出口動(dòng)物飼料中己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚的檢測(cè)方法

出口動(dòng)物飼料中己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚的檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了動(dòng)物飼料中人工合成激素己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚的檢測(cè)方法本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物伺料中己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚的檢測(cè)。下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T20195動(dòng)物飼料試樣的制備第一法氣相色譜-質(zhì)譜法3方法提要?jiǎng)游镲暳现屑和榇品?、己烯雌酚、雙烯雌酚經(jīng)乙酸銨緩沖溶液均質(zhì)后，用乙醚提取，提取液經(jīng)固相萃取柱凈化、洗脫、液縮、行生化后，由氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)的選擇離子模式測(cè)定，外標(biāo)4.3氫氧化鈉4.5冰乙酸。4.7乙醇，色譜級(jí)4.9叔丁基甲醚，色譜級(jí)。4.111.0molL氫氧化鈉溶液：稱取40.0g氫氧化鈉(43),用水溶解并定容至1L4.120.1molL氫氧化鈉甲醇溶液：稱取4.0g氫氧化鈉(43),用甲醇(4.1)溶解并定容至1L4.130.2moVL乙酸銨緩沖溶液(pH5.2±pH0.2):稱取15.4g乙酸銨(4.4)溶解于900mL水中，用冰乙酸(4.5)調(diào)節(jié)pH值至5.2±0.2,用水定容至1L。4.14淋洗液：量取70mL0.1mol/L氫氧化鈉甲酶溶液(4.12)和30mL水，充分混合。4.15洗脫液：量取90mL叔丁基甲醚(4.9)加10mL甲醇(4.1)配成混合溶液，再加2mL甲酸(4.8),充分混合4.16衍生化溶液：N-O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺(BSTFA)+三甲基氧硅烷(TMCS)(99+1)。在避光、防潮環(huán)境下冷凍儲(chǔ)藏4.17己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品；純度大于等于98燒，CAS號(hào)為84-16-2,分子式為C?H?O?,相對(duì)分子質(zhì)量為4.18己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于等于99%,CAS號(hào)為56-53-1,分子式為CH?O?,相對(duì)分子質(zhì)量為4.19雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于等于98%,CAS號(hào)為84-17-3,分子式為C?H?O?,相對(duì)分子質(zhì)量為4.20標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1.0mg/mL):分別精確稱取25.0mg己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(4.17)、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(4.18)、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(4.19)于25mL容量瓶中。用乙醇(4.7)定容。配成1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冰箱內(nèi)避光保存，有效期為1年。根據(jù)需要再用乙醇將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。4.21固相萃取柱：苯乙烯-二乙烯苯共聚物基質(zhì)的混合型陰離子交換柱(MAX.60mg。3mL),或者相當(dāng)者，使用前依次用5mL甲醇(4.1)、5mL水淋洗，流速2mLmin5儀器和設(shè)備5.1氣相色譜-質(zhì)譜儀：四極桿質(zhì)譜儀，配有E源并具有選擇離子功能。5.2電子分析天平：感量00001g、001g。5.3離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為5000-min。5.4螺旋蓋聚丙烯離心管：15ml、50ml5.6氮吹濃縮儀。5.7恒溫箱。5.8固相萃取裝置。5.10移液器：10μL~100μL,100μL~1000pL,1mL~5mL。5.11高速振蕩機(jī)。6.2按照GB/T20195的規(guī)定制備試樣。在制樣的操作過程中，應(yīng)防止樣品污染或發(fā)生含量的變化。7測(cè)定步驟稱取50g(精確至0.01g)動(dòng)物飼料于50mL具塞塑料離心管中，加入10mL0.2moVL的乙酸銨緩沖溶液(4.13),均質(zhì)1min。加入10mL乙醚(4.2),振蕩提取3min,于3500r/min離心5min,吸取乙醚層于另一試管中。重復(fù)乙醚提取一次，合并的乙醚相在常溫下用氮?dú)獯蹈?。加?mL三氯3甲烷(4.6)溶解殘余物。旋渦振蕩1min,加入5mL1.0mol/L氫氧化鈉溶液(4.11)。振蕩1min,于1500r/min離心3min,上層水相移人另一試管中。重復(fù)氫氧化鈉溶液提取一次，合并氫氧化鈉溶液合并的氫氧化鈉溶液過固相萃取柱(4.21),流速2mL/min,依次用5mL1.0mol/L氫氧化鈉溶液(4.11)和5mL0.1molL氫氧化鈉甲醇溶液+水溶液(4.14)淋洗固相萃取柱，待溶液流過固相萃取柱后，在65kPa的負(fù)壓下，減壓抽干。加人5mL叔丁基甲醚+甲醇溶液(4.15)洗脫，控制流速在低于40℃下，用緩和缸氣流將洗脫液吹至約1mL,移人反應(yīng)瓶中。加入0.5mL叔丁基甲醚+甲醉溶液(4.15)洗滌一次。并人反應(yīng)瓶中。在40℃下用氮?dú)獯蹈?，加?00pLN-O-雙-(三甲基硅基)三氟乙酰胺+三甲基氧硅烷析生化溶液(4.16),加蓋密閉后于旋渦混合器上混勻。在70℃的烘箱中加熱1h。放置冷卻后開蓋用氮?dú)獯胃啥嘤嗟娜軇＜尤?.2mL異辛烷(4.10)溶解殘?jiān)?，?.4.1氣相色譜條件氣相色譜條件如下：a)色譜柱：彈性石英毛細(xì)管柱，HP-5MS30mx0.25mm(內(nèi)徑),膜厚0.25μm或相當(dāng)者b)載氣：高純氮(純度99999%),流量：1.0ml/mm230℃(保持2min)。再以30℃/min升溫至300℃(保特1min)。d)進(jìn)樣口溫度：250℃。e)接口溫度：280℃。f)進(jìn)樣模式：無分流方式，0.75min打開分流閥。7.4.2質(zhì)譜條件質(zhì)譜條件如下：a)離子源溫度：250℃;四極桿溫度：100cc)EM電壓：高于調(diào)諧電壓200V。d)溶劑延遲時(shí)間：12min?！和榇品樱?07,179,191,399?！合┐品樱?12,383,397,413?！p烯雌酚；410,381,395.411。7.4.3定量測(cè)定根據(jù)樣液中被測(cè)己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚含量情況，選定峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。其響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)的線性范圍內(nèi)。以單點(diǎn)或多點(diǎn)外標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣液應(yīng)等體積參插進(jìn)樣測(cè)定。 第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法動(dòng)物飼料中己烷雌酚、已烯雌酚、雙烯雌酚經(jīng)乙酸銨緩沖溶液均質(zhì)后，用乙醚提取，提取液經(jīng)固相萃取柱凈化、洗脫、濃縮后，由液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(LC-MS/MS)測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。除另有說明外，所有試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水12.5已烯雌酚-48標(biāo)準(zhǔn)品：純度大于等于98%,CAS號(hào)為91318-10-4,分子式為C?H?D.O?,相對(duì)分12.6標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.1mg/mL):分別精確稱取1.0mg己烷雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(4.17)、己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(4.18)、雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品(4.19)標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇(4.1)定容，配成0.1mglmL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冰箱內(nèi)避光保存，有效期為1年。12.7內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(0.1mglmL):精確稱取1.0mg己烯雌酚-18標(biāo)準(zhǔn)品(12.5)于10mL容量瓶中，用甲12.8混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(100ngmL):分別精確移取10μL己烷雌酚、己烯雌酚和雙烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(12.6)混合于10mL容量瓶中，用甲醇(4.1)定容，配成100ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于4℃冰箱內(nèi)避光保存。有效期為6個(gè)月。12.9內(nèi)標(biāo)中間液(200ng/mL):精確移取20L內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液(12.7)于10mL容量瓶中，用甲醇(4.1)定容，配成200ng/mL的內(nèi)標(biāo)中間液，于4℃冰箱內(nèi)12.10乙腈-水溶液(50450.體積比):量取乙腈(12.1)50mL和水50mL,混合均勻12.11乙腈飽和的正己烷溶液：量取正己烷(12.2)200mL于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈(12.1),刷烈振搖數(shù)分鐘，靜止分層后棄下層乙腈層即得12.12混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：根據(jù)需要用乙腈-水溶液(12.10)將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液(12.8)配制適當(dāng)濃度為0ngmL、25ngmL、5ngmL、10ng/132電子分析天平：感量00001g、0.01g。13.3離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速為15000yhmin。13.7固相萃取裝置13.9移液器：10μL~100μL,10613.10高速速振蕩機(jī)。13.11連蓋聚丙烯離心管：2mL。14.1按照GB/T14699.1的規(guī)定采樣。14.2按照GB/T20195的規(guī)定制備試樣，在制樣的操作過程中，應(yīng)防止樣品污染或發(fā)生含量的變化。稱取5.0g(精確至0.01g)動(dòng)物飼料于50mL具塞塑料離心管中，準(zhǔn)確加入25μL內(nèi)標(biāo)中間液(12.9)和10mL0.2mol/L的乙酸飲緩沖溶液(4-3),渦旋30s。加人10mL乙醚(4.2),渦旋30s,加入5.0g無水氧化鈉(123)。渦旋30s,振蕩提取5于4500rhmim離心5min,吸取乙醚層于另一試管中。乙醚重復(fù)提取一次，合井的乙湖相在常溫下用氮?dú)獯抵两?。加?mL三氯甲烷(4.6)溶解殘余物，渦旋1min,加入5mL10mol/L氫氧化鈉溶液(4.11),渦旋Imin,于4500r/min離心3min,上層水相移入另一試管中，氮氧化鈉溶液重復(fù)提取次。合并氫氧化鈉溶液提取液。合并的氫氧化納提取液過固相萃取柱(4.21)。流速2ml/min依次用5mL1.0mol/L氫氧化鈉溶液(4.11)和5mL0.1mol/L氫氧化鈉甲醇+水溶液(4.14)淋洗固相萃取柱，待溶液流過固相萃取柱后，在65kPa的負(fù)壓下，減壓抽干。加入5mL叔丁基甲醚+甲醇溶液(4.15)洗脫，控制流速在2mL/min.收集洗脫液。低于40℃下。用級(jí)和氮?dú)饬鲗⑾疵撘捍抵两伞＜尤?mL乙腈-水溶液(12.10)溶解殘?jiān)?，加?mL乙腈飽和正己烷溶液(12.11),渦旋混勻30s,轉(zhuǎn)移至2mL連蓋塑料離心管中，于4℃15000bhmin離心3min,將下層溶液過022μm濾膜(1213)。濾液供液相-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)15.3.1液相色譜條件液相色譜條件如下：b)流動(dòng)相：A,含0.25%氨水的水溶液；B,乙腈溶液c)流速：0.30mL/min。d)柱溫：35℃。e)進(jìn)樣量：10μL。f)梯度洗脫程序見表1。表1梯度洗脫程序7表1(續(xù))X——試樣中己烷雌酚、已烯雌酚、雙烯雌酚的含量，單位為微克每千克(μg/kg);c——己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚響應(yīng)值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算得到的濃度，單位為微克每升 樣品定容體積，單位為豪升(mL)m——樣品稱樣量，單位為克(g);1000/1000——換算系數(shù)。18定量限和回收率18.1定量限本方法的定量限如下：己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚均為1.0pg/kg。動(dòng)物飼料中己烷雌酚、已烯雌酚、雙學(xué)唯酚添加濃度及其回收率數(shù)據(jù)參見附錄F表F.1。(資料性附錄)選擇離子色譜圖選擇離子色譜圖見圖A.I。24(資料性附錄)選擇離子監(jiān)測(cè)程序表表C.1選擇離子監(jiān)測(cè)程序表目標(biāo)化合物(資料性附錄)API6500型質(zhì)譜/質(zhì)譜儀參考質(zhì)譜條件1參考質(zhì)譜條件a)離子源：電噴霧離子源，負(fù)離子模式；b)檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);f)輔助氣流速度(GS2):0.414MPa;i)其他質(zhì)譜參數(shù)見表D.1。表D.1激素藥物及其內(nèi)標(biāo)物的主要參考質(zhì)譜參數(shù)而而……m,1(資料性附錄)添加回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)表F.1己烷雌酚、己烯雌酚、雙烯雌酚含量測(cè)定的添加回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)回收率范圍%75.5~99.DeterminationofhexestrSetaMAXcartridgo(4.21)omasolid-phaseextractionapparatus.Conditionmethanoland5mLwaterat2mL/min.Loadthesodiumhydrosideestractintocartridgewith5mLofImolLsodiumhydroxidesolution(4.11)andthen5mLof0.1mol/Lsodiuminmethamol-water(4.14).Pungethecantridgebyairtoremovenesidualrinsingsoluwith5mLoffommieacidint-methylbutylether-methanol(4.15)at2ml/min.CollettheelateEvaporatetheelutetonearlydgnsst40Tummdleragratlestreamofnitrogen,theintoaderivatizationvialandevaporatetodrynessat40℃.Addtemperature,coverthecapandeafonitethesnhtinydpynessundernatrm200pLofisooclane(4.10)forthedeterminationbySCAMs.7.4.1GCoperatinga)ColummeHP-5MS,30m×0.25mm(i.d)×0.25μm(filmthickness),orb)Cariergas:Helium,purity99.999%,Colummttohitetmtmm.e)Colunnlemperalurepngramme:150℃to230℃,holdfor2min,rypatd)Injpectiontemperatf)Injectormode:Splidless.pungapr0.75mig)Injectionwolume:1pa)Ionsouretemperature:250cdopoleb)lonizationmodeElectoc)Electricity:Overthetuningelertricity,200d)Solventdelay:1——hexestml:207,179,191,399.——diethylstilbestrol:412,383,397,41—dienestrol:410,381,395.4117.4.3QuantitationdetAcecordinglotheapproximateeoncentrationofhexestml,diethylstilbestrolanddienestsolutiom,seletthestandandworkingaolutionwithsimilarpeakameatothofboththestandandworkingsolutionsandsamplesolutionsshouldbeinthelinearrdeteetion.Thestandarndworkingsolutionshouldberandomlyinjecledinbetweentheinjeetion—5pg/kg,thereroweryis91.8%—15pg/kg,therecoveryis90.3%Fortifyingconcentationofdienestrolanditscomespo μg/kg,thereeoveryis79——5pg/kg,therecoveryis91.5%—15pg/kg,thereoweryHesestrol,diethylstilhestrolanddienestrolinsamplearehomogenisedwithammoniumthenestractedwithdiethylether.Theestactiscleanslapoasolid-phiseestractioncacompoundsaredetenminedhyLC-MS/MSandnuantifiedbyinternodstandandUnlesothensisespecified,allreagentsshouldbeofanalyticalgrale,“Water”isthe12.1Acelonitrile,HPL12.4Ammoniumhydmxi12.5Diethylstilbestrol-d8:panY8-cASNo.91318-10-4.stmcturalformula:C?H?D?O.molecularweight:27640.12.6Stockstandandsolution(0.1mg/mL):Weight1.0mghexesdienestrol(4.19),dissolveinmethanolandconstantwolunein10ml.volumetriefloskbyconcentationof0.1mghmLThestocksandanlsolutionstore12.7Intemalstockstandardsolution(0.1mg/mL):Weight1.0mgmethanolandconstantyolumein10mLvwolumetrieflaskbymethanol(4.1)iofinstockstandandsolationstoreinnfigratedat-18℃in12.8Mixadslandandsolutions(100ng/mL):Renove10μLsiflaskdilateandcomstantyolumebymethanoltofinalconcentationof100ng/nfigratodat4℃inbown12.9Workingintemalstandandsolatioms(200ng/mL):Hemove20pLintenalsin10mLwlumeticelakdilteandconstantwolumehymcthanoltofinalconrentatsohutionstoreinrefigernatedat4℃inbomnbotlefor12.10Acetonitile-watersohution(50+50,wh):Remove50mLocetonitle(12.1)and5012.11Acetonitrile-siturated-hesxanesohtion:Hemowe200mLhexane(12.2)in250mLseparatoracctonitile(12.1),osrillatedfewminutes,12.12Calibeationcureslandandworkingsolution:Thesolutionswere(12.10).ThecanwentationisOnghmL,2.5ng/mL,5ng/mL,10nghmL,50ng/mL,containint12.13Milijoreflicer:0.22jμm.13.1Highpeformancehiquidchomatography-tandemquadnipolemussspectrometryorequivalent:13.2Analyticalbalancessensitisity:0.0001gan13.4Polypopylenecentrfuge13.6Nitmgngiahosiogo13.9Ppele10μL～113.11Polypopylenecntifugt14.2PreparationofletsamplesacondingioGB/T20195.InthecourseofsamplingaprecationshouldbetakentoawoidontaminationoranyfactorthatmaycausesthechangeAcecuratelyweigh5.0g(accurateto0.01g)amimalfeadintoa50mLcentifuggtubadd25μLintemalstandanlworkingsolution(12.9)and10mL0.2molLVortexfor30s,thenadd10mLdethylether(4.2),yortexfor30s,adwortexfor30s,andoscillte5minadooatrifongofot5minlayerintoanothercleantube.Repeatestnuctiononce.Combinetheundernitogen.Dissolvetheresiduewith2mLchlomfhydosidesolution(4.11),votexfImiaiadeeatrifyofor3minat4500r/min.Transfertheupplayertoanothercleantube.RepeatestrictiononcgandcombinetheextractofsodiumSetacartridgonasolid-phaeestruetionapantus(4.21).Condionthand5mLwaterat2ml/min.Loadthesodiumhydroxideextractimtothe5mLof1mol/Lsondiumhydroxidesolatian(4.11)andthen5mLof0.1nolVLsodiumhydmwater(4.14).Purgethecartridpebyairtoremovenesiduulnnsingsolution.Elatethecartridgewithformicacidint-methylbutylether-methunl(4.15)ay2mL/min.Calettheeluteintoanothercleanvaporatetodrynessundernitogen.DisolethensiduewithImLaatomirile-1mLscetonitrle-saturated-heaneslution(12.11),vortesfor30sThansferthetubewithscnewcapandcentrfugefor3minat1500tmir(4t).Th0.22pμmfilm(12.13)anddetema)ColummCgchmmatographycohopmpaticlsdiamer,150mm×2.1mm(id),orequivaleb)MobilephaeseA,Water,contaim0.25%amaonia,B.Acetonitrilec)Fowrnate0.3mLd)Columntempernture)Injectianwolume:10f)GadientehutionprocedureTable