分析純。將牛頭固定，用電鋸從前額兩牛角根部向枕骨大孔背側(cè)緣方向鋸開，使腦部暴露。剪開腦膜并切斷所有與腦部相連的神經(jīng)和血管，取出整腦，包括大腦、小腦和完整腦干。大規(guī)模監(jiān)測(cè)采樣時(shí)，可用專用采樣勺（國(guó)家牛海綿狀腦病參考實(shí)驗(yàn)室提供）從枕骨大孔處取出延腦部組織即可。采樣勺取樣時(shí)，先上下左右四個(gè)方向剪開腦硬膜，再用戴一次性乳膠手套的手指繞延腦轉(zhuǎn)一轉(zhuǎn)以切斷腦神經(jīng)和血管，然后緊貼右切斷腦組織，最后將切下的腦組織往外摳出。3再固定48h。適當(dāng)修剪這七塊用于檢測(cè)的組織邊角以適用脫水筐大小，剩余組織繼續(xù)固定以備用。用脫水筐裝好檢測(cè)用的組織塊，并用鉛筆做好標(biāo)記，蓋好脫水處理3h。24h。將裝有組織塊的脫水筐放入染色缸中，依次在以下梯度酒精中分別脫水：a)75%酒精浸泡2h。b)85%酒精浸泡2h。c)硬蠟浸泡1h。4.1.6.7.1若包埋模具為金屬條結(jié)構(gòu)的，則先組裝好包埋模具，放置在光滑平整的金屬臺(tái)面上，再將熔化的新硬蠟倒入包埋模具里，直至倒?jié)M，然后將浸好蠟的組織塊放入其中（待切片的一面朝下，并放平4切成形，獲得平整的石蠟組織塊，然后給每個(gè)組織塊貼上標(biāo)簽。4.1.6.7.2如果包埋模具為凹型的用于單個(gè)組織包埋的模具（常見包埋機(jī)所用模具則先將模具加熱片的一面朝下，并放平整用去除蓋子的脫水筐（尺寸與包埋模具匹配）放于其上，最后將整個(gè)包埋模具（包括組織等）平移至冷臺(tái)上。待冷卻好后，將脫水筐從包埋模具中取出，獲得平整的石蠟組織塊，然后給每個(gè)組織塊貼上標(biāo)簽。應(yīng)焚燒處理。組織薄片用干凈的粘附劑預(yù)處理過的載玻片貼片（組織應(yīng)貼在磨砂面／標(biāo)記面的同側(cè)，以便給玻片做標(biāo)記然后用鉛筆在載玻片上做好標(biāo)記。h)75%酒精2min。i)自來水洗2min。·E染色5用干凈玻璃棒取一滴中性樹膠，滴加在玻片的組織上，再用干凈的蓋玻片進(jìn)行封片，放置在平整的臺(tái)面上使其自然干燥。4.1.7.5.2陽性結(jié)果?；屹|(zhì)區(qū)出現(xiàn)空泡變性，特別是神經(jīng)纖維網(wǎng)漿和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)有規(guī)則的圓形或卵圓形空泡，空泡內(nèi)不著色或被伊紅淡染，界限明顯，胞核被擠壓于一側(cè)，甚至消失；有的神經(jīng)細(xì)胞被單個(gè)或多個(gè)特異性空泡脹大，成為“氣球樣”空泡性神經(jīng)細(xì)胞。容易出現(xiàn)空泡病變的部位是中腦和延髓的核群，且呈雙側(cè)對(duì)稱性分布。4.1.7.5.3陰性結(jié)果。灰質(zhì)區(qū)無特征性空泡變性。動(dòng)眼神經(jīng)核和紅核處的核周質(zhì)也可能有少量空泡出現(xiàn)，但不呈雙側(cè)對(duì)稱，應(yīng)注意區(qū)別。若在腦干灰質(zhì)區(qū)未發(fā)現(xiàn)雙側(cè)對(duì)稱性海綿狀空泡病變，則用免疫組織化學(xué)方法做進(jìn)一步診斷。組織病理學(xué)診斷只是瘋牛病確診的輔助方法，確診時(shí)應(yīng)結(jié)合免疫組織化學(xué)或免疫印跡診斷方法。4.2免疫組織化學(xué)方法4.2.1實(shí)驗(yàn)室生物安全要求4.2.3.8蛋白酶K緩沖液（見附錄B中B.1)。的試劑）。6的試劑，但不得使用反芻動(dòng)物源性血清）。4.2.3.15水溶性封片劑（商品化產(chǎn)品）。4.2.3.16二步法免疫組織化學(xué)顯色試劑盒（商品化產(chǎn)品，其中二抗應(yīng)為抗鼠二抗）。4.2.3.18無機(jī)試劑原料均為分析純。4.2.6組織切片制作4.2.7免疫組織化學(xué)操作步驟4.2.7.1設(shè)置對(duì)照。免疫組織化學(xué)診斷應(yīng)設(shè)置瘋牛病陽性和陰性對(duì)照組織切片。4.2.7.2脫蠟和脫二甲苯。取烘烤好的玻片和對(duì)照切片整齊放入染色架上，依次在以下試劑中脫蠟和脫二甲苯：h)75%酒精2min。i)自來水洗2min。PBS5min×3PBS待用。4.2.7.4在最后一次PBS漂洗時(shí)，配制好蛋白酶K工作液。PBS洗完后，立即將玻片放入裝有蛋白酶煮沸的蒸餾水，并配制好高壓緩沖液。4.2.7.5將高壓緩沖液倒入陶瓷鍋，并立即將玻片放入其中，確保玻片完全浸入水中，蓋好盒蓋，在PBS5min×33%3%PBS5min×35min制好。7冷凍的一抗進(jìn)行化凍，并配制好工作液。4.2.7.10棄去正常豬血清，用吸水紙吸干組織四周的液體。作用過夜。至室溫狀態(tài)。4.2.7.13洗完后用吸水紙吸干組織四周的液體，然后在組織上滴滿顯色試劑盒中的標(biāo)記聚合物-HRP4.2.7.14在PBS中洗5min4.2.7.15洗完后用吸水紙吸干組織四周的液體，然后在組織上滴滿試劑盒中的底物顯色液，確保組織4.2.7.19用水溶性封片劑封片。顯微鏡下觀察組織玻片，進(jìn)行結(jié)果判定。4.2.8.2陽性結(jié)果：腦組織灰質(zhì)區(qū)特別是腦閂部的迷走神經(jīng)背核、孤束核和三叉神經(jīng)脊束核等處出現(xiàn)特異性顆粒狀染色，則判定為瘋牛病陽性。4.2.8.3陰性結(jié)果：腦組織灰質(zhì)區(qū)未見特異性顆粒狀染色，則判定為瘋牛病陰性。4.3免疫印跡方法4.3.1實(shí)驗(yàn)室生物安全要求,但組織勻漿、消化及變性時(shí)需在負(fù)壓罩下操作。84.3.3.13PVDF膜。4.3.3.17化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒（商品化產(chǎn)品）。4.3.3.20無機(jī)試劑原料均為分析純。然后將上清移至另一離心管中。水解反應(yīng)。5min。4.3.5.4.1將預(yù)制膠安放好，在電泳槽內(nèi)槽加滿電泳緩沖液的工作液（不要溢出外槽加至浸沒過膠底預(yù)冷。4.3.5.5.1電泳完后，取出預(yù)制膠。用專用鏟刀從四周撬開預(yù)制膠外殼，切掉膠的加樣齒孔及膠底部染9液線以下部分。在膠上倒一點(diǎn)轉(zhuǎn)印緩沖液，使膠保持濕潤(rùn)。然后按照膠的大小，剪好PVDF膜及4張PVDFPVDF100%4.3.5.5.2在玻璃板上先放置兩層對(duì)齊的濾紙，用玻璃棒沿一個(gè)方向輕趕氣泡，用鏟刀將膠取出放于濾紙上，并與濾紙對(duì)齊。夾取另兩張濾紙，滴一些轉(zhuǎn)印液在膠上，并使膠全部浸濕，然后將浸好的膜從一端慢慢往另一端放下，直至完全覆蓋在膠上。如果發(fā)現(xiàn)膜與膠之間有白點(diǎn)，說明它們之間存在氣泡，則用玻璃棒滾動(dòng)將其驅(qū)趕。如果氣泡太多，則取下膜，在轉(zhuǎn)印液中再次浸濕，重新放置于膠上。如此反復(fù)，直至沒有氣泡。然后，將取出另兩層濾紙整齊放于膜上，用玻璃棒驅(qū)趕氣泡?！叭髦巍弊龊煤?，用鏟刀將其轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)印槽中，注意膜的一端朝向正極。往“三明治”上倒入少量轉(zhuǎn)印緩沖液，再用玻璃棒輕趕氣泡。15VTBST搖洗3次，每次5min。TBST搖洗6次，每次5min。5mL按照5倍于膜的大小剪一塊保鮮膜，并將其展平放于桌上。底物作用完后，將膜取出。再將膜平放在保鮮膜中間位置，拿起保鮮膜的一邊，沿PVDF膜的一邊折起，覆蓋在PVDF膜上，再將周邊的保鮮條帶太淺，則需要增加曝光時(shí)間；相反，則應(yīng)減少曝光時(shí)間，直至效果最佳。注意，每次都要以圖片格式保存好照片，以便判定結(jié)果。4.3.6.1在陽性對(duì)照和陰性對(duì)照均成立的條件下，才可判定其余樣品的結(jié)果。Marker4.3.6.3陰性結(jié)果：曝光照片上的樣品泳道沒有特異性黑色條帶，或者有個(gè)別雜條帶，但對(duì)比膠上的蛋5綜合判定5.1臨床無明顯特征性癥狀或判定為疑似的易感動(dòng)物，經(jīng)4.2（免疫組織化學(xué)方法）或者4.3（免疫印跡方法）檢測(cè)出牛海綿狀腦病病原，則可判定為感染牛海綿狀腦病。5.2免疫組織化學(xué)方法診斷BSE時(shí)應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診。5.3免疫印跡方法診斷BSE時(shí)，如果樣品適合進(jìn)行H·E組織病理染色，那么也應(yīng)同時(shí)使用H·E組織病理染色法予以輔助確診。附錄A（規(guī)范性附錄）H·E組織病理染色法試劑配制A氯化鈉蒸餾水甲醛把以上材料混勻溶解即可使用。A.2蘇木素染色液蘇木精無水乙醇蒸餾水200mL氧化汞冰乙酸8mL鉀明礬先將蘇木精溶于無水乙醇，然后將鉀明礬和蒸餾水煮沸溶化，去火并迅速加入蘇木精無水乙醇溶液中，立即加入氧化汞并煮沸，迅速冷卻后加入冰乙酸，過濾后使用。A.31%鹽酸酒精在100mL的70%或80%酒精中加入1mL的濃鹽酸。A.4飽和碳酸鋰水溶液A.595%酒精伊紅溶液附錄B（規(guī)范性附錄）免疫組織化學(xué)方法試劑配制B.1蛋白酶K緩沖液25mL氯化鈣(0.1mol/L)mL加蒸餾水至mLB.2蛋白酶K工作液B.3高壓緩沖液0.1mol/L檸檬酸鈉123mL0.1mol/L檸檬酸27mL3%5甲醇雙氧水(30%)氯化鈉氯化鉀磷酸氫二鈉磷酸二氫鉀0.2g5%正常豬血清4mLB.7一抗工作液附錄C（規(guī)范性附錄）免疫印跡方法試劑配制勻漿緩沖液氯化鈉TritonX-100脫氧膽酸鈉乙二胺四乙酸 C.2蛋白酶K溶液C35mmol/L。配好后應(yīng)分裝保存在-20℃。或者用市場(chǎng)上其他的PK酶阻止液，按照說明書配制使用即可。C.45×上樣緩沖液10mL的配方：50%甘油5mL10%SDS2mL2-巰基乙醇