(高清版)GBT 38481-2020 微生物超低頻突變測定 雙重測序法

ICS07.080微生物超低頻突變測定雙重測序法國家市場監(jiān)督管理總局國家標準化管理委員會IGB/T38481—2020本標準按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國標準化研究院提出并歸口。1GB/T38481—2020微生物超低頻突變測定雙重測序法本標準規(guī)定了用雙重測序法測定微生物超低頻突變的方法。本標準適用于微生物基因組或基因片段超低頻突變的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3.1化學、物理或生物因素導致微生物DNA發(fā)生的頻率低于1×10-?的永久性改變。3.2條形碼標簽barcodelabel接在待測DNA片段兩側的核苷酸片段，用以標示同一擴增家族的DNA,協(xié)助進行突變位點的確認。3.3所有含兩端互補條形碼標簽的DNA片段。3.44原理在待測DNA片段兩端接上一段12nt隨機且互補的雙鏈核苷酸條形碼標簽，然后對所有帶有條形碼標簽的序列進行雙重的高通量測序。利用12nt隨機互補標簽，排除掉測序文庫制備過程中所引入5試劑5.2接頭鏈標簽序列：2a)5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3';N為A、T、C或G,由12個隨機堿基組成標簽片段。將寡核苷酸溶解于Tris-EDTA緩沖液(5.8)或純水中至終濃度100μmol/L,并放置于-20℃a)5'-AATGATACGGCGACCACCGAG-3';b)5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC-3'。X為按樣品需求設計的文庫標記序列。將寡核苷酸溶解于Tris-EDTA緩沖液(5.8)或純水中至終濃度20pμmol/L,并放置于-20℃保存。6儀器設備及器具7.1DNA提取利用微生物基因組或質粒提取試劑盒對待測樣本進行基因組或質粒DNA提取操作，最后使用利用高通量基因測序建庫試劑盒，將待測樣品DNA片段化至100bp～1000bp,將末端修復為A尾。8接頭條形碼標簽的合成將濃度100μmol/L的兩個接頭鏈寡核苷酸片段各取100pL進行退火，在95℃下加熱5min后，8.2延伸將8.1中得到的產物按試劑說明與脫氧核糖核苷三磷酸混合物(dNTPs)和克列諾酶混合均勻，分裝至兩個0.2mL的PCR管中并在37℃下孵育1h。GB/T38481—2020使用無水乙醇沉淀DNA,并加入200μL純水溶解。8.4酶切用限制性內切酶HpyCH4Ⅲ對DNA產物進行酶切。將混合物分裝至4個0.2mL的PCR管中，并在37℃孵育16h。8.5純化加入并均勻混合50μL的3mol/L乙酸鈉溶液(pH5.2),最終體積為550μL。將混合溶液平分到1.5mL的具塞離心管內，每管275μL,并加入625μL室溫的無水乙醇到各管中。充分混勻，并以大于10000r/min的轉速在4℃下離心30min。移除上清液后，加入1mL的75%(體積分數(shù))乙醇至各管中。充分混勻，并立即以大于10000r/min的轉速在4℃下離心30min。移除上清液后，在紙巾上倒置試管10min以干燥，接著正置5min。加入100μL的Tris-EDTA緩沖液至上一步驟產物中并混合均勻。將所有試管集在一起，最終體9接頭條形碼標簽與待測樣本DNA的連接和擴增將互補條形碼標簽與DNA片段化和末端修復產物按總濃度20:1混合后，利用T4DNA連接酶9.2分選利用DNA分選磁珠試劑盒分選得到的產物，獲得長度為200bp～900bp的DNA片段，并以DNA試劑盒定量DNA濃度。9.3PCR擴增以分選產物為模板，接頭鏈擴增引物序列為引物，按每20萬讀數(shù)數(shù)據(jù)量取1amolDNA樣量進行PCR擴增，擴增程序根據(jù)所選用高保真DNA聚合酶的要求設定。10高通量測序利用高通量測序試劑盒對擴增得到的PCR產物進行高通量測序，每個待測樣品測序堿基數(shù)量設置為大于或等于10Gb。對高通量測序數(shù)據(jù)進行清理，然后按下列程序進行數(shù)據(jù)分析：a)根據(jù)隨機標簽進行互補標簽分類，每一個家族需包含雙向互補序列。互補標簽家族大小分布在排除1之后，最大峰值分布應于6～12之間。b)雙鏈同源序列在同一位點識別出突變才視為真正的突變位點。GB/T38481—202012